Nghiên cứu phương pháp định tính và định lượng Lignan trong Ngũ vị tử Ngọc Linh

Luận văn thạc sĩ dược học nghiên cứu, xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời một số lignan quan trọng trong Ngũ vị tử Ngọc Linh.

• Tác giả: Nguyễn Đình Quân
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính và định lượng một số lignan trong Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehder & E. Wilson)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Ngũ vị tử Ngọc Linh và các thành phần Lignan

Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehder & E. Wilson) là một loài thực vật quý hiếm thuộc họ Schisandraceae, được tìm thấy chủ yếu ở vùng Tây Nguyên Việt Nam. Cây này có giá trị dược liệu cao nhờ chứa nhiều lignan, một nhóm hợp chất hữu cơ quan trọng với tác dụng dược lý đa dạng. Schisandrin (SC), gomisin B (GB) và schisandrin A (SA) là ba lignan chính được tìm thấy phổ biến nhất trong dược liệu này. Các lignan này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng và hiệu lực dược phẩm từ Ngũ vị tử. Sự định tính và định lượng lignan chính xác là cần thiết để đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng và an toàn trong kiểm nghiệm dược phẩm.

1.1. Đặc điểm thực vật của Ngũ vị tử Ngọc Linh

Ngũ vị tử Ngọc Linh là cây leo nhiều năm với lá đơn, mọc so le trên thân. Quả của cây có hình tròn, màu đỏ tươi khi chín, chứa từ 1-2 hạt. Cây được sử dụng trong y học cổ truyền Đông Á từ hàng ngàn năm nay. Nó được trồng chủ yếu ở các khu vực núi cao, khí hậu mát mẻ. Dược liệu được sử dụng chủ yếu là quả của cây, được sấy khô để bảo quản. Dược liệu này có vị chua, mặn, ngọt và được coi là một trong những dược liệu quý của Y học cổ truyền Việt Nam.

1.2. Thành phần hóa học và vai trò của Lignan

Thành phần hóa học của Ngũ vị tử Ngọc Linh rất phong phú, trong đó lignan là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất. Ba lignan chính là schisandrin, gomisin B và schisandrin A có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Ngoài lignan, dược liệu còn chứa dầu bay hơi, polysaccharide và các vitamin. Sự có mặt của các lignan này quyết định chất lượng và giá trị dược phẩm, vì vậy định lượng lignan chính xác là rất quan trọng.

II. Phương pháp định tính Lignan bằng Sắc ký lớp mỏng TLC

Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography) là phương pháp định tính đầu tiên được sử dụng để phát hiện sự có mặt của schisandrin, gomisin B và schisandrin A trong Ngũ vị tử Ngọc Linh. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp, rất phù hợp cho công tác kiểm nghiệm. Quá trình định tính bao gồm chuẩn bị mẫu, chọn pha tĩnh, pha động phù hợp và phát hiện các điểm lignan trên bản TLC. Hệ dung môi pha động được khảo sát kỹ lưỡng để đạt độ phân tách tốt nhất. Giới hạn phát hiện của phương pháp TLC được xác định để đánh giá độ nhạy. Phương pháp này là bước cơ sở quan trọng trước khi thực hiện định lượng bằng các phương pháp tiên tiến hơn.

2.1. Khảo sát hệ dung môi pha động

Hệ dung môi pha động là yếu tố quyết định đạt được độ phân tách tối ưu giữa các lignan. Các hệ dung môi khác nhau được khảo sát như ethyl acetate - hexane, toluene - ethanol với các tỷ lệ khác nhau. Mục tiêu là làm cho ba lignan chính (schisandrin, gomisin B, schisandrin A) có giá trị Rf khác biệt rõ ràng và không chồng lấp. Độ phân tách tốt cho phép xác định chính xác các lignan này trong mẫu thực.

2.2. Thẩm định phương pháp định tính

Thẩm định bao gồm đánh giá độ chọn lọc, độ nhạy và tính toàn vẹn của phương pháp TLC. Độ chọn lọc được kiểm tra bằng cách sử dụng các lignan chuẩn riêng biệt và hỗn hợp. Độ nhạy được xác định thông qua giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi lignan. Phương pháp phải có khả năng phát hiện các lignan ở nồng độ thấp và đủ để sử dụng trong thực tế kiểm nghiệm dược liệu.

