Xây dựng phương pháp định lượng Majonoside R2 trong Sâm Ngọc Linh bằng LC-MS

Luận văn trình bày chi tiết phương pháp định lượng Majonoside R2 trong chế phẩm sâm Ngọc Linh bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hiện đại.

• Tác giả: Nguyễn Chính Khoa
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng Majonoside R2 trong chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ Dược học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Sâm Ngọc Linh Và Majonoside R2

Sâm Ngọc Linh là một loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam, nổi tiếng với giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Thành phần hóa học chủ yếu của sâm bao gồm các saponosid (ginsenosid), polysaccharide và các hợp chất hữu cơ khác. Trong đó, Majonoside R2 là một compound đặc biệt quan trọng, thuộc nhóm dammarane-type triterpenoid saponin, được công nhận có tác dụng chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và hỗ trợ sức khỏe tổng thể. Việc định lượng Majonoside R2 trong các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh là cần thiết để đảm bảo chất lượng, hiệu lực và an toàn của sản phẩm dược phẩm trên thị trường.

1.1. Đặc Điểm Và Thành Phần Hóa Học Của Sâm Ngọc Linh

Sâm Ngọc Linh chứa nhiều thành phần hóa học quý giá bao gồm các ginsenosid, polysaccharide, amino acid và vitamin. Phần dưới mặt đất (rễ) có nồng độ cao các saponosid trong đó Majonoside R2 là một trong những thành phần chính. Phần trên mặt đất (thân, lá) cũng chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các tác dụng của sâm bao gồm tăng cường sức đề kháng, cải thiện suy nhược, hỗ trợ sinh lý.

1.2. Công Thức Cấu Tạo Và Tính Chất Của Majonoside R2

Majonoside R2 là một dammarane triterpenoid saponin với công thức phân tử C₅₁H₈₆O₂₂. Hợp chất này có khả năng tan trong dung môi cực như ethanol và methanol. Tính chất hóa học của Majonoside R2 cho phép sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để tách riêng và định lượng. Hợp chất này ổn định trong điều kiện phòng nhiệt độ bình thường.

II. Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Khối Phổ LC MS Trong Phân Tích

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là phương pháp phân tích hiện đại, kết hợp ưu điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ. Phương pháp này cho phép tách riêng, xác định định tính và định lượng các hợp chất trong mẫu phức tạp như chiết xuất sâm Ngọc Linh. LC-MS cung cấp độ nhạy cảm cao, độ chính xác tốt, thời gian phân tích ngắn và yêu cầu lượng mẫu nhỏ. Trong phân tích Majonoside R2, phương pháp này giúp xác định chính xác nồng độ trong các chế phẩm dược phẩm, đảm bảo tuân thủ tiêu chuẩn chất lượng và quy định pháp luật.

2.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Sắc Ký Lỏng Khối Phổ

Sắc ký lỏng khối phổ hoạt động theo nguyên tắc tách các hợp chất dựa trên sự khác nhau về độ polarity trên cột sắc ký, sau đó ion hóa bằng nguồn ion hóa (ESI, APCI, APPI) và phát hiện bằng bộ phân tích khối lượng. Quá trình này cho phép định tính dựa trên thời gian lưu giữ và m/z, cũng như định lượng dựa trên diện tích peak.

2.2. Các Thành Phần Chính Của Hệ Thống LC MS

Hệ thống LC-MS gồm: (1) Hệ thống sắc ký lỏng với bơm, tiêm và cột tách; (2) Nguồn ion hóa chuyển các phân tử thành ion; (3) Bộ phân tích khối lượng (quadrupole, time-of-flight, ion trap); (4) Detector ghi nhận tín hiệu. Mỗi thành phần đều quan trọng để đạt độ nhạy và độ chính xác cao trong định lượng Majonoside R2.

