Đồ án tốt nghiệp khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp cs1b và ứng dụng trong bảo quản nông sản

Đồ án nghiên cứu tốt nghiệp khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của bacillus spp cs1b và ứng dụng trong bảo, thiết kế chi tiết, tính toán kỹ thuật theo tiêu chuẩn, đánh giá

• Tác giả: Trịnh Thị Cẩm Tú
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của Bacillus spp. (CS1b) và ứng dụng trong bảo quản nông sản
• Loại tài liệu: đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Các nấm gây hại trên hạt
• 1.1.1. Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc
• 1.1.2. Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch
• 1.1.3. Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch
• 1.1.4. Độc tố của nấm
• 1.2. Các phương pháp kháng nấm gây bệnh cho nông sản
• 1.2.1. Kháng nấm bằng phương pháp hóa học
• 1.2.2. Kháng nấm bằng phương pháp sinh học
• 1.2.3. Một số vi sinh vật điển hình có khả năng đối kháng nấm gây bệnh trong nông sản
• 1.2.3.1. Nấm Trichoderma spp
• 1.2.3.2. Bacillus subtilis spp.
• 1.3. Cơ chế kháng nấm của vi khuẩn
• 1.3.1. Cấu tạo thành tế bào của một số nấm gây hại nông sản
• 1.3.2. Cơ chế tác động của một số enzyme ngoại bào
• 1.3.3. Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất
• 1.3.4. Một số phương pháp thu enzyme và hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn
• 1.3.5. Một số nghiên cứu ứng dụng màng bao trong bảo quản hạt
• 1.3.6. Một số nghiên cứu nước ngoài ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp
• 1.3.7. Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng hợp chất thứ cấp của Bacillus spp
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất
• 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2.2. Môi trường - Hóa chất
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Bố trí thí nghiệm và phương pháp
• 2.4.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm
• 2.4.2. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sản xuất sinh khối nấm Aspergillus sp. CĐP1 làm cảm ứng hợp chất kháng nấm cho vi khuẩn Bacillus sp.
• 3.1.1. Xác định thời gian nuôi cấy để khả năng đối kháng nấm CĐP1 cực đại
• 3.1.1.1. Dịch nuôi cấy sau ly tâm
• 3.1.1.2. Dịch nuôi cấy sau ly tâm xử lý nhiệt
• 3.1.1.3. So sánh khả năng đối kháng dịch nuôi cấy sau ly tâm với nấm CĐP1 của dịch nuôi cấy CS1b ở từng thời gian nuôi cấy và điều kiện xử lý nhiệt
• 3.1.2. Khảo sát khả năng đối kháng nấm của protein kết tủa từ dịch nuôi cấy vi khuẩn CS1b sau ly tâm
• 3.1.2.1. Quy trình thu hồi protein kết tủa có hoạt tính sinh học
• 3.1.2.2. Định tính enzyme protease, chitinase, 𝜷-glucanase của protein kết tủa
• 3.1.2.3. Khảo sát khả năng đối protein kết tủa với CĐb1
• 3.1.2.4. Khảo sát khả năng đối kháng cao ethyl acetate với CĐb1
• 3.1.2.4.1. Quá trình thu cao EA
• 3.1.3. Khảo sát sự ức chế của cao EA với nấm CĐP1
• 3.1.4. Khảo sát thành phần hóa học của các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Bacillus sp. CS1b có hoạt tính kháng nấm
• 3.1.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm trong bảo quản hạt
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU KHÁM KHẢO VÀ PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU KHÁM KHẢO

Tóm tắt

I. Khả năng kháng nấm của Bacillus spp CS1b

Khả năng kháng nấm của Bacillus spp CS1b được nghiên cứu kỹ lưỡng trong đồ án tốt nghiệp này. Bacillus spp là một chủng vi khuẩn có tiềm năng lớn trong việc ức chế sự phát triển của nấm sinh aflatoxin, đặc biệt là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b đã được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc, giảm thiểu nguy cơ nhiễm aflatoxin trong nông sản. Nghiên cứu này không chỉ tập trung vào việc khảo sát khả năng kháng nấm mà còn hướng đến việc ứng dụng các sản phẩm này trong bảo quản nông sản, đặc biệt là hạt đậu phộng.

1.1. Cơ chế kháng nấm

Cơ chế kháng nấm của Bacillus spp CS1b được xác định thông qua việc sản xuất các enzyme như protease, chitinase, và β-glucanase. Các enzyme này có khả năng phá hủy thành tế bào của nấm, ức chế sự phát triển của chúng. Ngoài ra, Bacillus spp CS1b còn sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm mạnh, giúp ngăn chặn sự hình thành aflatoxin. Các kết quả thí nghiệm cho thấy dịch nuôi cấy của Bacillus spp CS1b có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus sp. với tỷ lệ đối kháng lên đến 70%.

