Khóa luận: Xây dựng phương pháp định lượng Acid Ursolic trong Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu, xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid ursolic trong dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo bằng kỹ thuật HPLC-DAD.

• Tác giả: Nguyễn Văn Linh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Lâm Hồng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng acid ursolic trong dược liệu bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa W.) bằng phương pháp HPLC/DAD
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo và Acid Ursolic

Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo (Hedyotis diffusa W.) là một loài thực vật thuộc họ Rubiaceae, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Việt Nam. Đây là dược liệu quý giá với nhiều công dụng chữa bệnh, đặc biệt là trong điều trị các bệnh liên quan đến viêm nhiễm và ung thư. Acid ursolic là một hợp chất triterpenoid quan trọng được phân lập từ dược liệu này, sở hữu nhiều tính chất sinh học lợi ích. Hợp chất này được xem là một trong những thành phần hoạt tính chính đóng vai trò quan trọng trong tác dụng chữa bệnh của Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo. Việc định lượng acid ursolic một cách chính xác là cần thiết để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm được chiết xuất từ loài thực vật này.

1.1. Đặc điểm và phân bố của Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo

Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo là loài cây thảo mộc lâu năm, cao 10-30cm, mọc hoang dã trên các vùng đất ẩm ướt, đất trũng. Thực vật này phân bố rộng rãi tại các khu vực Đông và Đông Nam Á, bao gồm Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan. Bộ phận được sử dụng chủ yếu là toàn cây, đặc biệt là thân và lá. Loài cây này thích hợp với khí hậu nhiệt đới, cần độ ẩm cao để phát triển tốt.

1.2. Thành phần hóa học và tác dụng của Acid Ursolic

Acid ursolic là một hợp chất terpenoid có công thức phân tử C₃₀H₄₈O₃, với các tính chất vật lý đặc trưng. Hợp chất này sở hữu nhiều tác dụng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, và hỗ trợ chống ung thư. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng acid ursolic có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư và giảm chỉ số IL-6 trong cơ thể.

II. Phương pháp HPLC DAD trong Định lượng Acid Ursolic

Phương pháp HPLC/DAD (High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector) đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong định lượng acid ursolic từ các dược liệu. Đây là một kỹ thuật phân tích hiện đại, cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất có liên quan trong mẫu phức tạp. Phương pháp này kết hợp sắc ký lỏng hiệu suất cao với detector mảng diod, giúp cung cấp thông tin phổ quang của các chất phân tích. Định lượng acid ursolic bằng HPLC/DAD có nhiều ưu điểm như độ chính xác cao, thời gian phân tích ngắn, và khả năng phát hiện các tạp chất một cách hiệu quả. Kỹ thuật này được khuyến nghị bởi các tiêu chuẩn quốc tế như AOAC.

2.1. Nguyên lý và ưu điểm của kỹ thuật HPLC DAD

HPLC/DAD hoạt động dựa trên nguyên lý tách chiết các thành phần khác nhau dựa vào độ hấp phụ và cực tính. Detector mảng diod (DAD) cho phép đo độ hấp thụ ánh sáng ở nhiều bước sóng khác nhau, cung cấp phổ UV chi tiết. Ưu điểm của phương pháp này là độ đặc hiệu cao, có thể định lượng chính xác ngay cả trong những mẫu phức tạp có nhiều tạp chất.

2.2. Điều kiện sắc ký tối ưu cho phân tích Acid Ursolic

Để định lượng acid ursolic hiệu quả, cần thiết lập các điều kiện sắc ký tối ưu bao gồm: lựa chọn pha động phù hợp (thường là methanol hoặc acetonitrile), tốc độ dòng, nhiệt độ cột, và bước sóng phát hiện. Các nghiên cứu cho thấy sử dụng cột C18 với gradient elution là lựa chọn tối ưu, cho phép tách biệt rõ ràng acid ursolic với các hợp chất khác.

