Khóa luận: Nghiên cứu định lượng vỏ quế bằng HPTLC - Hoàng Thị Kim Ngân

Nghiên cứu phương pháp HPTLC để định lượng các hợp chất hoạt tính trong vỏ quế, đảm bảo chất lượng dược liệu và kiểm soát tiêu chuẩn sản phẩm.

• Tác giả: Hoàng Thị Kim Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Lượng Một Số Thành Phần Trong Vỏ Quế Bằng Phương Pháp HPTLC
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vỏ quế và ý nghĩa định lượng thành phần

Vỏ quế là một dược liệu quý từ lâu được sử dụng trong y học cổ truyền và hiện đại. Loại dược liệu này chứa nhiều thành phần hoá học có giá trị y học cao, đặc biệt là các hợp chất như cinnamaldehyd, coumarin và cinnamic acid. Việc định lượng thành phần vỏ quế có ý nghĩa quan trọng trong kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng. Các thành phần này có tác dụng kháng viêm, kháng oxy hóa và hỗ trợ sức khỏe con người. Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu quả và an toàn, cần phải xác định chính xác hàm lượng các thành phần này. Phương pháp HPTLC là một giải pháp phân tích hiệu quả, nhanh chóng và chi phí thấp so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Thành phần hoá học chính trong vỏ quế

Vỏ quế chứa nhiều hợp chất phytochemical quan trọng. Cinnamaldehyd là thành phần chính, chiếm khoảng 3-8% trong tinh dầu vỏ quế, mang lại mùi thơm đặc trưng. Coumarin có tác dụng chống đông máu và chống viêm. Cinnamic acid là axit hữu cơ có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Các thành phần này cùng nhau tạo nên những đặc tính dược học đa dụng của vỏ quế.

1.2. Tầm quan trọng của việc kiểm nghiệm chất lượng

Kiểm nghiệm chất lượng vỏ quế đảm bảo rằng sản phẩm đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế. Việc định lượng các thành phần chính giúp xác định độ tinh khiết, hiệu lực sinh học và an toàn của sản phẩm. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng được tiêu thụ rộng rãi.

II. Phương pháp HPTLC và nguyên lý hoạt động

HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) là một phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, được phát triển từ phương pháp TLC truyền thống. Phương pháp này kết hợp những ưu điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với tính đơn giản và chi phí thấp của sắc ký lớp mỏng. Nguyên lý HPTLC dựa trên sự phân tách các hợp chất dựa trên độ hấp phụ, độ phân cực và khối lượng phân tử của chúng. Hệ thống thiết bị HPTLC bao gồm buồng triển khai dung môi, máy phát hiện tự động, và các tấm sắc ký chuyên biệt. Phương pháp này cho phép định lượng chính xác các thành phần với độ phân giải cao, thời gian phân tích nhanh và tiêu thụ dung môi ít, giúp bảo vệ môi trường.

2.1. Sơ lược về kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao sử dụng tấm gắn các hạt silicon dioxide có kích thước 2-10 µm. Điều này cho phép phân giải cao hơn và độ nhạy tốt hơn so với TLC thông thường. Phương pháp này cho phép phân tách nhanh chóng, thường hoàn thành trong 10-15 phút, tiết kiệm thời gian và tài nguyên.

2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả định lượng HPTLC: nhiệt độ, độ ẩm buồng sắc ký, thành phần pha động, tốc độ triển khai, và độ tinh khiết của chất đối chiếu. Việc khảo sát và tối ưu hóa các yếu tố này là bước quan trọng để xây dựng phương pháp phân tích đáng tin cậy.

III. Quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC

Việc xây dựng phương pháp HPTLC để định lượng thành phần vỏ quế yêu cầu thực hiện nhiều bước quan trọng. Đầu tiên là lựa chọn pha động phù hợp, thường là hỗn hợp các dung môi có độ phân cực khác nhau. Bước tiếp theo là khảo sát dung môi chiết để đạt hiệu suất chiết cao nhất. Lựa chọn bước sóng phát hiện cũng rất quan trọng, thường từ 254-366 nm để phát hiện các hợp chất có nhóm chromophore. Thẩm định phương pháp phân tích bao gồm kiểm tra độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi. Tất cả các tham số này phải đáp ứng tiêu chuẩn AOAC và các hướng dẫn quốc tế khác để đảm bảo phương pháp đáng tin cậy.

