Luận văn ThS: Gen OsHKT1;4 và mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa

Tài liệu nghiên cứu tính đa hình, mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4, đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa (Oryza sativa).

• Tác giả: Đặng Ngọc Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa (Oryza sativa)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Gen OsHKT1 4 và vai trò trong cây lúa

Gen OsHKT1;4 là một trong những gen quan trọng nhất thuộc họ gen HKT (High-Affinity K+ Transporter) ở lúa (Oryza sativa). Gen này mã hóa các protein vận chuyển ion, đặc biệt là Na+ và K+, giúp cây lúa duy trì sự cân bằng ion trong điều kiện stress mặn. Vị trí gen OsHKT1;4 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa, với cấu trúc bao gồm vùng promoter và vùng mã hóa. Mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 thay đổi tùy theo tình trạng mặn trong môi trường. Nghiên cứu đa hình gen OsHKT1;4 giúp xác định các biến thể tự nhiên có liên quan đến khả năng chịu mặn ở các giống lúa khác nhau. Hiểu rõ chức năng và biểu hiện của gen này là nền tảng cho việc cải thiện khả năng chịu mặn thông qua công nghệ sinh học.

1.1. Cấu trúc và chức năng gen OsHKT1 4

Gen OsHKT1;4 có cấu trúc phức tạp với vùng promoter, các exon và intron. Protein được mã hóa bởi gen này hoạt động như một protein vận chuyển Na+ chỉ có trong thân bẹ, không ở rễ. Cơ chế hoạt động của OsHKT1;4 là lưu giữ Na+ ở các phần mô mạch, ngăn chặn sự tích tụ Na+ độc hại ở lá. Điều này giúp cây duy trì cân bằng nước và chất dinh dưỡng khi tiếp xúc với stress mặn.

1.2. Biểu hiện gen trong điều kiện stress mặn

Khi cây lúa tiếp xúc với điều kiện mặn cao, mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 thay đổi đáng kể. RT-PCR và Real time PCR là các phương pháp phân tích mức độ biểu hiện hiệu quả. Các giống lúa chịu mặn tốt thường có mức biểu hiện cao hơn so với giống lúa nhạy cảm với mặn. Sự khác biệt này cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa hoạt động gen OsHKT1;4 và khả năng chịu mặn.

II. Đa hình gen OsHKT1 4 ở các giống lúa

Đa hình gen OsHKT1;4 được xác định thông qua các biến thể nucleotide ở vùng promoter và vùng mã hóa. Nghiên cứu tính đa hình cho thấy sự khác biệt giữa các giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau. Sử dụng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự DNA, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều vị trí đa hình có ý nghĩa sinh học. Các yếu tố cis trong vùng promoter ảnh hưởng đến mức độ và tốc độ biểu hiện gen. Những khác biệt về trình tự nucleotide được ghi nhận ở 9 giống lúa khác nhau, đặc biệt ở nhóm II lúa. Phân tích đa hình giúp các nhà l育种 (breeding) lựa chọn các kiểu gen tốt nhất để cải thiện khả năng chịu mặn.

2.1. Vùng promoter và các yếu tố cis

Vùng promoter của gen OsHKT1;4 chứa nhiều yếu tố cis quan trọng điều hòa biểu hiện gen. Phân tích trình tự nucleotide vùng promoter bằng công cụ tin sinh học giúp dự đoán các yếu tố điều hòa. Các vị trị đa hình ở promoter ảnh hưởng trực tiếp đến kết nối của các protein điều hòa với DNA. Những khác biệt này giải thích tại sao các giống lúa khác nhau có mức độ biểu hiện gen OsHKT1;4 không giống nhau.

2.2. Vùng mã hóa và biến thể protein

Exon 2 và Exon 3 của gen OsHKT1;4 mã hóa các vùng quan trọng của protein vận chuyển. Đa hình vùng mã hóa có thể dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc protein ảnh hưởng đến hiệu quả vận chuyển ion. Một số biến thể nucleotide gây ra sai khác cắt nối luân phiên (alternative splicing), tạo ra các dạng protein khác nhau với chức năng khác nhau.