III. Quy trình Xử lí Mẫu và Chiết Acid Ursolic

Quy trình xử lí mẫu là bước quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả định lượng acid ursolic. Trước tiên, dược liệu Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo cần được sơ chế, làm khô và nghiền thành bột mịn. Sau đó, thực hiện chiết acid ursolic bằng các dung môi hữu cơ phù hợp như ethanol 95% hoặc methanol. Các nghiên cứu cho thấy sử dụng siêu âm (ultrasonic extraction) hoặc hồi lưu (reflux extraction) giúp tăng hiệu suất chiết. Ngoài ra, cần xác định các tham số tối ưu như tỉ lệ dung môi/dược liệu, thời gian chiết, và số lần chiết để đạt hàm lượng acid ursolic cao nhất.

3.1. Khảo sát dung môi và kỹ thuật chiết

Việc lựa chọn dung môi chiết ảnh hưởng lớn đến hiệu suất định lượng acid ursolic. Các dung môi phổ biến bao gồm ethanol 95%, methanol, và nước chưng cất. Kết quả khảo sát cho thấy ethanol 95% cho hiệu suất chiết cao nhất (khoảng 2,5-3,2%). Kỹ thuật chiết như siêu âm hoặc hồi lưu cũng cần được so sánh để chọn ra phương pháp tối ưu nhất.

3.2. Tối ưu hóa các tham số chiết

Các tham số cần tối ưu bao gồm tỉ lệ dung môi/dược liệu (1:10 đến 1:20), thời gian chiết (30-60 phút), và số lần chiết (1-3 lần). Khảo sát cho thấy tỉ lệ 1:15, thời gian 45 phút, và 2 lần chiết đạt hàm lượng acid ursolic tối ưu khoảng 3,0% từ dược liệu khô.

IV. Thẩm định Phương pháp và Ứng dụng Thực tiễn

Thẩm định phương pháp phân tích là bước đoản thiết để đảm bảo độ tin cậy của định lượng acid ursolic bằng HPLC/DAD. Quá trình thẩm định bao gồm kiểm tra độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chính xác, và đường chuẩn tuyến tính. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt các tiêu chuẩn quốc tế, với LOD khoảng 0,05 µg/mL và LOQ khoảng 0,15 µg/mL. Phương pháp này đã được thành công ứng dụng để định lượng acid ursolic trong các mẫu Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo thu hái từ thị trường, với hàm lượng chung khoảng 2,1-3,5% trên khối lượng khô.

4.1. Các tiêu chí thẩm định quan trọng

Độ đặc hiệu được xác định bằng cách so sánh phổ UV của acid ursolic chuẩn với mẫu, với hệ số chồng phổ > 0,98. Đường chuẩn tuyến tính được thiết lập với R² > 0,999 trong khoảng nồng độ 5-100 µg/mL. Độ lặp lại của phương pháp (RSD) < 2%, và độ chính xác được đánh giá qua phục hồi 95-105% từ các mẫu được bổ sung acid ursolic chuẩn.

4.2. Ứng dụng trong kiểm nghiệm dược liệu

Phương pháp định lượng acid ursolic đã được xây dựng có thể áp dụng để kiểm định chất lượng các sản phẩm Bạch Hoa Xà Thiệt Thảo trên thị trường. Kết quả phân tích các mẫu trong thương mại cho thấy hàm lượng acid ursolic dao động từ 2,1% đến 3,5% (tính trên khối lượng dược liệu khô), phản ánh chất lượng không đồng đều. Phương pháp này có thể được đưa vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm để đảm bảo hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch hoa xà thiệt thảo có tên khoa học là (Hedyotis diffusa Willd.) thuộc họ cà phê ( Rubiaceae) [1]. Bạch hoa xà thiệt thảo là vị thuốc được sử dụng khá phổ biến trong Y học cổ truyền dùng làm thuốc chống viêm, chữa phế nhiệt, hen suyễn, viêm họng, viêm amydal, viêm đường tiết niệu, viêm vùng chậu [2]. Nghiên cứu tác dụng dược lý cho thấy các hợp chất thực vật và chiết xuất thực vật này thể hiện một loạt các hoạt động dược lý như chống oxy hóa, chống viêm, chống nguyên bào sợi, điều hòa miễn dịch, bảo vệ thần kinh và đặc biệt là tác dụng chống ung thư [3], [4]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy triterpenoid là một trong những nhóm chất chính của Bạch hoa xà thiệt thảo, trong đó acid ursolic chiếm hàm lượng lớn.