3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu

Khảo sát pha động là bước then chốt để đạt được sự phân tách tốt nhất. Các hệ pha động khác nhau như heptane-ethyl acetate, toluene-ethyl acetate được thử nghiệm để tìm ra hệ có hệ số lưu giữ (Rf) thích hợp (0,3-0,7). Dung môi chiết cũng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết và cần được lựa chọn cẩn thận.

3.2. Thẩm định độ tuyến tính độ lặp lại và giới hạn phát hiện

Độ tuyến tính được kiểm tra bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, hệ số tương quan (R²) phải ≥ 0,99. Độ lặp lại được đánh giá qua RSD < 2%. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định dựa trên tỉ số tín hiệu/nhiễu ≥ 3 và ≥ 10 tương ứng.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả phân tích mẫu vỏ quế

Phương pháp HPTLC đã được ứng dụng thành công để định lượng cinnamaldehyd, coumarin và cinnamic acid trong các mẫu vỏ quế từ các vùng địa lý khác nhau như Thanh Hoá, Quảng Nam, Quảng Ninh và Yên Bái. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng thành phần khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc, điều kiện trồng trọt và quy trình chế biến. Mẫu vỏ quế từ Thanh Hoá có hàm lượng cinnamaldehyd cao nhất, trong khi mẫu từ Quảng Nam có nồng độ coumarin cao hơn. Phương pháp HPTLC mang lại các lợi ích như chi phí thấp, thời gian phân tích nhanh, không cần mua nhiều dung môi và hóa chất như HPLC, đồng thời vẫn đảm bảo độ chính xác cao. Kết quả này có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm chất lượng hàng loạt các sản phẩm vỏ quế trên thị trường.

4.1. Hàm lượng thành phần trong các mẫu vỏ quế khác nhau

Nghiên cứu phân tích định lượng trên các mẫu vỏ quế từ các miền khác nhau cho kết quả khác nhau. Cinnamaldehyd dao động từ 4,2-7,8%, coumarin từ 0,8-2,5%, và cinnamic acid từ 1,2-3,1%. Sự khác biệt này phản ánh ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, loại đất và kỹ thuật canh tác đến chất lượng dược liệu.

4.2. Ưu điểm và ứng dụng thực tiễn của phương pháp HPTLC

Phương pháp HPTLC có nhiều ưu điểm vượt trội: chi phí thấp so với HPLC, không cần sử dụng detector tắc, có thể phân tích nhiều mẫu cùng một lúc, thích hợp cho kiểm nghiệm chất lượng thường xuyên. Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các cơ sở kiểm nghiệm ở những khu vực có điều kiện kinh tế hạn chế, đồng thời vẫn đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy cần thiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về dược liệu vỏ quế Quế (Cinnamomum) là một chi thực vật thuộc họ Long não (Lauraceae), bao gồm hơn 250 loài, phân bố chủ yếu tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và châu Úc. Các loài trong chi này có nhiều đặc điểm hình thái tương đồng như: lá đơn mọc đối, hoa nhỏ màu trắng hoặc vàng nhạt mọc thành chùm, phấn hoa mịn; đồng thời, chúng đều chứa tinh dầu thơm với thành phần hóa học đặc trưng [1], [5]. Quế là cây ưa khí hậu nóng ẩm, thích hợp phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 20 – 30 °C, độ ẩm tương đối trên 85 % và lượng mưa trung bình hằng năm dao động từ 2000 – 3000 mm.

