Luận văn: Định lượng Notoginsenosid R1 và Ginsenosid trong TPBVSK bằng HPLC

Luận văn thạc sĩ Dược học về phương pháp HPLC định lượng Notoginsenosid R1 và Ginsenosid trong TPBVSK, bao gồm quy trình xây dựng và thẩm định.

• Tác giả: Đàm Thị Thu
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng Notoginsenosid R1 và một số Ginsenosid trong Thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Dược học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Notoginsenosid R1 và Ginsenosid

Notoginsenosid R1 và các ginsenosid là những hợp chất hoạt tính quan trọng được tìm thấy trong nhân sâm và các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Những chất này có nguồn gốc tự nhiên và được biết đến với các tác dụng bổ dưỡng sức khỏe đáng kể. Định lượng chính xác các thành phần này là cần thiết để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Các ginsenosid chủ yếu bao gồm Rg1, Rb1, Re và nhiều dạng khác, mỗi loại có đặc tính hóa học riêng. Việc phát triển phương pháp phân tích hiệu quả giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

1.1. Đặc điểm tính chất và tác dụng của Notoginsenosid R1

Notoginsenosid R1 là một saponin hiếm có tính chất đặc biệt, hoạt tính cao và an toàn cho sức khỏe con người. Chất này có khả năng hỗ trợ miễn dịch, giảm mệt mỏi và cải thiện sức khỏe tổng thể. Tính chất hóa học của notoginsenosid R1 cho phép nó dễ dàng hòa tan trong dung môi hữu cơ, thuận lợi cho quá trình phân tích và định lượng bằng các kỹ thuật hiện đại.

1.2. Vai trò của các Ginsenosid trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Các ginsenosid Rg1, Rb1, Re là những thành phần chính quyết định chất lượng và hiệu quả của thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Ginsenosid Rg1 có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, trong khi Rb1 giúp tăng cường hoạt động thể chất. Ginsenosid Re hỗ trợ điều hòa huyết áp và glucose máu, đem lại lợi ích toàn diện cho sức khỏe người dùng.

II. Phương pháp HPLC trong Định lượng các Chất Phân Tích

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương pháp phân tích hiệu quả nhất để định lượng notoginsenosid R1 và ginsenosid trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe. HPLC cung cấp độ chính xác cao, độ phân giải tốt và thời gian phân tích nhanh. Phương pháp này sử dụng cột sắc ký C18 và các dung môi phù hợp để tách biệt và xác định các thành phần khác nhau. Quá trình xây dựng phương pháp HPLC đòi hỏi thẩm định kỹ lưỡng để đảm bảo độ đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống và khoảng tuyến tính phù hợp.

2.1. Nguyên lý và thiết bị HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất dựa trên sự khác biệt về độ hấp phụ trên cột sắc ký. Các thiết bị HPLC hiện đại được trang bị detector mảng diod (DAD) hoặc detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), cho phép phát hiện chính xác và định lượng các ginsenosid ở nồng độ thấp.

2.2. Quy trình xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký

Quy trình xử lý mẫu bao gồm chiết xuất, làm sạch và chuẩn bị mẫu để phân tích. Việc khảo sát điều kiện sắc ký như tỷ lệ dung môi, pH, nhiệt độ cột và tốc độ dòng chảy là rất quan trọng để đạt hiệu suất phân tách tối ưu.

III. Thẩm định Phương pháp Phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích là bước quan trọng để đảm bảo tính tin cậy và chính xác của kết quả định lượng notoginsenosid R1 và ginsenosid. Quá trình thẩm định bao gồm xác định độ đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống (SST), khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại (RSD) và độ thu hồi (recovery). Các tiêu chí thẩm định tuân theo các hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa phân chính thống (AOAC) và các chuẩn quốc tế khác.

3.1. Độ đặc hiệu và độ thích hợp của hệ thống

Độ đặc hiệu đảm bảo phương pháp chỉ phát hiện các chất phân tích mong muốn mà không bị nhiễu từ các chất khác. Độ thích hợp hệ thống (SST) được kiểm tra bằng cách phân tích dung dịch chuẩn, đánh giá độ phân giải giữa các peak và tính đối xứng của peak.

3.2. Khoảng tuyến tính LOD và LOQ

Khoảng tuyến tính xác định phạm vi nồng độ mà phương pháp có hiệu suất tối ưu. LOD và LOQ lần lượt là giới hạn phát hiện và định lượng thấp nhất của các chất phân tích. Những thông số này được xác định thông qua các dung dịch chuẩn ở nồng độ khác nhau.

