Hà Thị Ngọc Ánh: Sàng lọc hợp chất lá Bình Bát kháng S. aureus, ức chế NO

Nghiên cứu sàng lọc hợp chất lá bình bát (Annona glabra) có tác dụng kháng tụ cầu vàng (S. aureus) và ức chế sản sinh nitric oxid (kháng viêm).

• Tác giả: Ha Thi Ngoc Anh
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyen Thanh Tung
• Trường học: Dai hoc Duoc Ha Noi
• Chuyên ngành: Hoa Duoc
• Đề tài: Sàng lọc các hợp chất có tác dụng kháng S. aureus và ức chế sản sinh Nitric Oxid từ lá Bình bát (Annona glabra L.) sử dụng Docking phân tử
• Loại tài liệu: Khoa luan tot nghiep
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Ha Noi

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Bình bát và các hợp chất hoạt tính

Cây Bình bát (Annona glabra L.) là một loài thực vật có giá trị y học truyền thống được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều bệnh lý. Nghiên cứu khoa học hiện đại đã xác định rằng lá bình bát chứa nhiều hợp chất hoạt tính bao gồm alkaloid, diterpen và steroid. Những hợp chất này thể hiện các tác dụng sinh học đa dạng, đặc biệt là khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus và ức chế sản sinh Nitric oxid. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp docking phân tử đã chứng minh hiệu quả của các thành phần này trong việc ức chế các đích protein quan trọng, mở ra những triển vọng ứng dụng trong phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật của Bình bát

Bình bát (Annona glabra L.) thuộc họ Annonaceae, là cây thân gỗ phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới. Thực vật này có những đặc điểm hình thái đặc trưng với lá xanh, hoa màu vàng nhạt và quả tròn. Các bộ phận của cây, đặc biệt là lá bình bát, được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa trị viêm nhiễm, bỏng và các bệnh do vi khuẩn gây ra.

1.2. Các loại hợp chất chính trong lá Bình bát

Lá bình bát chứa ba nhóm hợp chất chính: alkaloid, diterpen loại ent-kauran và steroid. Alkaloid là những hợp chất nitơ heterocyclic có tác dụng sinh học mạnh mẽ. Diterpen ent-kauran thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể. Các hợp chất steroid góp phần vào những tác dụng điều hòa sinh lý của dược liệu này.

II. Tác dụng kháng Staphylococcus aureus của Bình bát

Staphylococcus aureus là một loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt là những chủng kháng nhiều kháng sinh. Nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng tinh dầu từ lá bình bát có khả năng kháng S. aureus rất hiệu quả. Phương pháp phân tích GC-MS xác định các thành phần chính như β-caryophyllen và β-Guaiene trong tinh dầu, những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ. Kết quả đánh giá bằng phương pháp MIC (Minimum Inhibitory Concentration) cho thấy tinh dầu bình bát ức chế sự phát triển của vi khuẩn này ở nồng độ thấp, mở ra cơ hội sử dụng trong chế tạo thuốc chữa các nhiễm trùng do S. aureus gây ra.

2.1. Thành phần tinh dầu kháng khuẩn của Bình bát

Phân tích GC-MS của tinh dầu bình bát xác định β-caryophyllen và β-Guaiene là những hợp chất chiếm tỉ lệ lớn. Các hợp chất này thuộc nhóm sesquiterpen có cấu trúc phân tử hỗ trợ khả năng xuyên qua màng tế bào vi khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng được cơ chế hóa thông qua sự phá vỡ tính toàn vẹn của màng tế bào, dẫn đến tử vong của S. aureus.

2.2. Cơ chế docking phân tử chống khuẩn

Mô phỏng docking phân tử giữa các thành phần tinh dầu bình bát với đích protein của S. aureus (như protein 2w9s và 3srw) tiết lộ những tương tác quan trọng. β-caryophyllen và β-Guaiene kết hợp mạnh mẽ với các protein này thông qua các liên kết hydrogen và tương tác van der Waals, làm suy giảm chức năng vi khuẩn.