III. Quy Trình Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2

Xây dựng phương pháp định lượng Majonoside R2 bằng LC-MS yêu cầu các bước quan trọng: khảo sát điều kiện khối phổ, lựa chọn cột sắc ký phù hợp, tối ưu hóa pha động, khảo sát quy trình xử lý mẫu bao gồm dung môi chiết, thời gian chiết và số lần chiết. Chuẩn bị mẫu chuẩn Majonoside R2 độ tinh khiết cao là bước cơ bản. Sau đó tiến hành định tính xác nhận đây là Majonoside R2 dựa trên thời gian lưu giữ, m/z của ion phân tử và các ion mảnh. Cuối cùng tiến hành định lượng bằng cách so sánh diện tích peak của mẫu với đường chuẩn.

3.1. Khảo Sát Và Lựa Chọn Điều Kiện Sắc Ký Tối Ưu

Quá trình khảo sát điều kiện sắc ký bao gồm: (1) lựa chọn cột sắc ký (thường C18 reversed-phase); (2) tối ưu hóa thành phần và tỷ lệ pha động (nước - acetonitrile hoặc methanol với các acid bổ sung); (3) khảo sát thể tích tiêm mẫu; (4) điều chỉnh tốc độ dòng. Mục tiêu là đạt được peak Majonoside R2 sắc nét, thời gian phân tích vừa phải (15-30 phút).

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Xử Lý Mẫu

Xử lý mẫu là bước quan trọng ảnh hưởng đến kết quả. Cần khảo sát: (1) dung môi chiết (ethanol, methanol hoặc hỗn hợp); (2) thời gian chiết (20-60 phút với siêu âm hoặc maceration); (3) số lần chiết (thường 2-3 lần). Mẫu được lọc qua màng Millipore 0.22 μm trước khi tiêm vào hệ thống LC-MS để loại bỏ các hạt rắn.

IV. Thẩm Định Phương Pháp Và Ứng Dụng Thực Tiễn

Sau khi xây dựng phương pháp LC-MS định lượng Majonoside R2, cần tiến hành thẩm định phương pháp để đảm bảo độ tin cậy, độ chính xác và tính ổn định. Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm: độ phù hợp của hệ thống (hệ số nhưng loạng RSD < 5%), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) xác định bằng thử nghiệm từng bước với nồng độ giảm dần. Phương pháp được xác nhận khi đáp ứng các tiêu chuẩn. Sau đó, phương pháp được áp dụng phân tích các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường để đánh giá nồng độ Majonoside R2 và đảm bảo chất lượng.

4.1. Các Chỉ Tiêu Thẩm Định Phương Pháp LC MS

Thẩm định phương pháp bao gồm: (1) Độ phù hợp hệ thống: RSD < 5% cho 6 lần tiêm liên tiếp; (2) LOD và LOQ: xác định bằng phương pháp signal-to-noise ratio (S/N = 3 cho LOD, S/N = 10 cho LOQ); (3) Độ chính xác: recovery 95-105%; (4) Độ lặp lại: RSD < 10%. Các chỉ tiêu này tuân thủ hướng dẫn IUPAC và AOAC.

4.2. Ứng Dụng Phương Pháp Trên Các Chế Phẩm Thực Tế

Phương pháp LC-MS được áp dụng phân tích các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh như viên nang, nước sắc, cao sâm để định lượng Majonoside R2. Kết quả phân tích cho phép đánh giá chất lượng sản phẩm, đảm bảo nồng độ hoạt chất đáp ứng tiêu chuẩn. Phương pháp này hỗ trợ công tác quản lý chất lượng, kiểm nghiệm thuốc và dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng, cùng với đó là nguồn dược liệu làm thuốc rất phong phú. Từ hàng ngàn năm trước, các loại dược liệu đã được sử dụng để phòng, chữa bệnh và có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người. Sử dụng các loại dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên (đông dược) đang là xu hướng phát triển chủ yếu không chỉ ở Việt Nam mà còn rất nhiều nước châu Á. Các thành phần tự nhiên trong dược liệu thân thiện với sức khỏe con người, ít độc hại và ít gây tác dụng không mong muốn hơn so với thuốc tân dược.

Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis, là một loài cây thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1973 tại núi Ngọc Linh, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum [4]. Sâm Ngọc Linh là loại sâm đặc biệt quý hiếm, chỉ có tại Việt Nam. Trước đây, người dân sử dụng sâm Ngọc Linh theo các bài thuốc cổ truyền để chữa rất nhiều bệnh.