IV. Ứng dụng thực tiễn trong Kiểm nghiệm Thực phẩm Bảo vệ Sức khỏe

Phương pháp HPLC định lượng notoginsenosid R1 và ginsenosid đã được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm các thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa nhân sâm. Tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội và các cơ sở kiểm nghiệm khác, phương pháp này được sử dụng để kiểm soát chất lượng sản phẩm và đảm bảo tuân thủ các quy định về hàm lượng hoạt chất. Kết quả phân tích cung cấp thông tin quan trọng cho nhà sản xuất, cơ quan quản lý và người tiêu dùng về chất lượng thực sự của sản phẩm. Ứng dụng này góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao uy tín của ngành công nghiệp sản phẩm bảo vệ sức khỏe.

4.1. Tiêu chuẩn và quy định kiểm nghiệm

Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm được áp dụng bao gồm các hướng dẫn từ Bộ Y tế, Dược điển các nước và chuẩn AOAC. Phương pháp HPLC phải đáp ứng các yêu cầu về độ chính xác, độ chọn lọc và độ tin cậy để được công nhận chính thức.

4.2. Kết quả phân tích và đảm bảo chất lượng sản phẩm

Thông qua định lượng notoginsenosid R1 và ginsenosid bằng HPLC, các nhà sản xuất và cơ quan kiểm nghiệm có thể đánh giá chính xác hàm lượng hoạt chất, phát hiện sản phẩm giả hoặc không đạt chất lượng. Kết quả này là cơ sở để đưa ra quyết định công nhận hoặc từ chối sản phẩm trước khi đưa ra thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, với xu hướng “Trở về thiên nhiên” nhu cầu sử dụng các loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng gia tăng. Việc sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên để bảo vệ sức khỏe, phòng bệnh và trị bệnh đã được khám phá từ hàng ngàn năm trước ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam và các nước phương Tây. Với nền khoa học công nghệ ngày càng phát triển như hiện nay, quy mô nghiên cứu và sản xuất các loại thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) có nguồn gốc từ dược liệu để cải thiện sức khỏe, nâng cao tuổi thọ, phòng ngừa các bệnh mạn tính, chống ung thư đang trở nên mở rộng. Các loại thảo dược quý hiếm như Nhân sâm, Tam thất với nhiều công dụng phòng và trị bệnh đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các sản phẩm trên.

Các sản phẩm TPBVSK chứa Nhân sâm, Tam thất đang được phân phối ở nhiều quốc gia trên thế giới và ngày càng mở rộng với nhiều dạng bào chế khác nhau như: Củ tươi, củ khô, bột, viên nén, viên nang, cao, nước giải khát, kẹo [3,10,23]. Việt Nam là một trong những thị trường tiêu thụ lớn các chế phẩm đông dược, TPBVSK. Tuy nhiên, hiện nay các sản phẩm này đang được bày bán nhiều trong các nhà thuốc, cửa hàng kinh doanh dược liệu, siêu thị, thậm chí là bán hàng online và nhiều sản phẩm không rõ nguồn gốc xuất xứ. Rất nhiều sản phẩm không được kiểm soát chất lượng khiến cho người tiêu dùng khó có thể chọn lựa cho mình những sản phẩm thực sự có hiệu quả.

Mặt khác, Nhân sâm, Tam thất là những dược liệu có nhiều loài và hay bị giả mạo trên thị trường, đây chính là nguyên nhân của vấn đề thuốc giả chủ đề mang tính thời sự trong những năm gần đây [3,4]. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng notoginsenosid R1 và các ginsenosid (Rg1, Re, Rb1, Rf, Rd…) là những hoạt chất đặc trưng, điển hình cho tác dụng sinh học của các loài sâm thuộc chi Panax, họ Nhân sâm như Nhân sâm, Tam thất, Sâm Việt Nam, Sâm 1 Mỹ…[3,23,24,25,26,27,28,30,36,37]. Trong đó hàm lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid Rg1, Re, Rb1 chính là cơ sở để xác định chất lượng của dược liệu Nhân sâm và Tam thất theo các tiêu chuẩn Dược điển hiện hành: Việt Nam, Trung Quốc, Anh, Mỹ… Các sản phẩm TPBVSK chứa Nhân sâm và Tam thất được công bố cũng sử dụng hàm lượng của các hoạt chất trên làm chỉ tiêu kiểm soát chất lượng [1,17,31,35,41]. Tuy nhiên hiện nay, các Dược điển chỉ có chuyên luận riêng cho các dược liệu Nhân sâm, Tam thất hoặc cao Nhân sâm còn sản phẩm TPBVSK trong thành phần có Sâm, Tam thất phối hợp cùng nhiều dược liệu khác hoặc vitamin và khoáng chất ở các dạng bào chế viên, bột, lỏng… chưa có phương pháp được công bố.