III. Ức chế Nitric oxid tác dụng kháng viêm của Bình bát

Nitric oxid (NO) là một chất báo hiệu sinh học quan trọng, nhưng sản sinh quá mức dẫn đến viêm nhiễm mãn tính. Cao chiết từ lá bình bát thể hiện khả năng ức chế sản sinh nitric oxid rất hiệu quả trên đại thực bào phúc mạc của chuột. Enzyme iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) là target chính trong sản sinh NO, và các hợp chất flavonoid từ bình bát như Rutin, Kaempferol 7-neohesperidoside và Nicotiflorine có khả năng ức chế iNOS mạnh mẽ. Kết quả thực nghiệm cho thấy cao chiết bình bát giảm giải phóng NO tương xứng với nồng độ sử dụng, chứng tỏ tiềm năng trong phát triển thuốc kháng viêm từ các thành phần thiên nhiên.

3.1. Vai trò của Nitric oxid trong quá trình viêm nhiễm

Nitric oxid được sản sinh bởi enzyme iNOS khi đại thực bào bị kích thích. Mức NO cao gây ra phản ứng viêm mãn tính, gây tổn thương mô. Cao chiết bình bát chứa flavonoid có khả năng ức chế iNOS, từ đó giảm sản sinh nitric oxid và làm giảm tình trạng viêm. Tác dụng kháng viêm này là cơ sở khoa học cho việc sử dụng lá bình bát trong y học truyền thống.

3.2. Các hợp chất Flavonoid ức chế iNOS trong Bình bát

Rutin, Kaempferol 7-neohesperidoside và Nicotiflorine là những hợp chất flavonoid chính xác định từ cao chiết bình bát. Các hợp chất này ức chế enzyme iNOS thông qua các tương tác đặc hiệu với protein 3e7g, giảm sản sinh nitric oxid một cách hiệu quả. Mô phỏng docking cho thấy những liên kết mạnh giữa các flavonoid và iNOS, giải thích cơ chế kháng viêm ở mức độ phân tử.

IV. Ứng dụng và triển vọng của Bình bát trong phát triển dược phẩm

Những phát hiện nghiên cứu về hợp chất hoạt tính từ lá bình bát có những ứng dụng thực tiễn quan trọng trong ngành dược phẩm. Khả năng kháng S. aureus và ức chế nitric oxid làm cho lá bình bát trở thành nguồn nguyên liệu quý báu cho phát triển các sản phẩm chữa các bệnh nhiễm trùng và viêm nhiễm. Các hợp chất được cô lập từ bình bát có thể được sử dụng để tổng hợp các dẫn chất mới với hiệu quả cao hơn. Phương pháp docking phân tử giúp tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này để nâng cao hiệu lực sinh học. Các thuốc dựa trên thành phần bình bát không chỉ hiệu quả mà còn an toàn, giảm tác dụng phụ so với kháng sinh tổng hợp.

4.1. Ứng dụng trong phát triển thuốc kháng khuẩn mới

Bình bát là ứng cử viên hứa hẹn cho phát triển kháng sinh thiên nhiên chữa những bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra, đặc biệt là những chủng kháng kháng sinh đa dạng. Các tinh dầu hoặc cao chiết từ lá bình bát có thể được bào chế thành các dạng dùng bên ngoài hoặc bên trong để điều trị vết loét, bỏng, viêm da nhiễm trùng. Tính an toàn cao và không gây kháng drug là những ưu điểm nổi bật.

4.2. Tiềm năng phát triển thuốc kháng viêm từ Bình bát

Các hợp chất flavonoid ức chế iNOS từ cao chiết bình bát mở ra hướng phát triển thuốc kháng viêm mới, hỗ trợ điều trị các bệnh viêm mãn tính. So với thuốc kháng viêm tổng hợp, những sản phẩm từ lá bình bát có độ an toàn cao hơn. Các hợp chất này có thể được cô lạc, tinh sạch và sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất dược phẩm hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong bối cảnh gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh, việc tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ và an toàn là một nhu cầu cấp bách. Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất, gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng từ nhẹ đến nghiêm trọng, bao gồm viêm da, viêm phổi, và nhiễm trùng máu. Sự xuất hiện của các chủng S. aureus kháng methicillin (MRSA) đã làm gia tăng đáng kể nguy cơ lây nhiễm và tỷ lệ tử vong liên quan đến các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