Cây có khả năng chịu bóng khi còn non, nhưng cần nhiều ánh sáng ở giai đoạn trưởng thành để sinh trưởng nhanh và cho năng suất cao. Quế là một trong những dược liệu có giá trị cao, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền lẫn hiện đại. Trong đó, vỏ quế thường được thu hái từ thân hoặc cành của cây trưởng thành, khoảng từ 7 năm tuổi trở lên. Sau thu hái, vỏ được sơ chế, chế biến và phơi khô để sử dụng hoặc bảo quản lâu dài.

Tại Việt Nam, cây quế đã được trồng và sử dụng từ hơn 2000 năm trước. Hiện nay, loài Cinnamomum Cassia là phổ biến nhất và được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh miền núi và trung du. Các vùng trồng quế truyền thống và có quy mô lớn bao gồm Yên Bái, Quảng Nam, Quảng Ninh và Thanh Hoá – những khu vực có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng đặc biệt phù hợp cho sự phát triển của cây quế [6]. Hầu hết các bộ phận của cây quế như vỏ thân, cành, lá, hoa, quả và rễ đều chứa hợp chất có hoạt tính sinh học và được ứng dụng trong y học cũng như trong công nghỉệp thực phẩm.

Tuy nhiên, vỏ thân vẫn là phần có giá trị thương mại và dược liệu cao nhất [7]. Vỏ quế có vị cay, hơi ngọt, để lại cảm giác tê nhẹ, mang mùi thơm đặc trưng do chứa hàm lượng cao tinh dầu, với cinnamaldehyd là thành phần chính. Về hình thái, vỏ quế Cassia có mặt ngoài màu nâu đến nâu xám, mặt trong màu nâu đỏ hoặc nâu sẫm, bề mặt nhẵn hoặc hơi gồ ghề. Vỏ có đặc tính cứng, giòn, dễ bẻ gãy, mặt bẻ có nhiều xơ [4].

Về mặt dược lý, quế được ghi nhận có nhiều tác dụng sinh học đa dạng bao gồm tác dụng chống khối u, chống viêm và giảm đau, chống tiểu đường và chống béo phì, kháng khuẩn và kháng vi-rút, tác dụng bảo vệ tim mạch, bảo vệ tế bào, bảo vệ thần kinh, điều hòa miễn dịch, có hoạt tính chống tyrosinase và các tác dụng dược lý khác [3]. Từ hàng nghìn năm trước, quế đã được dùng trong y học cổ truyền giúp điều trị, phòng chống một số bệnh như: kích thích tiêu hóa, sát khuẩn, kích thích thần kinh, chống chứng huyết khối, chống viêm và chống dị ứng [8]. Thành phần hoá học Từ các nghiên cứu cho thấy, vỏ quế chứa đa dạng các thành phần hoá học, thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau như phenylpropanoid, lacton, terpenoid, lignan, butanolid, flavonoid, alkaloid và các hợp chất khác [3], [9], [10]. Phenylpropanoid Phenylpropanoid là nhóm hợp chất có hàm lượng cao, đặc biệt trong tinh dầu quế, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên mùi thơm đặc trưng và góp phần vào hoạt tính sinh học đa dạng của các loài Cinnamomum.

Cấu trúc cơ bản của nhóm chất này bao gồm một nhân thơm (C₆) liên kết với chuỗi propan (C₃), được thể hiện ở Hình 1. Một số phenylpropanoid tiêu biểu bao gồm: cinnamaldehyd, cinnamic acid, methoxycinnamaldehyd, cinnamylalcohol, ethyl cinnamat, eugenol, cinnamyl acetat,… Hình 1. Cấu trúc chung của một số phenylpropanoid. Đặc điểm cấu trúc hoá học - Công thức phân tử: C9H8O, khối lượng phân tử: 132,16 g/mol.

- Tên IUPAC: (E)-3-phenylprop-2-enal. - Các tên gọi khác: trans-cinnamaldehyd, aldehyd cinnamic, cinnamal, (E)-3- phenylprop-2-enal, cinnamyl aldehyd, trans-3-phenyl-2-propenal,… Cinnamaldehyd (CAL) là thành phần chính tạo nên mùi thơm đặc trưng trong tinh dầu vỏ quế với cấu trúc hoá học được thể hiện ở Hình 1. 2 và chủ yếu tồn tại trong tự nhiên dưới dạng đồng phân trans (E). Công thức cấu tạo của cinnamaldehyd.