Vì vậy việc xây dựng một phương pháp đáp ứng yêu cầu của các quy định hiện hành để xác định hàm lượng notoginsenosid R1 và các ginsenosid trong mẫu TPBVSK là cần thiết. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector DAD có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện và phổ biến, có thể ứng dụng tại nhiều phòng thí nghiệm đã được nhóm nghiên cứu lựa chọn để thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và một số ginsenosid trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng notoginsenosid R1 và một số ginsenosid (Rg1, Re, Rb1) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng rắn, dạng dầu, dạng lỏng bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe trong thành phần có Nhân sâm, Tam thất.

Tổng quan về Notoginsenosid R1 và các ginsenosid 1. Nguồn gốc Notoginsenosid R1 và các ginsenosid là saponin damaran được xem là thành phần hóa học chính trong các loài sâm thuộc chi Panax, họ Nhân sâm. Cho đến nay các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được cấu trúc hơn 100 saponin từ các loài sâm trong đó có hơn 20 loại saponin có cấu trúc thuộc nhóm damaran, đây là nhóm Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh (khung cyclopentanoperhydrophenantren). Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydrofuran.

Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol [3,7,8,32,33,42,44,45,49].1: Công thức cấu tạo của 2 genin của saponin triterpenoid tetracyclic Bảng 1. Saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol [3] Tên R1 R2 Loài Ginsenosid Rb1 Glc - Glc Glc - Glc Panax ginseng C.Mey; Panax notoginseng (Burk) 3 Panax notoginseng (Burk) F.Chen; Panax vietnamensis Ha et Grushv. Ginsenosid Re Glc - Rha Glc Panax ginseng C.Mey; Panax notoginseng (Burk) F.Chen Ginsenosid nc Glc - Rha Glc Panax ginseng C.Mey Ginsenosid nf Glc - Rha Glc Panax ginseng C.Mey Ginsenosid Rh1 Glc - Rha Glc Panax ginseng C.Mey Pseudoginsenosid- Xyl Glc Panax pseudo ginseng RT3 Wall.

Notoginsenosid R1 Glc - Xyl Glc Panax notoginseng (Burk) F.Chen Notoginsenosid R2 Glc - Xyl Glc Panax notoginseng (Burk) F.Chen Notoginsenosid R3 Glc Glc - Glc Panax notoginseng (Burk) F.Chen Chú thích: Glc: β-Dglucopyranosyl; Arap: α-L-arabinopyranosyl; Araf: α-L- arabinofuranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl. Notoginsenosid R1 được tìm thấy trong Tam thất, Sâm Việt Nam, còn các Ginsenosid (Rg1, Re, Rb1) là hoạt chất điển hình của Tam thất và một số loài sâm (Sâm Trung Quốc, Sâm Hàn Quốc, Sâm Nhật Bản, Sâm Hoa kỳ, Sâm Việt Nam,…). Theo các tài liệu [1,35] Tam thất chứa không ít hơn 0,4% notoginsenosid R1 và không ít hơn 5,0% tổng hàm lượng ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và notoginsenosid R1; Nhân sâm chứa không dưới 0,3% tổng hàm lượng của ginsenosid Rg1 và ginsenosid Re và không dưới 0,2% hàm lượng ginsenosid Rb1; Sâm Việt Nam chứa không ít hơn 0,5% ginsenosid Rb1, 0,5% ginsensosid Rd, 1,5% ginsenosid-Rg1 [1]. Đặc điểm tính chất và tác dụng 1.

Công thức cấu tạo của Notoginsenosid R1 [17] - Công thức phân tử: C47H80O18 - Khối lượng phân tử: 933,1273 g/mol - Tên khoa học: (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S)-2 [(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-6- [(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5R)- 3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14- pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy-6 (hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol. - Tính chất: [28, 49, 50] + Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà. + Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và methanol, tan trong dimethyl sulfoxide. 6 + Độ tan trong nước là 1 mg/ml.