Nhiều nghiên cứu hiện đại đã chứng minh rằng các tác dụng sinh học của dược liệu này có liên quan đến acid ursolic là một thành phần đáng chú ý với các tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và kháng ung thư. Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V có chuyên luận về Bạch hoa xà thiệt thảo nhưng chưa có chỉ tiêu định lượng cho chất này cũng như dược liệu này. Xuất phát từ thực tế trên, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp định lượng acid ursolic trong dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) bằng phương pháp HPLC/DAD” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng acid ursolic trong dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) bằng phương pháp HPLC/DAD.

Áp dụng quy trình định lượng đã xây dựng để kiểm tra hàm lượng acid ursolic trong dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) thu thập trên thị trường Việt Nam. Tổng quan về Bạch hoa xà thiệt thảo 1. Đặc điểm thực vật Vị trí phân loại họ Cà phê (Theo hệ thống phân loại Kew) Giới: Plantae (Thực vật bậc cao) Ngành: Streptophyta (Thực vật trên cạn và một số tảo lục) Lớp: Equisetopsida (Thực vật có mạch) Phân lớp: Magnoliidae (Bạc hà) Bộ: Gentianales (Bộ Long đởm) Họ: Rubiaceae (Họ Cà phê) Chi: Scleromitrion (Hedyotis L.) Loài: Scleromitrion diffusum Bạch hoa xà thiệt thảo có tên khoa học là Hedyotis diffusa (Willd.) thuộc họ cà phê (Rubiaceae) [1]. Tên gọi khác: An điền bò, An điền lan, Bò ngòi bò, Lưỡi rắn trắng [5].

Bạch hoa xà thiệt thảo là cây thảo mọc bò, sống hàng năm, dài 20-25 cm [2]. Thân màu nâu nhạt, tròn ở gốc, thân non có bốn cạnh, mang rất nhiều cành. Lá hình mác thuôn, dài khoảng 1,5 cm đến 3,5 cm, rộng 1 mm đến 2 mm, nhọn ở đầu, màu xám, dai, gần như không có cuống, lá kèm khía răng cưa ở đỉnh [1]. Hoa mọc đơn độc, hoặc từng đôi ở nách lá.

Hoa nhỏ có 4 lá đài hình giáo nhọn, ống đài hình cầu. Tràng gồm 4 cánh hoa, 4 nhị dính ở họng ống tràng. Quả bé, bầu hạ, còn đài, hình cầu hơi dẹt ở 2 đầu, bên trong có chứa nhiều hạt nhỏ, có góc cạnh [1]. Mùa hoa quả từ tháng 6-9 [5].

Hình ảnh cây Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa W. Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng của Bạch Hoa xà thiệt thảo Bạch hoa xà thiệt thảo là một loại thảo mộc hàng năm, phân bố rộng rãi ở phương Đông và châu Á nhiệt đới, như Trung Quốc, Nhật Bản và Indonesia[3]. Ở Việt Nam, Bạch hoa xà thiệt thảo phân bố ở các tỉnh ven biển miền Trung và trung du Bắc Bộ [2]. Phân bố ở một số tỉnh ở Việt Nam như: Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình (Phương Mai, Khang Thượng), Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Kon Tum (Đắk Glei, Sa Thầy), Lâm Đồng (Lang Bian, Đức Trọng), Đồng Nai (Biên Hòa), Tp.