Sau khi được tìm thấy và xác nhận danh tính, sâm Ngọc Linh được nghiên cữu kỹ hơn, các nhà khoa học đã phát hiện ra 52 loại saponin trong củ sâm, có những chất chưa từng được phát hiện trong các loại sâm khác [18], [19], [20]. Các nghiên cứu về tác dụng của sâm Ngọc Linh cũng được tiến hành và cho thấy nhiều kết quả khả quan. Chính vì vậy, hiện nay trên thị trường có rất nhiều các sản phẩm từ sâm Ngọc Linh như sâm tươi, cao sâm và các chế phẩm khác. Majonoside R2 là saponin chiếm tỷ lệ cao nhất trong sâm Ngọc Linh [1], [5], đây cũng là hoạt chất đặc trưng chỉ có ở sâm Ngọc Linh mà không có ở bất kỳ loại sâm nào đã được phát hiện trước đó.

Do đó, việc định tính và định lượng Majonoside R2 có ý nghĩa rất quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng sâm Ngọc Linh cũng như các chế phẩm liên quan. Trong Dược điển Việt Nam V đã có chuyên luận về định lượng Majonoside R2 trong dược liệu sâm Ngọc Linh theo phương pháp HPLC [3]. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu định lượng Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh [1], [5], [28]. Tuy nhiên, đối với các chế 1 phẩm trên thị trường ngoài thành phần Sâm Ngọc Linh thì còn có nhiều dược liệu khác nên các phương pháp này rất khó có thể tách và định lượng được Majonoside R2, mà yêu cầu một phương pháp đặc hiệu hơn.

Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa Sâm Ngọc Linh chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng Majonoside R2 trong chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần” với các mục tiêu sau: Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng Majonoside R2 trong các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Áp dụng phương pháp để định tính, định lượng Majonoside R2 trong một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường. Tổng quan về sâm Ngọc Linh 1. Đặc điểm của sâm Ngọc Linh  Tên khoa học Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis Ha & Grushv.1985 thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales), lớp Mộc lan (Magnoliopsida), ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [4].

 Đặc điểm thực vật Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3-110 cm. Thân rễ tạo thành các đốt, nằm ngang, có thể phân nhánh, đường kính từ 1-2cm. Phần mang lá từ 1-5 thân, tùy theo số đầu nhánh của thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng, ở ngọn, mỗi lá kép gồm 3-5 lá chét, lá chét hình bầu dục thuôn, nhọn hai đầu, 6-14 x 2,5-4cm, mép khía răng cưa.

Cụm hoa tán đơn hay tán kép (thêm 1-2 tán phụ), mọc ở ngọn, chiều dài cuống cụm hoa dài hơn cuống lá, nên thường cao vượt tán lá. Hoa có cuống ngắn, màu trắng xanh, 5 đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị. Bầu 2 ô (nếu thấy 1 ô là do ô còn lại bị chèn ép khó phân biệt), vòi nhụy chẻ 2 ở đầu. Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,5-0,6cm, khi chín có màu đỏ và thường có chấm đen ở đỉnh.

3 Hạt thường 1 hoặc 2, hạt nhỏ gần tròn hoặc giống hình thận, vỏ hạt không nhẵn [2].  Đặc điểm sinh thái Mùa hoa vào tháng 4-5, quả tháng 6-9. Gieo giống tự nhiên bằng hạt. Phần thân rễ bị gãy còn lại có thể tái sinh.

Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới. Cây đặc điểm ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, nhất là dọc theo hành lang ven suối, ở độ cao từ 1900-2300m [2].  Phân bố Trong nước: Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô)[2]. Thế giới: Trung Quốc.

Thành phần hóa học 1. Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất  Hợp chất saponin Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Từ phần dưới mặt đất của sâm Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc 52 hợp chất saponin, trong đó có 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới [2],[18],[19],[20]. Tổng hàm lượng saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ và rễ con lần lượt là 19,52%; 15,59% và 13,93%, cao hơn nhiều so với các loại sâm khác [13].