Lá của cây Bình bát (Annona glabra L.) đã được sử dụng trong y học dân gian ở nhiều nền văn hóa khác nhau để điều trị các bệnh lý khác nhau như nhiễm trùng và viêm. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng A. glabra có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm các alkaloid, flavonoid, và các loại hợp chất phenolic khác. Tuy nhiên, việc xác định và sàng lọc các hợp chất cụ thể có khả năng kháng S.

aureus và ức chế sự giải phóng nitric oxide (NO) vẫn còn nhiều thách thức và chưa được nghiên cứu đầy đủ. Nghiên cứu này nhằm sàng lọc và xác định các hợp chất từ lá Bình bát (A. glabra) có khả năng kháng S. aureus và ức chế sự giải phóng nitric oxide, mục tiêu của nghiên cứu bao gồm: - Xác định các hợp chất tiềm năng có khả năng kháng S.

aureus của tinh dầu Annona glabra - Sàng lọc, nghiên cứu, đánh giá khả năng ức chế sự giải phóng nitric oxide của các hợp chất trong cao chiết Các nghiên cứu invitro được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kháng S.aureus và ức chế giải phóng NO,sau đó làm sáng tỏ hơn bằng cách sử dụng phương pháp docking phân tử -một phương pháp tính toán mạnh mẽ, cho phép mô phỏng và dự đoán cách thức các hợp chất nhỏ (ligand) tương tác với các đích protein (receptor) trong cơ thể. Tên khoa học và vị trí phân loại Cây Bình bát (Annona glabra L.) là một loài cây được phân bố rộng rãi ở nước ta [1], loài cây này rất dễ sống là có khả năng sinh trưởng phát triển tốt. Bình bát thuộc chi Na (Annona L. Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loại thực vật hạt kín APV IV 2016 (Angiosperm Phylogeny Group), vị trí phân loại của Annona glabra như sau [19] Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Ngọc Lan (Magnoliales) Họ: Na (Annonaceae) Chi: Na (Annona L.) Loài: Annona glabra L.

Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố 1. Đặc điểm thực vật Cây gỗ nhỏ, cao 2-5m, vỏ màu xám. Lá không có lông, lá hình xoan hay tròn dài, thuôn dài hoặc hình trứng; có 8-9 cặp gân phụ. Hoa màu vàng, rộng 2cm; cánh hoa dày, dài 2-3cm, có bớt đỏ ở mặt trong, nhiều nhụy nhỏ.

Quả dài 7-10 cm, màu vàng xanh, không có gai nạt, nạt trắng; hạt màu nâu đen dài khoảng 1cm. Trái ăn được, khi chín có màu vàng,mùi thơm nhưng vị nhạt. Sinh sống tại bờ rạch nơi có nước lợ. Vị trí phân bố Chi Annona L.

thuộc họ Annonaceae với khoảng 119 loài [5], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ và 1 số ở vùng nhiệt đới Châu Phi[5], cũng như các nước Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam. có nguồn gốc từ Florida (USA), vùng Caribe, Trung và Nam Châu Mỹ. Nó phân bố rộng rãi ở khu vực rừng ngập mặn ở Brazil [7]. Nó cũng được tìm thấy ở các bờ hồ và sông, cũng có thể sống trong vùng đầm lầy của rừng ngập mặn, không thể tồn tại ở vùng khô hạn, đất cát.

Thành phần Thành phần hóa học của Bình bát rất đa dạng về nhóm chất đến từ nhiều bộ phận khác nhau. Quả cây chứa nhiều kauranediterpenoid, acetogenin, steroid; thành phần chính của hạt là các alkaloid[8]; lá cây gồm có các hợp chất flavonoid, glycolipid, alkaloid, hợp chất thơm, phenol, đường, steroid, terpen và tinh dầu chứa chủ yếu là mono- và sesquiterpen[6]. Tinh dầu Các hợp chất được xác định từ tinh dầu chủ yếu là mono-terpenoid và sesquiterpenoid. Theo các bài báo đã tổng hợp thì thành phần chính của tinh dầu của Annona glabra L.