Tính chất hoá lý - Cinnamaldehyd là chất lỏng màu vàng, ít tan trong nước (1,42 mg/ml ở 25 °C), tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, diethyl ether, cloroform. - Nhiệt độ nóng chảy: - 7,5 °C, nhiệt độ sôi: 248 - 253 °C ở 760 mmHg, tỷ trọng: 1,048 - 1,052 g/ml ở 25 °C, áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25 °C, chỉ số khúc xạ: 1,6195. - Bước sóng hấp phụ cực đại: 291nm [11]. Ứng dụng 3 Cinnamaldehyd (CAL) là thành phần chính trong tinh dầu quế, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và các sản phẩm kháng khuẩn nhờ mùi thơm đặc trưng, dễ bay hơi và đa dạng các hoạt tính sinh học [10], [12].

Trong ngành công nghiệp dược phẩm, CAL đã được nghiên cứu có khả năng ức chế xanthin oxidase [13]. Bên cạnh đó, CAL cũng được nghiên cứu và phát triển như một tác nhân chống viêm, chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị ung thư [10]. Trong mỹ phẩm, CAL có khả năng ức chế enzym tyrosinase, giúp giảm sản sinh melanin mà không gây độc tính tế bào [14]. Ngoài ra, CAL thể hiện hoạt tính chống ung thư biểu mô vảy miệng được ghi nhận thông qua ức chế đáng kể hoạt động của các tế bào HSC-3, gây ngưng trệ chu kỳ tế bào, tổn thương DNA, làm mất ty thể và tăng sản sinh các loại oxy phản ứng [15].

Nhờ khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh, CAL còn được sử dụng trong các chế phẩm khử khuẩn, chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và sản phẩm dùng ngoài da [16]. Đặc điểm cấu trúc hoá học - Công thức phân tử: C9H8O2, khối lượng phân tử: 148,16 g/mol. - Tên IUPAC: (E)-3-phenylprop-2-enoic acid. - Các tên gọi khác: (E)-cinnamic acid, trans-cinnamic acid, phenylacrylic acid, cinnamylic acid, 3-phenylacrylic acid, benzenepropenoic acid, benzenacrylic acid,.

Cinnamic acid là một acid phenylpropanoid có cấu trúc gồm một nhân thơm liên kết với chuỗi không no chứa nhóm carboxylic như Hình 1. Cấu trúc hoá học của cinnamic acid. Tính chất hoá lý - Cinnamic acid tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, ít tan trong nước (0,546 mg/ml), tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, cloroform. - Nhiệt độ nóng chảy: 133 °C, nhiệt độ sôi: 298 - 300 °C ở 760 mmHg.

- Tỷ trọng: 1,185 g/cm3, áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25 °C, chỉ số khúc xạ: 1,616. - Hợp chất có tính acid yếu, pKa: 4,45. 4 - Bước sóng hấp thụ cực đại: 273 nm [17]. Ứng dụng Cinnamic acid (CA) là hợp chất hữu cơ tự nhiên có mặt phổ biến trong nhiều loại tinh dầu, bao gồm cả tinh dầu vỏ quế [18].

Bên cạnh khả năng ức chế tyrosine, CA cũng được dùng làm chất trung gian trong tổng hợp dược phẩm, nước hoa và mỹ phẩm, nhờ mùi hương nhẹ và khả năng giữ mùi bền [19]. Ngoài ra, các hoạt tính chống oxy hoá, kháng khuẩn và chống viêm của CA cũng được ghi nhận [20]. Hợp chất này cũng đã được chứng minh có khả năng bảo vệ tế bào, có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đồng thời hỗ trợ trong việc phòng ngừa, điều trị bệnh sốt rét và kiểm soát bệnh tiểu đường [21]. Lacton Một số lacton được tìm thấy trong quế như coumarin, hydrocoumarin với hàm lượng coumarin xác định được khá cao.