III. Phương pháp định lượng Lignan bằng HPLC hiệu năng cao

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) hay sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp định lượng đồng thời ba lignan (schisandrin, gomisin B, schisandrin A) trong Ngũ vị tử Ngọc Linh với độ chính xác cao nhất. Phương pháp này cho phép định lượng chính xác hàm lượng từng lignan trong mẫu, từ đó đánh giá chất lượng dược liệu. Quá trình định lượng bao gồm chuẩn bị mẫu, xây dựng đường chuẩn, thiết lập điều kiện sắc ký tối ưu. Phương pháp HPLC được thẩm định theo các tiêu chuẩn quốc tế về độ chính xác, độ lặp lại, khoảng tuyến tính. Kết quả định lượng từ HPLC là cơ sở để xác định giá trị dược liệu và tuân thủ tiêu chuẩn của các Dược điển.

3.1. Điều kiện sắc ký tối ưu cho định lượng

Điều kiện sắc ký được khảo sát bao gồm lựa chọn cột sắc ký (thường là C18), pha động (hỗn hợp acetonitrile và nước), tốc độ dòng và nhiệt độ cột. Các thông số này được điều chỉnh để đạt độ phân tách tốt nhất giữa ba lignan trong thời gian ngắn nhất. Bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi lignan được xác định bằng phối tử mảng (DAD detector) để đảm bảo tính chọn lọc cao.

3.2. Quy trình xử lý mẫu và thẩm định phương pháp

Quy trình xử lý mẫu bao gồm các bước chiết lignan từ dược liệu bằng dung môi phù hợp, lọc mẫu để loại bỏ các tạp chất. Phương pháp chiết được khảo sát để đạt hiệu suất thu hồi cao nhất. Thẩm định bao gồm đánh giá độ chọn lọc, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ và độ lặp lại. Độ lặp lại được kiểm tra qua đó xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của phương pháp.

IV. Ứng dụng và tiêu chuẩn kiểm nghiệm Lignan trong Ngũ vị tử

Ứng dụng của các phương pháp định tính và định lượng lignan là xác định chất lượng dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh trong kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm. Hàm lượng schisandrin, gomisin B và schisandrin A được sử dụng làm tiêu chuẩn để đánh giá độ tươi, nguyên chất của dược liệu. Các tiêu chuẩn này được quy định trong các Dược điển (như Dược điển Việt Nam, Dược điển Trung Quốc) để đảm bảo hiệu lực dược phẩm. Phương pháp HPLC đã được áp dụng trên nhiều mẫu thực từ các vùng trồng khác nhau, cho kết quả khác nhau về hàm lượng lignan. Các nghiên cứu cho thấy dược liệu từ những vùng có điều kiện khí hậu và đất đai phù hợp (đặc biệt là Ngọc Linh, Kon Tum) có hàm lượng lignan cao nhất.

4.1. Tiêu chuẩn chất lượng Lignan trong Dược điển

Tiêu chuẩn của các Dược điển yêu cầu hàm lượng schisandrin trong Ngũ vị tử tối thiểu từ 0,40% trở lên. Gomisin B và schisandrin A cũng có các tiêu chuẩn cụ thể. Những tiêu chuẩn này được xây dựng trên cơ sở nhiều nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm lâm sàng. Phương pháp kiểm nghiệm phải tuân thủ các yêu cầu của Dược điển để đảm bảo tính chuẩn hóa trong toàn ngành dược.

4.2. Ứng dụng thực tế trong kiểm nghiệm dược liệu

Các phương pháp định tính và định lượng được áp dụng rộng rãi trong các phòng kiểm nghiệm, nhà máy sản xuất dược phẩm để kiểm tra chất lượng nguyên liệu Ngũ vị tử. Phương pháp TLC được dùng để sàng lọc nhanh, còn phương pháp HPLC được dùng cho kết quả chính xác. Các kết quả này là cơ sở để phê duyệt hoặc loại bỏ những lô dược liệu không đạt tiêu chuẩn, đảm bảo hiệu lực và an toàn của sản phẩm dược phẩm cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngữ vị tử (Schisandra spp) là một vị thuốc Y học cổ truyền dùng để hồi phục sức khỏe, làm thuốc bổ, an thần, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh [11]. Trong đó có 2 loài Ngũ vị tử được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất là Ngũ vị tử Bắc (S. chinensis) và Ngũ vị tử Nam (S. sphenanthera) và đều đã được đưa vào Dược điển Trung Quốc.