Hồ Chí Minh, Bà Rịa-Vũng Tàu (Côn Đảo) [5] Bạch hoa xà thiệt thảo là cây ưa ẩm, ưa sáng thường mọc rải rác hoặc thành từng đám ở vườn, ven đường đi và nhất là ở các gò đất cao, ruộng trồng màu ở vùng trung du. Hàng năm, cây con mọc từ hạt và sinh trưởng, phát triển nhanh trong mùa hè. Sau khi có hoa quả, toàn cây tàn lụi vào giữa mùa thu. Cần lưu ý, hạt Bạch hoa xà thiệt thảo tồn tại 5- 6 tháng qua mùa đông và gần hết mùa xuân năm sau mới nảy mầm [2].

Bộ phần dùng của cây Bạch hoa xà thiệt thảo là toàn cây, thu hái vào mùa hạ, thu, rửa sạch rồi phơi hoặc sấy khô [2]. Thành phần hóa học Nhiều nghiên cứu về Bạch hoa xà thiệt thảo đã tiết lộ một số lượng lớn các hợp chất thực vật quan trọng, bao gồm iridoid, triterpen, flavonoid, anthraquinone, axit phenolic và các dẫn xuất của chúng, sterol, alkaloid, tinh dầu dễ bay hơi, polysaccharide, cyclotide, coumarin và alkaloid. Cho đến nay, 171 hợp chất đã được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo, bao gồm 32 iridoid, 26 flavonoid, 24 anthraquinone, 26 phenolic và các dẫn xuất của chúng, 50 loại tinh dầu dễ bay hơi và 13 hợp chất hỗn hợp [3]. Công thức cấu tạo của một số hợp chất được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo được trình bày trong bảng 1.

Một số hợp chất được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo TT Tên hợp chất TLTK Triterpen 1 Arborinone [3], [6] 2 Isoarborinol [3], [6] 3 Acid ursolic [3], [6] 4 Acid oleanolic [3], [6] Iridoid 5 Asperuloside [3], [7] 3 6 Deacetyl asperuloside [3] 7 Acid asperulosidic [3] 8 Acid deacetyl asperulosidic [3] 9 Deacetyl asperulosidic acid methyl ester [3], [8] 10 Acid geniposidic [3] 11 ( E )-6- O - p -Coumaroyl scandoside methyl ester [3] 12 ( E )-6- O -Feruloyl scandoside metyl ester [3] Flavonoid 13 Quercetin [3], [9] 14 Rutin [3] 15 Quercetin-3-O-β-D-glucopyransid [3] 16 Quercetin-3-O-sambubiosid [3] 17 Kaempferol [3] 18 Kaempferol-3-O-β-D-glucopyransid [3] Anthraquinone 19 2-hydroxy-3-methoxy-7-methyl anthraquinone [3] 20 2-hydroxy-1-methoxy anthraquinone [3] 21 2-hydroxy-3-methyl anthraquinone [3], [8] 22 2-hydroxymethyl anthraquinone [3] Acid phenolic và dẫn chất của chúng 23 Acid 4-hydroxy-3-methoxy benzoic [3] 24 Acid p-coumaric [3] 25 Acid caffeic [3] 26 Acid ferulic [3] Sterol 27 Daucosterol [3] 28 β-sitosterol [3] 29 stigmasterol [3], [8] Các hợp chất khác 30 7-hydroxy-6-methoxy-coumarin [3] 31 Esculetin [3] 32 10(S)-hydroxy pheophytin a [3] 33 Aurantiamid acetat [3] 4 Hình 1. Công thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo 1. Tác dụng dược lý Nhiều kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý của Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy dược liệu này có nhiều tác dụng đáng chú ý như: chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và một số tác dụng khác. Tác dụng chống ung thư Bạch hoa xà thiệt thảo đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính và nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dịch chiết từ Bạch hoa xà thiệt thảo có tác dụng chống khối u rõ ràng.

