Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Đỗ thế dương nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân

Khóa luận nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin bao acid folic, ứng dụng công nghệ nano trong điều trị ung thư hiệu quả.

• Tác giả: Đỗ Thế Dương
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Ngọc Chiến
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Bào Chế Hệ Tiểu Phân Nano Dihydroartemisinin Bao Acid Folic
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano Dihydroartemisinin

Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano Dihydroartemisinin (DHA) của Đỗ Thế Dương là một công trình khoa học quan trọng được thực hiện tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2018. Đây là khóa luận tốt nghiệp dược sĩ tập trung vào việc phát triển công nghệ bao acid folic (FA) để cải thiện hiệu quả dược học của DHA. Nghiên cứu này sử dụng chất mang PLGA (Poly lactic-co-glycolic acid) như một polymer sinh thân tính, kết hợp với polyvinyl alcohol (PVA) làm chất bao phủ và acid folic như tác nhân hướng đích. Mục tiêu chính của công trình là tối ưu hóa công thức bào chế nhằm tăng hiệu suất mang thuốc (EE) và khả năng nạp thuốc (LC), đồng thời cải thiện khả năng nhận biết của các tế bào ung thư thông qua các thụ thể folat.

1.1. Dihydroartemisinin và ứng dụng trong điều trị

Dihydroartemisinin là một dược chất có hoạt tính sinh học mạnh, được sử dụng trong điều trị sốt rét và các bệnh ký sinh trùng. Tuy nhiên, DHA có độ hòa tan thấp trong nước, dẫn đến sinh khả dụng kém. Việc phát triển hệ tiểu phân nano giúp cải thiện dược động học và tăng hiệu quả trị liệu. Công nghệ bào chế hệ nano cho phép giảm kích thước hạt, tăng diện tích tiếp xúc và cải thiện khả năng hấp thu của dược chất.

1.2. Ý nghĩa của acid folic trong hướng đích

Acid folic (FA) được sử dụng như tác nhân hướng đích vì thụ thể folat được biểu hiện cao trên bề mặt các tế bào ung thư. Khi bao FA lên bề mặt hệ tiểu phân nano, nó cho phép nhận biết chọn lọc các tế bào mục tiêu. Điều này tăng hiệu quả điều trị và giảm tác dụng phụ trên các tế bào bình thường, mang lại tiến bộ lớn trong công nghệ dược phẩm.

II. Nguyên liệu và phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA PLGA PVA FA

Công trình nghiên cứu của Đỗ Thế Dương sử dụng các nguyên liệu chất lượng cao bao gồm PLGA (polymer chính), PVA (chất bao phủ), dihydroartemisinin (dược chất), acid folic, dicyclohexyl carbodiimide (DCC), 4-dimethylamino pyridin (DMAP) và dung môi hữu cơ. Phương pháp bào chế sử dụng kỹ thuật phân tán siêu âm kết hợp để tạo ra hệ tiểu phân nano ổn định. Các yếu tố công thức bao gồm nồng độ chất diện hoạt, lượng dược chất, tỷ lệ PVA-FA/PLGA được khảo sát chi tiết. Phương pháp định lượng HPLC được sử dụng để xác định hiệu suất mang thuốc (EE) và khả năng nạp thuốc (LC) của các công thức.

2.1. Chất mang PLGA và tính chất của polymer

PLGA là một polymer sinh thân tính được FDA phê duyệt, có khả năng phân hủy theo thời gian. Tính chất chính bao gồm khả năng hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ, độ tương thích sinh học cao, và khả năng mang thuốc tốt. PLGA giúp bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy trong quá trình lưu trữ và vận chuyển đến tế bào mục tiêu, tạo ra lợi ích lâu dài cho hệ thống.

2.2. Phương pháp siêu âm và tối ưu hóa công thức

Kỹ thuật siêu âm được lựa chọn vì khả năng tạo ra hạt nano nhỏ đồng nhất. Các yếu tố quy trình như năng lượng siêu âm và thời gian xử lý được khảo sát và tối ưu. Kết quả cho thấy tăng năng lượng giúp giảm kích thước tiểu phân nhưng vượt quá ngưỡng nhất định dẫn đến bất ổn định. Thời gian siêu âm tối ưu được xác định để đạt hiệu suất mang thuốc cao nhất.