III. Khả năng chịu mặn ở lúa và cơ chế liên quan

Khả năng chịu mặn ở lúa là một tính trạng phức tạp được điều hòa bởi nhiều gen, trong đó gen OsHKT1;4 đóng vai trò then chốt. Khi lúa phải đối mặt với stress mặn, nồng độ Na+ cao trong môi trường gây áp lực nước, chọc thủng các màng tế bào và gây độc. Protein HKT1;4 hoạt động bằng cách loại bỏ Na+ khỏi các mô lá, giảm độc tính và duy trì chức năng thực vật bình thường. Đáp ứng với stress mặn bao gồm các quá trình sinh lý phức tạp như điều chỉnh thẩm thấu và sắc ký tế bào. Các cơ chế vận chuyển Na+ được điều khiển bởi một mạng lưới gen và protein làm việc cùng nhau. Cây lúa có khả năng chịu mặn cao thường có mức biểu hiện gen OsHKT1;4 cao hơn, cho phép chúng kiểm soát nồng độ Na+ hiệu quả hơn.

3.1. Cơ chế vận chuyển Na và mặn tại tế bào

Vận chuyển Na+ ở lúa là một quá trình năng lượng-phụ thuộc điều khiển bởi nhiều protein transporter. Gen OsHKT1;4 mã hóa transporter Na+ chuyên biệt chỉ hoạt động ở thân bẹ. Sơ đồ vận chuyển Na+ cho thấy Na+ được loại bỏ khỏi các tế bào lá thông qua protein HKT1;4, ngăn chặn tích tụ độc hại. Cơ chế này bảo vệ cơ quan quang hợp khỏi damage từ mặn.

3.2. Các phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn

Trồng lúa thủy canh trong dung dịch chứa NaCl cao là cách xử lý stress mặn trong phòng thí nghiệm. Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng RT-PCR và Real time PCR giúp đo lường đáp ứng của gen OsHKT1;4. So sánh mức độ biểu hiện giữa điều kiện mặn và điều kiện bình thường cho thấy mối liên quan giữa hoạt động gen và khả năng chịu mặn.

IV. Ứng dụng nghiên cứu gen OsHKT1 4 trong cải thiện lúa

Nghiên cứu gen OsHKT1;4 có nhiều ứng dụng thực tiễn quan trọng trong cải thiện giống lúa chịu mặn. Kỹ thuật giải trình tự DNA và phân tích đa hình gen cho phép xác định các biến thể gen có liên quan đến khả năng chịu mặn. Các công cụ tin sinh như MUTALIN giúp phân tích trình tự promoter và dự đoán yếu tố cis ảnh hưởng đến biểu hiện. Công nghệ marker-assisted selection sử dụng đa hình gen OsHKT1;4 để lựa chọn các cây lúa có đặc tính chịu mặn tốt. Việc nhân giống các kiểu gen mang những biến thể tốt của gen OsHKT1;4 có thể tạo ra các giống lúa mới phù hợp với đất mặn. Đây là hướng đi quan trọng để bảo đảm an ninh lương thực trên các vùng đất mặn, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long và các khu vực ven biển Việt Nam.

4.1. Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử

Công nghệ marker-assisted selection sử dụng đa hình gen OsHKT1;4 để xác định các cây lúa mang kiểu gen tốt chịu mặn. Phương pháp PCR và giải trình tự DNA cho phép nhanh chóng genotyping hàng trăm cây lúa. Các marker phân tử liên kết với gen OsHKT1;4 giúp lược chọn những cây lúa lưỡng dị chịu mặn trong chương trình lai tạo. Điều này giảm thời gian và chi phí cần thiết để phát triển giống lúa chịu mặn mới.

4.2. Phát triển giống lúa chịu mặn mới

Mục tiêu của cải thiện lúa chịu mặn là tạo ra các giống lúa mới vừa năng suất cao vừa chịu mặn tốt. Sử dụng kiến thức về gen OsHKT1;4, các nhà l育種 có thể lai tạo các giống lúa từ những cha mẹ có gene tốt. Những giống lúa mới này có thể hòa mặn từ 4-6 dS/m, phục vụ nông dân ở các vùng đất mặn hiện nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu đến mã kết thúc. Exon: mầu trắng, intron: mầu xanh. Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron (b) So sánh kích thƣớc exon và intron tƣơng ứng ở 2 phân họ. Kích thƣớc exon ở 2 phân họ là tƣơng đƣơng nhau, trong khi kích thƣớc intron ở phân họ 1 dài hơn phân họ 2.

1 Dựa vào sự chọn lọc vận chuyển, HKTs đƣợc phân thành hai phân họ. Phân họ 1 chỉ vận chuyển Na+; trong khi phân họ 2 vận chuyển cả Na + và K+ (có vận chuyển đồng thời những ion này ở điều kiện cụ thể) hoặc chỉ vận chuyển Na + tại nồng độ Na+ cao. Gen HKT đƣợc xác định nằm trong locus tính trạng số lƣợng (quantitative trait loci - QLT), biểu hiện khác nhau về khả năng chịu mặn ở lúa mì [21; 23]. Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron.