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 208 nm. + Nhiệt độ nóng chảy khoảng 215-217 oC. - Notoginsenosid R1 có nhiều tác dụng dược lý quý được xác định như: + Thúc đẩy sự gia tăng hoạt động của alkaline phosphatase (ALP) tiền nguyên bào xương, tăng biểu hiện của osteocalcin và chất khoáng, giúp ích cho quá trình tái tạo và khoáng hóa xương [51]. + Tác động lên các thụ thể estrogen, kích thích hoạt động sao chép của yếu tố đáp ứng estrogen phosphorylated-luciferase và gây ra sự phosphoryl hóa trong hBMSC, tác động lên quá trình phân hoá và khoáng hóa osteoblast [46].

+ Ức chế oxy hóa lipoprotein mật độ thấp sản xuất ra các cytokine gây viêmtrong tế bào nội mô người EAhy926, ức chế sản xuất TNF-α (tumor necrosis factors) và interleukin (IL) làm giảm đáng kể sự xuất hiện của khối u [20,21,34]. + Giảm sự phá hủy của amyloid-β gây ra trong tế bào thần kinh bằng cách ức chế các dạng oxy phản ứng và điều chỉnh mitogen-activated protein kinase (MAPK) kích hoạt. Có tác dụng rõ rệt trong điều trị bệnh lý Alzheimer và các bệnh thuộc hệ thần kinh [15]. + Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các thành phần của hệ thống tiêu sợi huyết trong nuôi cấy tế bào động mạch phổi và tế bào vi mạch nội mô da người, tăng tổng hợp loại plasminogen kích thích (t-PA) và giảm loại plasminogen ức chế (PAI-1) trong tĩnh mạch rốn nội mô người [51,28].

Ginsenosid Rg1: - Công thức phân tử: C42H72O14 - Khối lượng phân tử: 801,024 g/mol - Tên khoa học: 7 (2R,3R,4S,5S,6R)-2 [[(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-3,12- dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-17-[(2S)-6-methyl-2- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept- 5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H- cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Hình 1. Công thức cấu tạo của Ginsenosid Rg1 [17] - Tính chất [31,54,55]: + Bột kết tinh màu trắng. + Tan trong nước, trong etanol khan và trong metanol. + Độ tan trong nước là 1 mg/ml.

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203 nm. + Nhiệt độ nóng chảy khoảng 188-191 oC. - Tác dụng dược lý: + Ginsenosid Rg1 có tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa, thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương và tác dụng bảo vệ thần kinh [3,7,27,29]. 8 + Ginsenosid Rg1 có tác dụng chống sự tạo thành huyết khối, chống sự ngưng tập tiểu cầu do ức chế sự hình thành thromboxan trong tiểu cầu, ức chế sự hình thành sợi huyết do kích thích enzym làm phân hủy sợi huyết.

Làm giãn mạch [3,16,27]. + Bảo vệ tế bào gan, chống ung thư, điều hòa miễn dịch [3,19,24,25,26,27]. Ginsenosid Re: Hình 1. Công thức cấu tạo của Ginsenosid Re [17] - Công thức phân tử: C48H82O18 - Khối lượng phân tử: 947,2 g/mol - Tên khoa học: (2 S , 3 R , 4 R , 5 R , 6 S ) -2 - [(2 R , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R ) -2 - [[(3 S , 5 R , 6 S , 8 R , 9 R , 10 R , 12 R , 13 R , 14 R , 17 S ) -3,12-dihydroxy- 4,4,8,10,14-pentametyl-17 - [(2 S ) -6 -metyl-2 - [(2 S , 3 R , 4 S , 5 S , 6 R) -3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-2-yl] oxyhept-5-en-2-yl] 2,3,5,6,7,9,11,12,13, 15,16,17-dodecahydro-1 H -cyclopenta [a] 9 phenanthren-6-yl] oxy] -4,5-dihydroxy-6- (hydroxymetyl) oxan-3-yl] oxy- 6-metyloxane-3,4 , 5-triol - Tính chất: + Bột kết tinh màu trắng + Tan trong nước, trong etanol 96% và trong metanol + Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203 nm.

- Tác dụng dược lý: + Ginsenosid Re có tác dụng làm giãn mạch, ngăn ngừa co thắt động mạch, chống thiếu máu cục bộ, chống loạn nhịp [3,16,23]. + Ginsenosid Re cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức chế sự liên kết của lipopolysaccharide với TLR4 (Toll-like receptor 4) trên đại thực bào [30]. + Chống oxy hóa, giảm β-amyloid hiệu quả trong điều trị Alzeimer [3,23,24,25,27]. Ginsenosid Rb1: Hình 1.