III. Kết quả nghiên cứu và đặc tính tiểu phân nano

Các kết quả nghiên cứu cho thấy hệ tiểu phân nano DHA-PLGA-PVA-FA được bào chế thành công với các đặc tính tối ưu. Kích thước tiểu phân trung bình (KTTP) của công thức tốt nhất nằm trong khoảng nano (dưới 1000 nm), với chỉ số đa phân tán (PDI) thấp, cho thấy hạt có kích thước đồng nhất. Hiệu suất mang thuốc (EE) đạt được trên 85%, chứng tỏ khả năng mang dược chất tốt. Việc xác định FA trên bề mặt tiểu phân bằng phổ FT-IR và phương pháp UV-VIS xác nhận sự có mặt của acid folic, đảm bảo hoạt tính hướng đích.

3.1. Hiệu suất mang thuốc và khả năng nạp thuốc

Hiệu suất mang thuốc (EE) đại diện cho phần trăm dược chất được bao chứa trong hệ tiểu phân. Công thức tối ưu đạt EE vượt 85%, cho thấy đa số DHA được bảo vệ bên trong PLGA. Khả năng nạp thuốc (LC) biểu thị lượng dược chất so với tổng khối lượng của hệ thống. Kết quả cao cho thấy công thức được thiết kế hiệu quả, với tỷ lệ thích hợp giữa PLGA và DHA.

3.2. Tính chất hóa lý của hệ tiểu phân

Phương pháp FT-IR xác nhận sự tương tác giữa các thành phần, trong khi phương pháp UV-VIS chứng minh sự có mặt của FA. Phân tích kích thước hạt bằng kỹ thuật phân tán ánh sáng động cho thấy kích thước ổn định qua thời gian. Độ ổn định của hệ tiểu phân được đánh giá ở các điều kiện khác nhau (nhiệt độ, độ ẩm), xác nhận tính bền vững của công thức phát triển.

IV. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng tiềm năng

Khóa luận tốt nghiệp của Đỗ Thế Dương mang ý nghĩa khoa học lớn trong công nghệ dược phẩm hiện đại. Sự kết hợp hệ tiểu phân nano DHA với acid folic hướng đích tạo ra một hệ thống mang thuốc thông minh, có khả năng nhận biết chọn lọc tế bào bệnh lý. Điều này mở đường cho phát triển các thuốc chữa bệnh ung thư và bệnh ký sinh trùng hiệu quả hơn. Công nghệ này có thể được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, tạo ra các sản phẩm với an toàn cao và hiệu quả điều trị tốt. Kết quả nghiên cứu đóng góp kiến thức quý báu cho cộng đồng khoa học và y tế công cộng.

4.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Hệ tiểu phân nano với acid folic hướng đích có tiềm năng cao trong điều trị ung thư. Do thụ thể folat được biểu hiện cao trên tế bào ung thư, hệ thống có thể gửi trực tiếp dược chất tới tế bào ác tính, giảm tác dụng phụ trên mô lành. Điều này cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân và tăng hiệu quả điều trị.

4.2. Hướng phát triển và công nghệ tương lai

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng mới cho phát triển công nghệ mang thuốc tiên tiến. Các công trình tiếp theo có thể kết hợp với các dược chất khác, sử dụng polymer mới, hoặc tối ưu hóa thêm các yếu tố công thức. Ứng dụng công nghệ nano trong dược phẩm sẽ tiếp tục phát triển, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng DHA tiêu diệt và ức chế hiệu quả sự phát triển của tế bào ung thư. Mặc dù vậy, DHA ít tan trong nước, có sinh khả dụng thấp khi dùng đường uống, bị phân hủy trong dịch dạ dày - ruột, và có thời gian bán thải rất ngắn [37]. Do đó cần phát triển một dạng bào chế nhằm làm tăng độ hòa tan, bảo vệ dược chất, tăng tác dụng hướng đích của DHA. Nano polyme là dạng bào chế có nhiều ưu điểm như tăng độ tan của dược chất, bảo vệ dược chất và tăng thời gian lưu thuốc trong hệ tuần hoàn.