Tuy nhiên, các gen thuộc phân họ 1 có tỷ lệ độ dài intron lớn hơn phân họ 2 (Hình 1. Ở điều kiện phát triển bình thƣờng, một số gen nhƣ TaHKT2;1, OsHKT2;1, OsHKT2;4 biểu hiện ở phần phụ của rễ (bao gồm lông rễ) và có thể thu thập Na + từ dung dịch đất vào trong rễ [46; 47; 75]. Tuy nhiên, chức năng quan trọng của HKTs còn đƣợc xác định trong việc hỗ trợ thực vật sống sót ở đất nhiễm mặn cao qua nhiều thí nghiệm bất hoạt gen này dẫn đến sự mẫn cảm của cây với điều kiện mặn [5; 17; 54] và thông qua sự chuyển gen HKT biểu hiện ở nhiều loài thực vật khác, ví dụ sự biểu hiện của AtHKT1;1 trong lúa cho phép cây phát triển tốt hơn trong điều kiện mặn [64]. Thí nghiệm này còn có ý nghĩa trong việc chuyển gen để nâng cao khả năng chịu mặn của cây trồng.

Họ protein HKT ở lúa Ở lúa có 9 gen thuộc họ HKT, đƣợc phân thành hai phân họ (Bảng 1. Phân họ I gồm OsHKT1;1 - OsHKT1;5, phân họ II gồm OsHKT2;1 - OsHKT2;4. Phân họ 1 có ái lực với Na+. OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus tính trạng số lƣợng SKC1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na + ở mô xylem rễ [49].

OsHKT1;1 có thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;2 là một gen giả, sản phẩm phiên mã của gen cũng đƣợc phân lập từ rễ cây lúa. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ. OsHKT1;4 đƣợc biểu hiện chính ở thân lá [28].

Các gen thuộc phân họ 2 đồng vận chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ hoặc K+. Một số gen biểu hiện ở cả trong vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na + trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô. Dƣới điều kiện stress mặn sự biểu hiện của những gen này sẽ đƣợc điều hòa giảm hoạt động. Ví dụ nhƣ ở protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ 1 vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30 mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc cho cây [33].

Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng đƣợc biểu hiện trong lá [43]. OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na + và K+. Cây lúa xử lý mặn ở 150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào diệp lục [43]. Các gen OsHKT2;3 / 4 Biểu hiện chủ yếu trong mô thân bẹ, ít biểu hiện ở rễ [29].

Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37] 1. Gen OsHKT1;4 Gen OsHKT1;4 nằm trên NST số 4, dài 5252 bp (Hình 1.6), với kích thƣớc khung đọc mở dài 1503 bp. Gen đƣợc biểu hiện chính ở thân lá [29], có vai trò loại ion Na+ ra khỏi mô quang hợp, một cơ chế quan trọng cho khả năng chịu mặn của cây trồng (Hình 1. Vị trí phân bố và kích thƣớc của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa (loci LOC_Os04g51830) http://rice.

Mô hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61] Gen OsHKT1;4 mã hóa cho một protein dài 500 axit amin, và có sự tƣơng đồng 99,8% giữa 2 giống lúa Pokkali và Nipponbare. Sự khác biệt duy nhất nằm trong một vị trí thay thế Arginine (R) thành Glutamine (Q) ở vị trí 110 đối với Pokkali. Mô hình cấu trúc protein OsHKT1;4 dự đoán rằng sự thay thế này nằm trong vòng loop ở mặt trong của màng tế bào, kết nối 2 chuỗi α-helices xuyên màng và không ảnh hƣởng đến tốc độ vận chuyển Na + của protein OsHKT1;4 [61]. Một dạng biến đổi sai khác cũng có thể tạo ra một protein có trình tự ngắn hơn 47 axit amin, trong đó khác nhau 19 axit amin ở vùng đầu C tận cùng (Hình 1.

Một axit amin Valine bảo tồn đƣợc tìm thấy ở vị trí 344 [61]. Mô hình phân tử dạng toàn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối luân phiên (B) của protein OsHKT1;4 [61] Vùng đầu C tận cùng có sai khác của dạng B đƣợc chỉ ra bằng mũi tên nhỏ. Các vị trí ion Na+ đƣợc biểu thị mầu tím, và gần trung tâm hoạt động. Vùng mầu đen là trình tự Ser-Gly-Gly-Gly.