Chiết xuất ethanol của dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo gây ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư trực tràng HT-29 và gây ra chứng apoptosis thông qua việc vô hiệu hóa con đường truyền tín hiệu interleukin-6. Nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết ethanol của dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo làm giảm khả năng sống và tăng sinh của các tế bào HT-29 khi không có sự kích thích của IL-6. Ở những tế bào kích thích IL-6 làm tăng đáng kể khả năng sống của các tế bào HT-29 lên 162,17% so với các tế bào đối chứng (P <0,05). Dịch chiết ethanol của dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo ở liều 1, 3 và 5 mg/ml trong 24 giờ làm giảm khả năng sống của các tế bào được kích thích bằng IL-6 trên từ 95,60% xuống 40,76% theo cách phụ thuộc vào liều lượng [10].

Nghiên cứu của Chen Xu-Zheng và cộng sự (2012) chỉ ra dịch chiết nước của Bạch hoa xà thiệt thảo ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 thông qua việc ngăn chặn các tế bào HepG2 ở pha G0/G 1 và gây ra sự chậm trễ của pha S. Nồng độ dịch chiết để ức chế 50% sự phát triển của tế bào HepG2 (IC 50 ) khoảng 4,62 mg/ml. Khi tế bào HepG2 được xử lý bằng dịch chiết ở liều 4,62 mg/ml, tỷ lệ tế bào ở pha G0/G1 tăng từ 48,16±3,11–57,71±2,29% (P < 0,05) và tỷ lệ tế bào ở pha S giảm từ 35,73±2,56– 24,71±1,43% (P < 0,01) [11]. Dịch tiêm của Bạch hoa xà thiệt thảo có thể thúc đẩy sự biệt hóa tế bào ung thư bạch cầu HL-60 và ngăn chặn sự biểu hiện của gen liên quan đến chống apoptosis để ức chế sự phát triển của tế bào HL-60.

Kết quả cho thấy sự phát triển của tế bào HL-60 bị ức chế bởi nồng độ Bạch hoa xà thiệt thảo cao (3,12-12,5 ml/L) và bị ức chế rõ ràng theo cách phụ thuộc vào liều lượng [12]. Ngoài ra còn sử dụng trong hỗ trợ và điều trị một số ung thư khác như: ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, khối u cổ tử cung, bệnh u đa tủy [3]. Tác dụng chống viêm Về tác dụng chống viêm, nước sắc Bạch hoa xà thiệt thảo tăng cường khả năng thực bào của hệ thống nội lưới – nội mô (reticulo endothelial) và của tế bào bạch cầu [2]. Tác dụng bảo vệ của cây Bạch hoa xà thiệt thảo đối với tình trạng viêm thận do lipopolysaccharide (LPS) gây ra đã được đánh giá thông qua việc đo nồng độ các cytokine và chemokine liên quan đến phản ứng viêm.

Kết quả cho thấy, dịch chiết nước của Bạch hoa xà thiệt thảo (với liều tương đương 5,0 g/kg trọng lượng cơ thể) có tác dụng bảo vệ rõ rệt đối với mô thận[13]. 6 Cao chiết Bạch hoa xà thiệt thảo được khảo sát hoạt tính chống viêm bằng phương pháp ức chế sự biến tính protein huyết thanh bò và albumin trứng với kết quả cao chiết Bạch hoa xà thiệt thảo ở nồng độ 200 μg/mL có khả năng ức chế sự biến tính albumin huyết thanh bò đạt 60,30±6,04% và ức chế sự biến tính albumin trứng đạt 57,07±5,93% [14]. Tác dụng chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH và khử sắt cho thấy cao chiết Bạch hoa xà thiệt thảo có hoạt tính chống oxy hóa khá cao. Cao chiết Bạch hoa xà thiệt thảo ở nồng độ 500 μg/mL cho hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH 58,76±0,73% [14].

Chiết xuất nước của Bạch hoa xà thiệt thảo có tác dụng chống oxy hóa tốt trong thử nghiệm DPPH với nồng độ dọn gốc tự do 50% ở 0,153 mg/mL. Chiết xuất nước của Bạch hoa xà thiệt thảo làm đảo ngược hoạt động do H2O2 gây ra của con đường MEK/ERK và ức chế do H2O2 gây ra của con đường P13-K/AKT/GSK3b trong tế bào gan LO2.