Các polyme hay được sử dụng để bào chế nano như poly (acid lactic-co-glycolic), poly acid lactic, poly acid glycolic …nhờ tính tương thích sinh học cao, khả năng phân hủy sinh học và tính an toàn đã được FDA (Mỹ) chấp thuận. Do đó, khi tổng hợp được PVA và FA, gắn phức hợp lên tiểu phân nano PLGA làm tăng tác dụng hướng đích trong điều trị các tế bào ung thư, cải thiện sự hấp thu của dược chất, ít gây hại cho tế bào lành và tăng khả năng thấm, đồng thời kéo dài thời gian lưu của thuốc trong tuần hoàn chung. Từ những đặc điểm trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin bao acid folic” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao phức hợp PVA- FA.

Đánh giá được một số đặc tính và xác định sự có mặt của FA trên tiểu phân nano đã bào chế được. TỔNG QUAN 1. Tổng quan về dihydroartemisinin 1. Tính chất lý, hóa Hình 1.1: Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin Công thức phân tử của DHA: C15H24O5.

Tên khoa học (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl- 3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol. Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol. DHA là chất chuyển hóa chính có hoạt tính của các dẫn xuất artemisinin, DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước và trong dầu. DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform.

Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, DHA bị thủy phân mạnh nhưng bền vững trong môi trường trung tính ngoài ra DHA cũng không bền với nhiệt. Năng suất quay cực [α] = 140-146 (C =1,0026 trong cloroform). C12 là một cacbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung dịch thì tồn tại cả 2 dạng.

Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150C [3]. Tác dụng dược lý Trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng DHA tiêu diệt và ức chế hiệu quả sự phát triển của tế bào ung thư [16], [22]. DHA ít tan trong 2 nước và sinh khả dụng thấp khi dùng đường uống vì thuốc tan chậm và có thể bị phân hủy bởi dịch dạ dày ruột. Thời gian bán thải của DHA rất ngắn (34-90 phút) [35], [36].

DHA là chất bán tổng hợp và chuyển hóa từ artemisinin đã được nghiên cứu với hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư. Cơ chế thứ nhất nhờ việc tạo ra các gốc tự do thông qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R), cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và nước, dẫn đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton. Hai cơ chế chống ung thư đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể. Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và ADN, gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [31].

Dược động học Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm: DHA hấp thu qua đường uống, tỷ lệ liên kết với protein huyết tương là 50%. DHA phân bố đến khắp các cơ quan, đặc biệt phân bố nhanh đến gan và tim. DHA phân bố đến hồng cầu bị nhiễm P. falciparum cao hơn so với hồng cầu bình thường.

DHA thải trừ nguyên dạng qua nước tiểu (82,7%) và một phần qua phân. Khi dùng DHA đồng thời với các thuốc khác có tỷ lệ liên kết với protein huyết tương cao nhận thấy độc tính không tăng lên. Nghiên cứu trên cơ thể người: DHA hấp thu qua đường uống với liều 1,1 mg/kg và 2,2 mg/kg, nồng độ trong huyết tương cao nhất đạt được sau 1,33 giờ và t1/2 là 1,57- 1,63 giờ [9]. Định lượng DHA Theo Dược điển Trung Quốc 2010, DHA nguyên liệu được định lượng bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột C18, pha động ACN : nước = 60:40, bước sóng phát hiện 210 nm.

Hòa tan 1 lượng DHA và artemisinin chuẩn vào pha động sao cho thu được 1 dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Tiêm 20 µl vào cột sắc ký C18. DHA thể hiện 2 pic, độ phân giải giữa pic artemisinin và pic DHA không thấp hơn 2,0, số đĩa lý thuyết không thấp hơn 6000 được tính với pic tham khảo của DHA. Sau đó cân chính xác 25 mg mẫu thử, hòa tan vào pha động trong bình định mức 25 ml và pha loãng tới vạch.

Tiêm 20 µl vào cột sắc ký trong 8 giờ và ghi sắc ký đồ. Lặp lại thao tác với DHA chuẩn. Tính toán hàm lượng DHA dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn. Với viên nén chứa DHA, Dược điển Trung Quốc 2010 định lượng theo phương pháp đo UV, đo độ hấp thụ tại bước sóng 238 nm, với mẫu trắng là dung dịch hỗn hợp 3 natri hydroxid 2%: ethanol = 4:1.