chinensis phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Đông Bắc của Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và phía Đông của Nga, còn loài S. sphenanthera chủ yếu ở một số tỉnh phía Nam của Trung Quốc [32]. Vào năm 2007, các nhà thực vật học đã phát hiện một loài Ngũ vị tử phân bố tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh - Kon Tum và đã được các nhà thực vật học xác định tên khoa học là Schisandra sphenanthera Rehder. et Wils, tương tự loài Ngũ vị tử Nam phân bố bên Trung Quốc.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, các hợp chất lignan là thành phần chính trong Ngũ vị tử Ngọc Linh và cho thấy có những sự tương đồng về thành phần hóa học của Ngũ vị tử Ngọc Linh với Ngũ vị tử Bắc của Trung Quốc bao gồm: schisandrin, gomisin A, B, J, schsandrin A.trong đó schisandrin, gomisin B và schisandrin A là những lignan chính trong Ngũ vị tử Ngọc Linh [3], [7], [8], [10], [9], [12]. Với trữ lượng tự nhiên lớn, chỉ riêng tại xã Ngọc Lây, Tê Xăng, Măng Ri của huyện Đăk Tô - Kon Tum, trữ lượng khoảng 40 - 50 tấn quả tươi/năm (4,5 – 5,0 tấn khô/năm), cho thấy có thể hướng đến phát triển Ngũ vị tử Ngọc Linh trong nước để thay thế nhập khẩu Ngũ vị tử từ Trung Quốc trong tương lai gần [7]. Tuy nhiên, hiện tại việc đánh giá chất lượng Ngũ vị tử Ngọc Linh còn gặp nhiều khó khăn do Dược điển Việt Nam V chỉ mới quy định loài Ngũ vị tử Bắc trong khi Dược điển Trung Quốc và Hồng Kông đều quy định cả 2 loài Ngũ vị tử Bắc và Ngũ vị tử Nam. Mặt khác, trong nước chưa có nghiên cứu nào đánh giá hàm lượng và định tính các lignan chính trong Ngũ vị tử Ngọc Linh như schisandrin, gomisin B và schisandrin A.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính và định lượng một số lignan 1 trong Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehder & E. Wilson)” với các mục tiêu như sau: - Xây dựng phương pháp định tính schisandrin, gomisin B và schisandrin A trong Ngũ vị tử Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). - Xây dựng phương pháp định lượng schisandrin, gomisin B và schisandrin A trong Ngũ vị tử Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Áp dụng phương pháp đã xây dựng trên các mẫu Ngũ vị tử Ngọc Linh thu hái và mua tại Kon Tum và Quảng Nam.

Giới thiệu về họ Schisandraceae Họ Schisandraceae gồm có 2 chi, là chi Ngũ vị tử (Schisandra) và chi Na rừng (Kadsura) với tổng cộng khoảng 39 loài trên thế giới phân bố chủ yếu ở Đông và Đông Nam Á, ngoài ra 1 loài Schisandra đặc hữu được tìm thấy ở đông nam Hoa Kỳ và dãy núi Madre của Mexico. Người ta đã tìm thấy ở Trung Quốc có khoảng 27 loài thuộc cả 2 chi trong đó có 16 loài đặc hữu [17], [37]. Đặc điểm chung về hình thái học họ Schisandraceae: Cây thân leo hóa gỗ, đơn tính, khác gốc. Lá mọc xen kẽ hoặc mọc chùm vòng trên cành.

Hoa mọc ở nách lá hoặc cuối cành, thường đơn độc nhưng đôi khi mọc thành cặp hoặc cụm lên đến 8. Bộ nhị khác nhau, có 4-80 nhị, rời nhưng chặt chẽ, đôi khi tập hợp thành một khối gần giống hình cầu. Nhụy hoa có 12-300 lá noãn, lá noãn gập đôi. Quả là tập hợp của các lá noãn rời, vỏ quả nạc.

Hạt thường 1-5, hiếm khi có nhiều hơn, hạt dẹt và có nhiều nội nhũ [9], [17], [37]. Tổng quan về chi Schisandra 1. Các loài Schisandra trên thế giới Chi Schisandra hay còn gọi là chi Ngũ vị tử gồm khoảng 22 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Á và Đông Nam Á, trong đó Trung Quốc phát hiện 19 loài (12 loài đặc hữu) và ở Bắc Mỹ (1 loài) [17], [37]. Các loài thuộc chi Schisandra còn biết đến với tên gọi khác như wuweizi (Trung Quốc), gomishi (Nhật Bản) hay omija (Hàn Quốc) và hầu hết các loài thuộc chi này đều được sử dụng làm thuốc từ hàng ngàn năm về trước.