ở Việt Nam là β-caryophyllen (21,5%), germacren D (17,7%), α- cadinol (5,4%), β-elemen (5,2%), α-phellandren (4,3%) và α-caryophyllen (3,6%). Tinh dầu chiết xuất từ quả của Annona glabra L. từ Brazil bao gồm các mono-terpen: α-pinen (11,3-18,5%), limonen (20,0-20,7%), α-phellandren (1,2-21%) và (E)-β-ocimen (15,8- 19,7%).Trong khi đó mẫu từ Cuba chứa myrcen (47,1%), (Z)-β-ocimen (16,3%), limonen (11,2%) và α-pinen (9,5%) chiếm tỷ lệ cao hơn.[6] Có thể thấy rằng, sesquiterpenoid là hợp chất chiếm ưu thế trong tinh dầu của Annona glabra L. ở Việt Nam; trái ngược với các monoterpenoid được tìm thấy trong tinh dầu từ Brazil và Cuba.

Chúng ta biết rằng tinh dầu từ lá cây có thành phần khác so với tinh dầu từ các bộ phận khác, cho dù được lấy từ cùng 1 cây. Các hợp chất alkaloid Năm 2000, Fang Rong Chang và cộng sự đã phân lập được 13 hợp chất alkaloid từ cành và quả Bình bát trong đó bao gồm 1 dioxoaporphin (1), 2 oxoaporphin (2), (3), 5 aporphin (4-8), 1 proaporphin (9), 2 protoberberin (10), (11) và 2 amide (12), (13) [9]. Trước đó vài năm, Shoei Sheng Lee cùng với các cộng sự đã tìm được 3 hợp chất akloid (14-16) trong đó có (-)-Anolobine (15) và (-)-Roemeroline (16) là hai chất có tiềm năng ức chế actylcholinesterase với IC50 lần lượt 22,4 và 26,3 µM[10]. Alkaloid từ cành và quả Bình bát STT Tên chất CTPT Mw TLTK 1 Annobraine C19H11NO4 317,3 [9] 2 Liriodenine C17H9NO3 275,3 [9] 3 Lysicamine C18H13NO3 291,3 [9] 4 (-)-Nornuciferine C18H19NO2 281,3 [9] 5 (-)-Anonaine C17H15NO2 265,3 [9] 6 (-)-N-formylanonaine C18H15NO3 293,3 [9] 3 7 (-)-Asimilobine C17H17NO2 267,3 [9] 8 (+)-Nordomesticine C19H19NO4 325,4 [9] 9 (+)-Stepharine C18H19NO3 297,3 [9] 10 (-)-Kikemanine C20H23NO4 341,4 [9] 11 Dehydrocorydalmine C20H20NO4 338,4 [9] 12 N-trans -feruloyltyramine C18H19NO4 313,3 [9] 13 N-p-coumaroyltyramine C17H17NO3 283,3 [9] 14 (-)-Actinodaphnine C18H17NO4 311,3 [10] 15 (-)-Anolobine C17H15NO3 281,3 [10] 16 (-)-Roemeroline C18H17NO3 295,3 [10] 1.

Các hợp chất ent-kauran diterpen Trong cao chiết quả và cành của Bình bát, ngoài các alkaloid thì phần lớn trong cao chứa các terpenoid, cụ thể là các ent-kauran diterpen. Các ent-kauran diterpen đặc trưng của loài Bình bát được đặt tên lần lượt là Annonaglabasin A, B, C, D, E , F (17- 22) Bảng 2. Các hợp chất ent-kauran diterpen trong cành và quả Bình bát STT Tên chất CTPT Mw TLTK 17 Annoglabasin A C23H34O5 390,5 [11] 18 Annoglabasin B C22H34O4 362,5 [11] 19 Annoglabasin C C23H34O6 406,5 [12] 4 20 Annoglabasin D C23H34O5 390,5 [12] 21 Annoglabasin E C20H32O3 320,5 [12] 22 Annoglabasin F C22H34O5 378,5 [12] Các hợp chất Annoglabasin được nghiên cứu và cho là có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư ở người cụ thể trên các dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB[13]. Các hợp chất steroid Thành phần hóa học trong cành và quả Bình bát có chứa một hàm lượng nhất định các steroid.