Mũi tên đen đậm chỉ lỗ kênh. Một số phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình Cây lúa là cây lƣơng thực mẫn cảm với stress mặn. Các giống lúa sinh trƣởng trong các điều kiện khác nhau sẽ có các cơ chế chống chịu mặn khác nhau. Quá trình phức tạp này liên quan chặt chẽ tới mức độ biểu hiện của gen nhằm đáp ứng với các tín hiệu kích thích từ môi trƣờng.

Sự đa hình trình tự mã hóa của gen và vùng trình tự promoter có thể dẫn đến mức độ biểu hiện gen khác nhau ở các giống lúa khác nhau. Việc phân tích đa hình di truyền các gen là một trong những bƣớc đầu tiên để đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở các giống lúa. Phƣơng pháp PCR và PCR-RFLP PCR (Polymerase Chain Reaction) là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980. Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng của DNA polymerase (DNA pol) để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với trình tự khuôn DNA ban đầu.

Enzym này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ việc gắn thêm một 2 nucleotide vào nhóm chức 3’ - OH tự do của nucleotide trƣớc đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’ - OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi. Yêu cầu này dẫn đến có thể khuếch đại một vùng gen mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR. Các enzym này có thể sử dụng để sao chép bất kỳ phân đoạn axit nucleic quan tâm bằng phản ứng PCR. Sự kết hợp của phƣơng pháp PCR và giải trình tự sản phẩm PCR sẽ giúp xác định đƣợc chính xác trình tự và các vị trí đa hình trên vùng gen quan tâm.

Phƣơng pháp này rất hiệu quả, chính xác, tiết kiệm thời gian, ít chi phí. Phƣơng pháp PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA bằng enzym cắt giới hạn. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sẽ cho ta biết đƣợc sự đa hình đoạn DNA phân tích. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là không tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide.

Tuy nhiên, nhƣợc điểm là không xác định đƣợc chính xác trình tự gen và vị trí đa hình. Do mỗi enzym giới hạn chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ không phân tích đƣợc các gen đa hình cao, không thích hợp cho phân tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzym cắt. Phƣơng pháp giải trình tự Kỹ thuật giải trình tự đã trở thành công cụ quan trọng trong rất nhiều lĩnh vực khoa học nhƣ khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền, công nghệ sinh học, khoa học pháp y, sinh học phân tử… Theo thời gian, các kỹ thuật ngày càng đƣợc phát triển để đáp ứng với các yêu cầu chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao, giá rẻ,… Phương pháp Sanger và các phương pháp enzym khác Phƣơng pháp giải trình tự DNA đầu tiên đƣợc mô tả bởi Sanger và Coulson đƣợc gọi là phƣơng pháp “cộng và trừ” [73]. Phƣơng pháp này sử dụng DNA pol từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 [25; 26] với các nucleoside triphosphate khác nhau.

Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase đƣợc điện 2 di trên gel acrylamide. Do sự không hiệu quả của phƣơng pháp này, nên 2 năm sau đó ông và cộng sự đã mô tả một phƣơng pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzym [74]. Phƣơng pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và đƣợc biết đến nhƣ phƣơng pháp Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một enzym xúc tác phản ứng trùng hợp các triphosphate deoxynucleotide (dNTP) bổ sung với các mẫu DNA quan tâm.

Phản ứng sẽ đƣợc kéo dài cho đên khi các enzym kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp. Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc (Hình 1. Các phƣơng pháp giải trình tự bằng enzym khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu di truyền. Trong đó 2 hƣớng tiếp cận đƣợc sử dụng nhiều nhất là shotgun sequencing và walking primer sequencing [32].

Giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger Phương pháp Maxam - Gibert và các phương pháp hóa học khác. Phƣơng pháp giải trình tự bằng phƣơng pháp hóa học đƣợc mô tả đầu tiên bởi Maxam và Gilbert (1977) [55]. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thƣớc khác nhau. DNA đƣợc đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hiện hình phóng xạ.

Xử lí hóa học đặc hiệu giúp phân hủy một loại nucleotide của mạch 2 DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide, sản phẩm đƣợc điện di trên gel polyacriamide để xác định trình tự mạch đơn. Tuy nhiên, việc sử dụng các nhãn phóng xạ là gây nguy hiểm nên sau đó đƣợc thay thế bằng một số phƣơng pháp khác nhƣ đánh dấu nhãn huỳnh quang [2], phân tử chỉ thị hóa học biotin hoặc bằng enzym phản ứng mầu [71]. Pyrosequencing Đây là phƣơng pháp giải trình tự dựa trên sự phát hiện các pyrophosphat (PPi) đƣợc giải phóng trong phản ứng chuỗi trùng hợp DNA [72].