Trong số các loài thuộc chi Schisandra, hai loài Schisandra chinensis (Ngũ vị tử Bắc) và Schisandra sphenanthera (Ngũ vị tử Nam) được sử dụng phổ biến nhất và được mô tả đầu tiên bởi danh Y Trung Quốc Lý Thời Trân trong cuốn Bản cương thảo mục vào năm 1596 [38]. Điểm khác biệt giữa tên của hai loài này do vị trí phân bố của chúng, loài Ngũ vị tử Bắc (Schisandra chinensis) phân bố ở các tỉnh phía Đông bắc Trung Quốc như Hắc Long Giang, Cát Lâm, Liêu Linh, Nội Mông, Hồ Bắc, Sơn Tây, Ninh Hạ, Cam 3 Túc, Sơn Đông; còn loài Ngũ vị tử Nam (Schisandra sphenanthera) lại phân bố ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc như Vân Nam, An Huy, Hồ Nam, Giang Tây, Hà Nam. Trong Y học cổ truyền Trung Quốc, cả hai loài này đều cho thấy có tác dụng giống nhau, tuy nhiên với nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý cho thấy có sự khác biệt giữa hai loài này. Chính vì vậy, vào năm 2000, Dược điển Trung Quốc đã quy định Ngũ vị tử thành hai chuyên luận riêng là Ngũ vị tử Bắc và Ngũ vị tử Nam tương ứng với hai loài này [32].

Phân bố các loài Schisandra trên thế giới TT Tên loài Phân bố Trung Quốc (An Huy, Cam Túc, Quý Châu, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Thiểm 1 Schisandra sphenanthera Tây, Sơn Tây, Tứ Xuyên,Vân Nam, và Chiết Giang). Đông Bắc Trung Quốc và bắc Nhật Bản 2 Schisandra chinensis (Hokkaido). Đông bắc Assam, bắc Myanmar (Miến Điện), 4 Schisandra rubriflora Trung Quốc (tây Tứ Xuyên và bắc Vân Nam) 5 Schisandra incarnata Phía tây Hồ Bắc Trung Quốc. Nepal, đông bắc Ấn Độ, bắc Myanmar (Miến 7 Schisandra neglecta Điện) và Trung Quốc (Vân Nam).

9 Schisandra glaucescens Trung Quốc (tây Hồ Bắc và đông Tứ Xuyên). 4 10 Schisandra tomentella Nam Tứ Xuyên Trung Quốc. 11 Schisandra pubinervis Trung Quốc (Hồ Bắc và Tứ Xuyên). 12 Schisandra lancifolia Trung Quốc (Tứ Xuyên và Vân Nam).

16 Schisandra perulata Thái Lan và Việt Nam. 17 Schisandra glabra Đông nam Hoa Kỳ và Mexico (Sierra Madre). 20 Schisandra propinqua Himalaya Ấn Độ, Trung Quốc. Đông bắc Ấn Độ (Arunachal Pradesh) và 21 Schisandra plena Trung Quốc (Vân Nam).

22 Schisandra pubescens Trung Quốc (Hồ Bắc và Tứ Xuyên). Đặc điểm thực vật của chi Schisandra Cây thân leo, hóa gỗ, không có lông, đơn tính, khác gốc. Lá hình elip hoặc hình trứng, thường mọc xen kẽ nhau. Hoa mọc ở nách lá, thường mọc đơn độc.

Bộ nhị từ 4 - 60 nhị, rời rạc hoặc tập hợp thành một khối cầu. Nhụy hoa có 12-120 noãn, đầu nhụy hình dùi. Quả tụ tập lại với nhau trên đế hoa thành chùm, khi chín cho màu đỏ hiếm gặp quả chín màu đen. Hạt thường 1, 2 hoặc 3, nhẵn hoặc hơi nhăn nheo [17], [37].

