Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở lúa

Luận văn thạc sĩ phân tích chi tiết đa hình di truyền và biểu hiện gen OsHKT2;4 ở các giống lúa, cung cấp dữ liệu khoa học chuyên sâu.

• Tác giả: Nguyễn Tiến Đạt
• Người hướng dẫn: Đỗ Thị Phúc, TS.
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở Lúa (Oryza sativa)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Gen OsHKT2 4 và Vai Trò Trong Cây Lúa

Gen OsHKT2;4 là một gen quan trọng thuộc họ protein vận chuyển ion HKT (High-affinity Potassium Transporter) ở cây lúa (Oryza sativa). Gen này đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa vận chuyển các ion, đặc biệt là ion Na+ qua màng tế bào. Sự biểu hiện và hoạt động của gen OsHKT2;4 ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng chống chịu stress mặn của cây lúa. Nghiên cứu về đa hình di truyền của gen này giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền trong các giống lúa khác nhau, từ đó có thể ứng dụng trong việc cải t良lúa chống chịu điều kiện đất mặn.

1.1. Cấu Trúc và Chức Năng Protein HKT

Protein họ HKT là các kênh vận chuyển ion xuyên màng có sáu miền xuyên màng. Tại lúa, gen OsHKT2;4 mã hóa một protein chịu trách nhiệm vận chuyển Na+ và K+, giúp cây lúa duy trì cân bằng ion trong điều kiện stress mặn. Cấu trúc 3D của protein OsHKT2;4 cho phép nó hoạt động như một filter pore chọn lọc các ion đi qua màng tế bào.

1.2. Ý Nghĩa Nghiên Cứu Đa Hình Gen

Phân tích đa hình nucleotide ở gen OsHKT2;4 giúp xác định các biến thể di truyền khác nhau giữa các giống lúa. Những đa hình này có thể dẫn đến các đa hình amino acid trong protein, ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của protein. Hiểu rõ những sự khác biệt này là nền tảng để chọn lọc các giống lúa có khả năng chống mặn cao.

II. Phương Pháp Phân Tích Đa Hình Di Truyền Gen OsHKT2 4

Để nghiên cứu đa hình di truyền của gen OsHKT2;4, các nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp hiện đại. Phương pháp PCR kỳ tích được dùng để khuếch đại gen, sau đó tiếp tục với giải trình tự DNA bằng phương pháp Sanger để xác định chính xác các vị trị nucleotide khác nhau. Kết quả giải trình tự được so sánh sử dụng các công cụ phân tích sinh học như MultAlin để phát hiện các đa hình nucleotide và dự đoán các đa hình amino acid tương ứng. Các phương pháp này cho phép chia các giống lúa thành các nhóm di truyền khác nhau dựa trên các biến thể gen.

2.1. Kỹ Thuật Khuếch Đại PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là bước quan trọng đầu tiên trong phân tích đa hình gen. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế để khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 từ DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá lúa. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di DNA để xác nhận kích thước fragment đúng.

2.2. Giải Trình Tự và So Sánh Trình Tự

Sản phẩm PCR được tiếp tục giải trình tự DNA bằng phương pháp Sanger cải biến. Các trình tự nucleotide thu được được phân tích bằng phần mềm Bioedit để loại bỏ nhiễu và xác định chính xác. Sử dụng công cụ MultAlin để so sánh trình tự giữa các mẫu, từ đó xác định các vị trí đa hình cụ thể.

III. Biểu Hiện Gen OsHKT2 4 Dưới Điều Kiện Stress Mặn

Mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 thay đổi tùy theo điều kiện mặn và theo từng giống lúa. Nghiên cứu sử dụng phương pháp Real-time PCR (qRT-PCR) để định lượng mRNA của gen này từ các mẫu lá lúa được xử lý với nước mặn. Kết quả cho thấy các giống lúa khác nhau có mức độ biểu hiện gen khác nhau khi bị stress mặn. Giống Pokkali (có khả năng chống mặn cao) thường có mức độ biểu hiện cao hơn so với giống Nipponbare (nhạy cảm với mặn). Sự khác biệt trong biểu hiện gen này được thể hiện qua giá trị Fold change, cho thấy mức độ thay đổi nồng độ mRNA giữa mẫu xử lý mặn và mẫu đối chứng.

3.1. Phương Pháp Real time PCR

Real-time PCR (qRT-PCR) là phương pháp hiện đại nhất để đo lường biểu hiện gen. Quá trình bắt đầu với tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá lúa, sau đó tổng hợp cDNA bằng enzyme reverse transcriptase. Phản ứng Real-time PCR được thực hiện với mồi đặc hiệu và thuốc nhuộm huỳnh quang, cho phép theo dõi tín hiệu huỳnh quang tăng theo thời gian PCR, từ đó tính toán được mức độ biểu hiện của gen.