1.2. Ứng dụng trong bảo quản nông sản

Ứng dụng Bacillus trong nông nghiệp đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả để bảo quản nông sản. Các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b được sử dụng để tạo màng bao bảo vệ hạt đậu phộng, ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc và giảm thiểu nguy cơ nhiễm aflatoxin. Phương pháp này không chỉ an toàn mà còn thân thiện với môi trường, thay thế cho các phương pháp hóa học truyền thống. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt đậu phộng được bảo quản bằng phương pháp này có tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể so với các phương pháp khác.

II. Aflatoxin và tác hại đối với nông sản

Aflatoxin là một trong những độc tố nguy hiểm nhất được sản xuất bởi các loài nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Độc tố này có khả năng gây ung thư gan, quái thai, và thậm chí tử vong ở người và động vật. Nông sản nhiễm aflatoxin không chỉ gây hại cho sức khỏe mà còn làm giảm giá trị kinh tế của sản phẩm. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm hiểu cơ chế gây độc của aflatoxin và các phương pháp để giảm thiểu sự nhiễm độc này trong nông sản.

2.1. Cơ chế gây độc của aflatoxin

Aflatoxin gây độc thông qua việc liên kết với DNA trong nhân tế bào, ức chế quá trình tổng hợp RNA và protein. Điều này dẫn đến sự rối loạn trong quá trình tăng trưởng và phát triển của tế bào, gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư gan. Ngoài ra, aflatoxin còn gây tổn thương gan, thận, và ống tiêu hóa, làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cơ thể. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng aflatoxin B1 là dạng độc tố nguy hiểm nhất, có khả năng gây ung thư cao.

2.2. Tình trạng nhiễm aflatoxin ở Việt Nam

Ở Việt Nam, với điều kiện khí hậu nóng ẩm, nông sản như đậu phộng và ngô thường bị nhiễm aflatoxin ở mức độ cao. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức độ nhiễm aflatoxin trong bánh dầu đậu phộng có thể lên đến 5000 ppb, vượt xa giới hạn cho phép. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các phương pháp hiệu quả để giảm thiểu sự nhiễm độc này, đảm bảo nông sản an toàn cho người tiêu dùng.

III. Phương pháp bảo quản nông sản

Bảo quản nông sản là một vấn đề quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc và sự nhiễm aflatoxin. Nghiên cứu này đề xuất việc sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b như một phương pháp bảo quản sinh học hiệu quả. Phương pháp này không chỉ giúp giảm thiểu sự nhiễm nấm mà còn đảm bảo nông sản an toàn cho người tiêu dùng.

3.1. Bảo quản bằng phương pháp sinh học

Bảo quản sinh học bằng cách sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b đã được chứng minh là một phương pháp hiệu quả. Các sản phẩm này có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc, giảm thiểu nguy cơ nhiễm aflatoxin. Phương pháp này không chỉ an toàn mà còn thân thiện với môi trường, thay thế cho các phương pháp hóa học truyền thống. Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt đậu phộng được bảo quản bằng phương pháp này có tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể so với các phương pháp khác.

3.2. Ứng dụng màng bao chitosan

Ngoài việc sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b, nghiên cứu còn đề xuất việc sử dụng màng bao chitosan để bảo quản hạt đậu phộng. Chitosan là một hợp chất tự nhiên có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, giúp ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc. Kết hợp với các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus spp CS1b, màng bao chitosan đã chứng minh hiệu quả cao trong việc bảo quản nông sản, đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nấm gây hại trên hạt 1.1 Tình trạng nhiễm nấm gây hại trên hạt ngũ cốc Thế giới Sự nhiễm nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13 % số mẫu lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan Mạch 19 trên 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8 % số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin.

Ở Mỹ có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy sự nhiễm vomitoxin ( DON) ở mức 1000 ppb. Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore ( Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu có ochratoxin và vomitoxin ( DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại là aflatoxin và fumonisin.

Việt Nam Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phộng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi tường thích hợp cho nấm phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và Penicillium.

Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin, rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con. 4 Đồ án tốt nghiệp Riêng ở các trại gà giống độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu đậu phộng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phộng 1200 ppb ( tối đa 5000 ppb), trong bắp 205 ppb ( tối đa 600 ppb).

Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh đầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50 ppb.2 Tình trạng nhiễm nấm trước thu hoạch Trong khi cây lương thực đang phát triển ngoài đồng hay sau khi thu hoạch nhưng trước khi hạt được đập tuốt bị các nấm mốc này xâm nhập. Tùy từng loại ngũ cốc, vùng địa lý, thời tiết mà các nấm mốc này phát triển nhiều hay ít. Các loại lúa mì, lúa gạo, đại mạch, kiều mạch, và ngô thường nhiễm các loại nấm ngoài đồng như Alternaria, Cladosporium, Helininthosporium và Furarium. Tất cả các nấm ngoài đồng đòi hỏi độ ẩm cao ở hạt để phát triển.

Độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối 90% hay hơn nữa là điều kiện cho nấm phát triển. Các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua nhiều năm ở hạt khô, nhưng chết tương đối nhanh ở các hạt có độ ẩm ở trạng thái cân bằng với độ ẩm tương đối trên 70%, ở các hạt ngũ cốc giàu tinh bột, điều này có nghĩa độ ẩm trên 14%. Tóm lại, các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng đến bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước thu hoạch có thể phát hiện bằng phương pháp giám định thông thường và nó không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản.3 Tình trạng nhiễm nấm sau thu hoạch Theo Christensen [1] các nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, trong đó có năm loài phổ biến.

Một số loài Penicillium, các loài riêng lẻ của Sporendonema và một số loài nấm men cũng có thể có ở giai đoạn này. Những loài này có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có độ ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 70% - 90%. Đa 5 Đồ án tốt nghiệp số các nấm này thường ở trên các nguyên liệu giàu các chất hữu cơ và vô cơ, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới và nhiễm trên tất cả các hạt lương thực và hạt giống.

Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 300C - 320C và tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Một vài chủng của nhóm A.glaucus phát triển chậm ở nhiệt độ 100C – 150C. Một vài loài Aspergillus đề kháng với khô cạn, nó có thể phát triển ở vài độ dưới điểm đóng băng.4 Độc tố của nấm Một số loại độc tố của nấm Độc tố nấm còn gọi là mycototoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá, gia cầm. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái ( Morrau 1974) [2].

Những điều kiện đó là vùng sinh thái, khí hậu nhiệt độ, độ ẩm của không khí, lượng nước có trong cơ chất… Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại của kiểu gen ( genotype) và điều kiện phát triển của chúng ( Scheoedes và Ashworth). Độc tố nấm là sản phẩm phụ tiết ra trong quá trình chuyển hóa. Cho đến nay, trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên cứu. Một loại độc tố có thể do nhiều loài nấm khác nhau sản sinh và một loại nấm có thể đồng thời sản sinh ra nhiều loại độc tố.

Điều đáng chú ý là có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng thường liên quan đến an toàn thực phẩm và được tạo bởi năm chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Furarium, Alternaria, Claviceps. ❖ Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), sterimatocystin, acid cyclopianzoic. 6 Đồ án tốt nghiệp ❖ Các độc tố của Penicillium: patulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A, acid cyclopianzoic toxin, diacetocyscirpenol, fumonisin, moniliformin. ❖ Các độc tố của Furarium: deoxynivalenol, nivalenol, zearalenon, T-2 toxin.

❖ Các độc tố của Alternaria: acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. ❖ Các độc tố của Claviceps: các alkaloid Ergot.[1] Những số liệu có giá trị về mycotoxin và các bệnh do mycotoxin đã thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Các nghiên cứu trên độc vật thực nghiệm cho thấy độc tính của mycotoxin rất lớn. Hầu hết các sản phẩm thực vật có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo.

Vì thế nó tạo khả năng không những cho sự nhiễm trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào nguồn sữa, thịt. Độc tố Aflatoxin: Cơ chế gây độc của Aflatoxin Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA.

Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng α, β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào. Để có thể gây độc với tế bào gan cũng như tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan, hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm 7 Đồ án tốt nghiệp dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính.

Độc tính của Aflatoxin Theo Dương Thanh Liêm (2002) [1], aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau:  Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng.

Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể.  Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng.

 Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn.  Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú.

 Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản.  Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn.  Làm thay đổi thành phần dinh dưỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dưỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển.  Làm giảm thấp sự sinh trưởng và giá trị kinh tế của vật nuôi.

Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi. 8 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Ảnh hưởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi.14 12 Trung bình Bình thường (20 – 70 kg) 0.41 12 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.41 20 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.69 7 Trung bình Bình thường (70 – 100 kg) Lợn nái 0.3 4 Rõ Suy giảm và (có chửa) 0.55 4 một số con chết Gà tây 0.25 4 Rõ Chậm phát (1 ngày tuổi) triển và giảm trọng lượng Gà tây 0.2 7 Nhẹ Giảm trọng (1 ngày tuổi) 0.42 7 Nhẹ lượng trong 3 0.03 4 Đặc điểm điển Giảm trọng (7 ngày tuổi) hình nhiễm lượng, chết aflatoxin 50% Bê 0.2 16 Trung bình Giảm trọng 9 Đồ án tốt nghiệp (4 ngày tuổi) lượng từ 0 – 3 tháng Bò sữa 15 4 Trung bình Giảm lượng sữa Aflatoxin M1 có mặt trong sữa.