Các hợp chất này được phân lập bởi Fang Rong Chang và cộng sự năm 2000 bao gồm 5 hợp chất β-Sitosterol (23), Stigmasterol (24), β-sitosteryl-D-glucoside (25), Stigmasteryl-D-glucoside (26) và 6-O-palmitoyl- β -sitosteryl-D-glucoside (27) (bảng 3)[9]. Các steroid trong cành và quả Bình bát STT Tên chất CTPT Mw TLTK 23 β-Sitosterol C29H50O 414,7 [9] 24 Stigmasterol C29H48O 412,7 [9] 25 β-sitosteryl-D-glucoside C35H60O6 576,8 [9] 26 Stigmasteryl-D-glucoside C35H58O6 574,8 [9] 6-O-palmitoyl- β -sitosteryl-D- 27 C51H90O7 815,3 [9] glucoside 1. Tác dụng sinh học 1. Tác dụng kháng Leishmania Bệnh Leishmania chủ yếu do ký sinh trùng đơn bào thuộc chi Leishmania gây ra và là một trong những bệnh nhiệt đới bị lãng quên (Neglected tropical diseases – NTDs), đặc trưng bởi sự hình thành các vết loét trên da.

Alkaloid là chất có hoạt tính chống leishmania ở loài Bình bát. Trong số các alkaloid được phân lập từ các loài, các hợp chất đã được chứng minh có hoạt tính chống Leishmania là coronaridine, O-methylarmepavine, 18-methoxycoronaridine và liriodenine. Ngoài ra, acetogenins corosolone và anonacinone cũng có triển vọng như chất diệt leishmania[14]. Tác dụng chống ung thư Các acetogenin annonaceous từ họ annonaceae là nguồn rất quan trọng cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai.

Các phần acetogenin có trong lá Bình bát được phát hiện bằng thuốc thử Kedde và chúng được phân lập thông qua sắc ký cột. Nó từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền như một chất chống ung thư[15]. Cao chiết Ethanol của lá Bình bát cho thấy sự hiện diện của annoglacin A và B, và nó ngăn chặn sự tăng sinh của ung thư biểu mô tuyến tụy và các dòng tế bào vú ở người, đồng thời nó có hoạt tính chống ung thư rõ rệt hơn adriamycin[15]. Các nghiên cứu thực hiện trên cao chiết methanol của hạt Bình bát dựa trên thử nghiệm sinh học đã phân lập được các thành phần annonin I, squamocin-C và squamocin-D.

Trong số đó, annonin I có hoạt tính cao hơn chống lại ung thư biểu mô phổi A-549 và ung thư biểu mô tuyến vú[15]. Tác dụng kháng viêm Viêm là phản ứng bình thường và tức thời của mô sống đối với bất kỳ loại chấn thương nào. Nếu quá trình viêm xảy ra lặp đi lặp lại hoặc liên tục sẽ dẫn đến một số bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh viêm ruột, hen suyễn, bệnh vẩy nến, xơ vữa động mạch và một số bệnh ung thư. Tình trạng viêm, chủ yếu được hình thành qua enzym trung gian là phospholipase A2 (SPLA2S) có tác dụng điều chỉnh con đường axit arachidonic qua đó các chất trung gian gây viêm được giải phóng.

Cây Bình bát cho thấy sự hiện diện của một số hợp chất có hoạt tính sinh học, như alkaloid, flavonoid, tannin, steroid, terpenoid, glycoside, phenol và những hợp chất này có thể tạo ra các đặc tính y học khác nhau của nó. Cơ chế hoạt động chống viêm của cao chiết axeton của lá Bình bát được đánh giá dựa trên khả năng ức chế SPLA2S. Dịch chiết cho thấy vùng ức chế tốt. Tác dụng hiệp đồng của các hợp chất có trong cao chiết của lá Bình bát có thể là nguyên nhân ức chế enzyme SPLA2 ở mức độ lớn hơn[8].

Tác dụng kháng khuẩn Trong nghiên cứu trước đây, Bình bát đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn chọn lọc như Bacillus cereus (Gram+), Pseudomonas aeruginosa (Gram-) và Shigella flexneri (Gram-). Những hoạt tính này được so sánh với kháng sinh tiêu chuẩn, cụ thể là kháng sinh phổ rộng như ampicillin và penicillin. Việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tuân theo kỹ thuật truyền thống là đĩa khuếch tán trên môi trường thạch. Sau đó, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng phương pháp pha loãng.

Ampicillin và penicillin tiêu chuẩn có giá trị MIC dao động trong 6 khoảng từ 0,244 mg/mL đến 0,488 mg/mL. Kết quả cho thấy cao chiết Bình bát thể hiện hiệu quả kháng khuẩn vượt trội so với kháng sinh thông thường[16].