Ngoài ra các lacton khác cũng được xác định bao gồm cinnamomulacton, các cinncassin [22]. Đặc điểm cấu trúc hoá học - Công thức phân tử: C9H6O2, khối lượng phân tử: 146,14 g/mol. - Tên IUPAC: chromen-2-on. Các tên gọi khác: 2H-coumarin, 2H-chromen-2-on, chromen-2-on, coumarinic anhydrid, coumarinic lacton, 2H-1-benzopyran-2-on,… Coumarin có cấu trúc hoá học gồm một vòng benzen gắn với một vòng lacton, tạo thành hệ thống vòng thơm liên hợp như Hình 1.

Công thức cấu tạo của coumarin. Tính chất hoá lý - Coumarin là chất rắn kết tinh không màu hoặc màu trắng, có mùi thơm dễ chịu giống mùi vani và có vị cay đắng, ít tan trong nước (1,9 mg/ml ở 20 °C), tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, cloroform. - Nhiệt độ nóng chảy: 71 °C, nhiệt độ sôi: 297 – 301 °C ở 760 mmHg. - Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [23].

Ứng dụng Coumarin (CM) được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực bao gồm mỹ phẩm, thực phẩm và y học cổ truyền [24]. Với đặc tính kháng viêm ứng dụng trong điều trị phù nề, 5 CM giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các gốc tự do [9]. Bên cạnh đó, CM cũng có tác dụng chống co thắt, kháng khuẩn và chống oxy hoá [25], kháng vi-rút [26]. CM và các dẫn xuất của nó còn được nghiên cứu như tiền chất tổng hợp thuốc chống đông máu (như wafarin) [27] và thuốc chống lao [28].

Ngoài ra, định lượng coumarin cũng ứng dụng để phân biệt một số loài quế, điển hình như quế Cassia thường chứa hàm lượng CM cao hơn nhiều so với quế Ceylon [29]. Các nhóm hợp chất khác Bên cạnh các nhóm hợp chất chính, các loài Cinnamomum còn chứa nhiều nhóm và hợp chất thứ cấp khác có cấu trúc đa dạng và tiềm năng sinh học, bao gồm các nhóm lignan (sesamin, biphenyl lignan, phenolic glycosid,…), nhóm butanolid (isoobtusilacton A, obtusilacton A, α,β-diphenyl-γ-butyrolacton,…), nhóm flavonoid (flavon, flavonol, dihydroflavon, dihydroflavonol, chalcon, flavan, anthocyanidin,…), nhóm monoterpenoid (linalool, camphen, camphor,…), diterpenoid và sesquiterpenoid, nhóm alkaloid (piperidin, pyrrolidin, các amin tự do,…) và các hợp chất phenylethanol, các hợp chất benzenoid đơn giản và steroid. Tổng quan về phương pháp HPTLC 1. Sơ lược về phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) là một kỹ thuật tách phân tích được thực hiện trên một bản mỏng, trong đó pha tĩnh là lớp hạt mịn có kích thước đồng nhất, được cố định trên nền vật liệu rắn.

Pha tĩnh đóng vai trò hấp phụ và tách các chất dựa trên các cơ chế như phân bố, hấp thụ, trao đổi ion,… Trong khi đó, pha động có nhiệm vụ rửa giải, vận chuyển các chất phân tích dọc theo pha tĩnh. Quy trình TLC thông thường bao gồm bốn bước cơ bản: chấm mẫu, khai triển sắc ký, phát hiện vết, và xử lý số liệu thực nghiệm [30]. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography - HPTLC) là phiên bản hiện đại và tiên tiến của TLC. Phương pháp này sử dụng các lớp hấp phụ sắc ký có hiệu suất phân tách cao kết hợp với hệ thống thiết bị hiện đại được tích hợp trong các bước của quy trình, bao gồm tiêm mẫu, khai triển, phát hiện vết thông qua phần mềm chuyên dụng [31].