Hình ảnh loài Ngũ vị tử Nam (Schisandra sphenanthera) (Nguồn: http://www. Một số loài thuộc chi Schisandra ở Việt Nam Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy, trong hệ thực vật Việt Nam chi Ngũ vị tử (Schisandra) có 6 loài: - Ngũ vị Bắc (Schisandra chinensis (Turez) baill): Phân bố ở Lai Châu, Lào Cai: Quả và hạt làm thuốc bổ, có tác dụng cường dương, trị suy nhược, chữa hen xuyễn, ho lâu ngày, ra mồ hôi trộm, di tinh, ỉa chảy kéo dài, bồn chồn mất ngủ [2], [11], [6]. - Ngũ vị cuống dài (Schisandra propinqua (Wall.)): Phân bố ở Lào Cai (Sa Pa, Phan Si Pan). Thân và lá dùng trị kinh nguyệt không đều, bạch đới, lao xương, mụn nhọt, tổn thương, phổi có mủ.

Quả dùng thay thế Ngũ vị Bắc [2], [6]. - Ngũ vị hoa đỏ (Schisandra rubriflora (Franch) Rehder et E.Wilson): Phân bố ở Lai Châu (Phong Thổ), Lào Cai (Sa Pa), Hòa Bình (Mai Châu). Quả và hạt làm thuốc bổ, có tác dụng cường dương, trị suy nhược, đau dạ dày [2]. - Ngũ vị sần (Schisandra verrucosa Gagnep.): Phân bố ở Lai Châu (Bình Lư), Lào Cai (Sa Pa).

Toàn dây băm nhỏ, phơi khô, nấu nước uống hằng ngày, chữa sưng vú, khô sữa [2], [6]. - Ngũ vị vảy chồi (Schisandra perulata Gagn): Cây Ngũ vị vảy chồi theo địa phương còn được gọi là Phân hùng vảy chồi. Cây phân bố ở phía bắc Việt Nam như Sapa. Đồng bào các dân tộc tỉnh Lào Cai sử dụng loài Ngũ vị vảy chồi 6 để chăm sóc sức khỏe, như lấy thân, lá làm thuốc tắm hay thân còn được ngâm rượu làm thuốc bổ gân cốt, ngoài ra quả của loài này còn được dùng ăn để giải nhiệt khi đi rừng.

Ở Trung Quốc, loài này được dùng chữa kinh nguyệt không đều, bạch đới, đòn ngã tổn thương, mụn nhọt, thần kinh suy nhược, đau dạ dày [2]. - Ngũ vị tử Nam (Schisandra sphenanthera): Cây Ngũ vị tử Nam được phát hiện ở Việt Nam năm 2007 tại vùng núi Ngọc Linh, thường được gọi là Ngũ vị tử Ngọc Linh. Ở Việt Nam, cây phân bố ở Tây Nguyên, đặc biệt có trữ lượng lớn ở Kon Tum. Đồng bào dân tộc tỉnh Quảng Nam và Tây Nguyên dùng cây này trị bệnh về gan mật [2].

Tổng quan về cây Ngũ vị tử Ngọc Linh Theo kết quả từ nghiên cứu về thực vật học, Ngũ vị tử Ngọc Linh có tên khoa học là Schisandra sphenanthera Rehder & E.Wilson, thuộc chi Ngũ vị tử (Schisandra), họ Ngũ vị (Schisandraceae), bộ Hồi (Illiciales), phân lớp Hoàng liên (Rancunulidae), lớp Hai lá mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae). Đặc điểm thực vật Ngũ vị tử Ngọc Linh là loại cây thân leo gỗ, dài 3 – 5m. Toàn cây không lông, rất ít gặp trên gân, mặt dưới lá non có lông nhỏ mềm thưa thớt. Thân cành có nốt sần, cành non hơi có cạnh.

Lá mọc so le, hình trứng đảo, rộng hơn về phía cuối lá, gốc hình nêm, đỉnh nhọn, kích thước lá trung bình dài 5-11 cm, rộng 3-7 cm. Mép lá có răng cưa thô về phía cuối lá. Lá có gân hình lông chim. Hoa đơn tính, khác gốc, tràng có 6-9 cánh, màu vàng trắng, có mùi thơm, nhị 5.

Hoa mọc ở nách lá, cuống dài 2-4 cm, gốc có phiến bao (vẩy) dài 3-4 mm. Cánh hoa 5-9, màu cam, hình trứng đảo dạng tròn dài, kích thước 6-12 x 5-8 mm. Hoa đực nhị nhiều, thành bó hình trứng đảo, đường kính 4-5 mm. Đế hoa lồi hình trụ tròn, nhị nhiều, ô phấn hướng nội, 2 ô.