3.2. Kết Quả Biểu Hiện Giữa Các Giống Lúa

So sánh biểu hiện gen OsHKT2;4 giữa giống Nipponbare và Pokkali cho thấy sự khác biệt rõ ràng. Giống Pokkali chống mặn tốt hơn nhờ vào mức độ biểu hiện cao hơn của gen này dưới stress mặn. Giá trị Fold change cho thấy mức độ tăng nồng độ mRNA trong cơ thể lúa khi bị xử lý mặn, phản ánh khả năng đáp ứng stress của mỗi giống.

IV. Ứng Dụng Trong Cải T良Lúa Chống Mặn

Kiến thức về đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 có giá trị lớn trong chương trình cải t良lúa. Bằng cách xác định các biến thể di truyền lợi thuận của gen này, các nhà khoa học có thể sử dụng lựa chọn hỗ trợ bằng markers (MAS) để nhân giống các giống lúa có khả năng chống mặn cao. Những giống lúa này có thể được phát triển để phù hợp với các vùng đất mặn, giúp tăng năng suất nông nghiệp trong điều kiện khó khăn. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng mở ra hướng để hiểu rõ hơn về các cơ chế sinh học của stress mặn ở cây lúa, từ đó có thể phát triển các giải pháp khác nhau để cải thiện sức chống chịu của cây.

4.1. Lựa Chọn Giống Lúa Chống Mặn

Dựa trên phân tích đa hình gen OsHKT2;4, các nhà nông dân và nhà khoa học có thể lựa chọn giống lúa phù hợp cho đất mặn. Những giống có biến thể di truyền tốt của gen này sẽ có khả năng chống mặn tốt hơn. Phương pháp lựa chọn hỗ trợ bằng markers cho phép tăng tốc độ cải tấn lúa bằng cách xác định các cá nhân mang đa hình mong muốn.

4.2. Phát Triển Công Nghệ Canh Tác Bền Vững

Hiểu rõ về biểu hiện gen OsHKT2;4 giúp phát triển các biện pháp quản lý canh tác tối ưu cho đất mặn. Kết hợp các giống lúa có khả năng chống mặn cao với các kỹ thuật canh tác hiện đại, chúng ta có thể nâng cao năng suất trong các vùng đất khó khăn, góp phần vào nông nghiệp bền vững và đảm bảo an ninh lương thực.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp. Việt Nam là một trong những nƣớc chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi khí hậu. Với đƣờng bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sông ngòi chằng chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp của nƣớc ta. Ở đồng bằng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng.

Hạn hán và đất nhiễm mặn đã và đang ảnh hƣởng đến trên 30 tỉnh thành của nƣớc ta. Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cƣờng peroxide lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy nhƣ các gốc superoxide và hydroxyl. Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết sức quan trọng. Khả năng chịu mặn là tính trạng đƣợc kiểm soát bởi nhiều gen.

Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có vai trò rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn. Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu mặn. Trong số các kênh vận chuyển Na + và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium transporter) có vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress mặn. OsHKT2;4 thuộc nhóm 2 họ protein HKT, OsHKT2;4 đƣợc biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+ và K+.

Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về gen mã hóa cho protein OsHKT2;4 trên các giống lúa Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở lúa QH.CH - 1 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt (Oryza sativa)” với mục tiêu: Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 và nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở một số giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau.CH - 2 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt CHƢƠNG. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA (Oryza sativa) Lúa (Oryza sativa) là một trong năm loại cây lƣơng thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea mays L.), sắn (Manihot esculenta Crantz) và khoai tây (Solanum tuberosum L.

Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi Oryza; ngƣời ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa đã đƣợc thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73].CH - 3 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á; sau đó đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và Japonica. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Hai nhóm sinh thái này đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.), sinh lý và đặc điểm sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh, còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung bình, hạt tròn ngắn. Với tầm quan trọng trong cung cấp lƣơng thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây lúa đang ngày càng đƣợc chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong những hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng.

GIỚI THIỆU VỀ HỌ PROTEIN VẬN CHUYỂN ION XUYÊN MÀNG HKT Ở THỰC VẬT VÀ Ở LÚA Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các quốc gia trên thế giới. Cây trồng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở nồng độ muối cao [9]. Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl-. Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học gây ra (Hình 1.

Trong số các kênh vận chuyển Na + và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51].CH - 4 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Hình 1. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress mặn ở thực vật [75] 1. Họ protein HKT ở thực vật Schachtman và Schroeder là hai ngƣời đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhƣng có trình tự và chức năng tƣơng tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và nấm [56]. HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63].

HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien nồng độ [15;26;30].CH - 5 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57]. Một số protein HKT có tính chọn lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na + và K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc vào các ion trong môi trƣờng [57]. Các protein họ HKT đã đƣợc nghiên cứu [57] Protein Loài Mã số AtHKT1;1 Arabidopsis thaliana Q84TI7.1 BdHKT1 Brachypodium distachyon XP_003560515.1 BdHKT4 Brachypodium distachyon XP_003581628.1 BdHKT6 Brachypodium distachyon XP_003570995.1 BdHKT8 Brachypodium distachyon XP_003564102.1 BdHKT9 Brachypodium distachyon XP_003563514.1 CaHKT1 Cochlearia anglica AFH37929.1 DfHKT Diplachne fusca AEM55592.1 EcHKT1;1 Eucalyptus camaldulensis AF176035_1 EcHKT1;2 Eucalyptus camaldulensis AF176036_1 EsHKT1 Eutrema salsugineum AFJ23835.1 GmHKT1 Glycine max XP_003540998.1 HbHKT Hordeum brevisubulatum AER42622.1 HvHKT1;5 Hordeum vulgare ABK58096.1 HvHKT4 Hordeum vulgare AEM44690.1 HvHKT2;1 Hordeum vulgare AEM55590.1 McHKT1;1 Mesembryanthemum crystallinum AF367366_1 McHKT1;2 Mesembryanthemum crystallinum AAO73474.1 MtHKT1;5 Medicago truncatula AES77170.1 OgHKT1 Oryza glumipatula ABD15858.CH - 6 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt OrHKT1 Oryza rufipogon AAY33540.1 OsHKT1;1 Oryza sativa Q7XPF8.2 OsHKT1;3 Oryza sativa Q6H501.1 OsHKT1;5 Oryza sativa A2WNZ9.2 OsHKT2;1 Oryza sativa A2YGP9.2 OsHKT2;2 Oryza sativa Q93XI5.1 OsHKT2;3 Oryza sativa Q8L481.1 OsHKT2;4 Oryza sativa Q8L4K5.1 PaHKT1 Phragmites australis BAE44384.1 PtHKT1 Populus trichocarpa EEF03794.1 PutHKT2;1 Puccinellia tenuiflora ACT21087.1 SbiHKT1;5 Sorghum bicolor EES02856.1 SbiHKT1;3 Sorghum bicolor EES04614.1 SbiHKT2;3 Sorghum bicolor EER90327.1 SbHKT1 Salicornia bigelovii ADG45565.1 SmHKT1 Selaginella moellendorffii EFJ18587.1 SsHKT1 Suaeda salsa AAS20529.2 TaHKT1;5-D Triticum aestivum ABG33949.1 TaHKT2;1 Triticum aestivum AAA52749 TaHKT1;5-B1 Triticum aestivum ABG33947.1 TaHKT1;5-B2 Triticum aestivum ABG33948.1 TmHKT1;5-A Triticum monococcum ABG33946.1 ThHKT1 Thellungiella halophila BAJ34563.1 VvHKT1 Vitis vinifera XP_002270986.1 VvHKT1;3 Vitis vinifera XP_002267717.1 ZmHKT1 Zea mays AEK27028.1 ScTRK1 Saccharomyces cerevisiae AAA34728 ScTRK2 Saccharomyces cerevisiae AAA35172 VpTrkH Vibrio parahaemolyticus Q87TN7.CH - 7 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Dựa vào khả năng vận chuyển đặc hiệu ion, họ protein HKT đƣợc chia thành hai nhóm: nhóm vận chuyển chọn lọc với Na + (nhóm I) và nhóm đồng vận chuyển Na+ và K+ (nhóm II) [16;18;57]. Họ protein HKT ở cây lúa Ở lúa (Oryza sativa), họ protein HKT cũng đƣợc chia ra hai nhóm và đƣợc mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống.

Trong đó, họ protein HKT nhóm I đƣợc mã hóa bởi các gen OsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và nhóm II đƣợc mã hóa bởi các gen OsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4 [57]. OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus định lƣợng SKC1 mã hóa cho một protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+ trong thân bẹ của cây. OsHKT1;1 có thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57].

OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57]. Dƣới điều kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ đƣợc điều hòa giảm hoạt động [35;61]. Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na + gây độc cho cây [31]. Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng đƣợc biểu hiện trong lá [23;35;44].

OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na + và K+ [64]. Cây lúa xử lý mặn ở 150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào diệp lục. Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít biểu hiện ở rễ [25;29;33].CH - 8 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Bảng 1. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57] Gen Mã số Nucleotide Nhóm Mã số protein OsHKT1;1 AJ491816 Nhóm I CAD37183 OsHKT1;2 AJ506745 Nhóm I - OsHKT1;3 AJ491818 Nhóm I CAD37185 OsHKT1;4 AJ491853 Nhóm I CAD37197 OsHKT1;5 AK108663 Nhóm I BAB93392 OsHKT2;1 AB061311 Nhóm II BAB61789 OsHKT2;2 AB061313 Nhóm II BAB61791 OsHKT2;3 AJ491820 Nhóm II CAD37187 OsHKT2;4 AJ491855 Nhóm II CAD37199 1.

Gen OsHKT2;4 Gen OsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74]. Gen OsHKT2;4 ít biểu hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân sinh. Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32].CH - 9 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt Hình 1. Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome [74] 1.