Các saponin trong sâm Ngọc Linh được chia làm 4 nhóm chính [2]:  Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 20 chất, các chất có hàm lượng lớn là G-Rb1 (2,0%)và G-Rd (0,87%), 2 chất này cũng có trong các loại sâm khác như Nhân sâm [26].  Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatrol gồm 17 chất, trong đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất (1,37%), chất này cũng có trong thành phần của Nhân sâm. 4  Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 chất, trong đó có Majonoside R2 có hàm lượng cao nhất (5,29%) và là hoạt chất hoàn toàn mới, chưa có ở bất kỳ loài sâm nào khác.  Các saponin dẫn chất của acid oleanolic gồm 2 chất.

 Hợp chất polyacetylen Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chủ yếu. Hai hợp chất mới là 10-acetoxyheptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol[3,6,7,11,12,33-35] [2].  Hợp chất Sterol β – Sitosterol và daucosterin (β–Sitosteryl–3 – o - β – D – glucopyranosid) [2].  Hợp chất Glucid Đường tự do: 6,19% Đường toàn phần: 26,77% [2].

 Các thành phần khác: Thành phần acid béo trong rễ củ sâm Ngọc Linh chiếm 0,55%, gồm 17 loại acid béo khác nhau. Trong rễ củ cũng chứa 18 loại acid amin thiết yếu và 20 nguyên tố đa lượng và vi lượng [2]. Thành phần hóa học của phần trên mặt đất Lá sâm và thân giả chứa ít saponin hơn các bộ phận dưới mặt đất, cả về số lượng lẫn hàm lượng. Các saponin phân lập được từ lá sâm gồm 19 saponin, trong đó có 11 chất đã biết và 8 chất mới [2].

Tác dụng của sâm Ngọc Linh  Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [2]. 5  Tác dụng chống trầm cảm: Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200mg/kg hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, Majonoside R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều: 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg [2].  Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [2].  Tác dụng sinh thích ứng: Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều 100mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37– 42oC) và lạnh (-5oC) làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm.

Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc linh liều uống 50 – 100 mg/kg hoặc hoạt chất Majonoside R2 tiêm trong màng bụng liều 3,1; 12,5 mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [2].  Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của dịch não, gan và phân đoạn vi thể gan của mô não chuột và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nông độ 0,05 – 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malondialdehyde là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [2], [23], [34].  Tác dụng kích thích miễn dịch: Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500mg/kg và Majonoside R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng [2].

Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng. nếu kết hợp dùng sâm và Majonoside R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm tăng tác dụng thực bào với E. 6  Tác dụng phục hồi máu: Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm [2].

 Tác dụng khác: Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, chống tăng cholesterol máu, chống viêm, chống đông máu và ức chế sự phát triển của Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [2], [10], [14], [15]. Theo Trần Lê Quân và cộng sự, dịch chiết methanol của sâm Ngọc Linh có tác dụng bảo vệ gan do tác động lên D-galactosamine/yếu tố hoại tử (TNF-α) [29], [30]. Tổng quan về Majonoside R2 1. Công thức cấu tạo và tính chất Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Majonoside R2  Danh pháp IUPAC: (2S,3R,4S,5R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(5R,6R,8S, 9R,10R,12S,13S,14S,17S)-3,12-dihydroxy-17-[(2S,5S)-5-(2-hydroxypropan-2- yl)-2-methyloxolan-2-yl]-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17 -dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol  Công thức phân tử: C41H70O14  Khối lượng phân tử: 786,997 đvC  Độ tan: Majonoside R2 tan được trong methanol, nước, butanol, ethanol.

Tác dụng của Majonoside R2  Tác dụng chống ung thư Majonoside R2 thể hiện tác dụng chống ung thư trên chuột bị ung thư gan sử dụng N-nitrosodiethylamine làm chất gây ung thư [11]. Trong nghiên cứu của Takao Konoshima và cộng sự, Majonoside R2 cho thấy tác dụng ức chế đối với kháng nguyên Epstein-Barr do khối u sinh ra và 12- O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất được sử dụng để sàng lọc hoạt chất chống ung thư). Thử nghiệm được tiến hành trên chuột bị gây ung thư da bởi 7,12-dimethylbenz[a]anthracene [12].