Tính toán hàm lượng DHA bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn cùng nồng độ. Ngoài Dược điển Trung Quốc 2010 hướng dẫn định lượng DHA còn rất nhiều các nghiên cứu của các tác giả định lượng DHA, có thể kể ra một số nghiên cứu sau.1: Một số các nghiên cứu định lượng DHA Phương Tên các Đối tượng pháp định Điều kiện định lượng nghiên cứu định lượng lượng Nghiên cứu Nano DHA HPLC - Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu của Zhang và sử dụng chất năng cao LC-20A của Shimadzu cộng sự [35]. mang thân - Detector SPD-20MA lipid Thiết bị loại khí DGU-20A3 - Sử dụng cột C18 (4,6mm x 150mm x 5µm) - Pha động bao gồm ACN: 0,02 mol/l amoni sulfat:12% triethylamin = 100:100:0,15(v/v/v). - Tốc độ dòng 1ml/phút - Bước sóng phát hiện 213 nm - Nhiệt độ chạy sắc ký 30C - Thể tích tiêm mẫu là 50µl.

Nghiên cứu DHA trong Chuẩn độ - Dựa trên phản ứng của DHA với của Attih EE viên nén iod kali iod (1:1), iod giải phóng được và cộng sự [6]. hoặc trong chuẩn độ bằng dung dịch natri thuốc bột thiosulfat với chỉ thị hồ tinh bột - Phạm vi định lượng 5-70 mg DHA Nghiên cứu Viên nén Quang phổ - Tạo phản ứng giữa dung dịch của Babalola DHA UV sử dụng methanol của DHA và p-nitroanilin và cộng sự [8]. p-nitroanilin trong môi trường acid HCl 1M ở làm tác nhân nhiệt độ cao và thời gian phản ứng tạo dẫn xuất ngắn, tỷ lệ giữa DHA: p-nitroanilin là 2:1. 4 - Đo độ hấp thụ của sản phẩm tại bước sóng 290 nm.

Zhu Kai và DHA và HPLC - Cột C18 (250 mm x 4,6mm x 5µm) cộng sự [37]. piperaquin - Pha động gồm: ACN:methanol: phosphat 0,02 mol/lít amoni sulfat = 50:10:40 trong viên (v/v/v) nén - Tốc độ dòng 1 ml/phút - Bước sóng phát hiện 210nm - Nhiệt độ chạy sắc ký 30C. Vài nét về chất mang PLGA 1. Cấu trúc Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau, dime vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic.

Các PLGA khác nhau bởi tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA 75:25 chứa 75% acid lactic và 25% acid glycolic [32].2: Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA 1. Tính chất, ứng dụng PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng trong liệu 5 pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư. PLGA phân hủy sinh học bằng thủy phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic. Cả hai được chuyển hóa qua chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc tính thấp.

Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA (poly acid glycolic). Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và thủy phân chậm hơn. Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất. Ngoài ra, sự phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng dược chất, loại dược chất [32].

Một số hạn chế khi sử dụng PLGA Khi sử dụng PLGA làm chất mang sự giải phóng dược chất trải qua hai giai đoạn, trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình hòa tan và ăn mòn ở bề mặt. Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu quả điều trị và tăng tác dụng phụ. Do đó, nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi các đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA đã được thực hiện như bao tiểu phân với polyme thân nước (PEG, chitosan) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu phân thân nước có khả năng tuần hoàn trong máu lâu hơn và bị tích lũy ở gan ở mức độ tối thiểu [32]. Vài nét về FA, thụ thể của FA 1.

Acid folic Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acid folic Tính chất: Bột kết tinh màu hơi vàng, không mùi, không tan trong nước lạnh, tan tốt trong kiềm, acid, nhiệt độ nóng chảy 250C. Acid folic dễ bị phân hủy mất hoạt tính dưới tác dụng của ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử, acid, kiềm hoặc khi đun nóng. Thụ thể của FA Các thụ thể folat (FR) thuộc về một họ protein liên kết acid folic có ái lực cao, được mã hóa bởi ba gen khác nhau , ,  và nằm trên nhiễm sắc thể 11. Các thụ thể folat hoàn chỉnh tương tự những protein mà chứa 229-236 amino acid với trọng lượng phân tử 38-40 kDa [13].

FR và FR được gắn trên màng tế bào bằng glycosyl phosphatidyl inositol (GPI). Trong khi đó FR là một protein liên kết gắn với folat hòa tan được tiết ra khi glycosylphosphatidylinositol có sự biến đổi [18].