Xây dựng phương pháp HPLC định lượng acid thioctic - Khóa luận Dược sĩ Lê Huy Hiệu

Tham khảo khóa luận xây dựng phương pháp định lượng acid thioctic bằng HPLC. Quy trình thẩm định chi tiết trong nguyên liệu thioctat trometamol.

• Tác giả: Lê Huy Hiệu
• Người hướng dẫn: Thạc Sĩ Ngô Quang Trung
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Acid Thioctic Trong Nguyên Liệu Thioctat Trometamol Bằng Kỹ Thuật HPLC
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Acid Thioctic và Thioctat Trometamol

Acid thioctic (ALA - Alpha-lipoic acid) là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử C₈H₁₄O₂S₂, chứa một vòng dithiolane năm nguyên tử. Đây là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ tự nhiên, được cơ thể con người sản xuất nhưng với lượng nhỏ. Acid thioctic có khả năng hòa tan trong cả dung môi phân cực và không phân cực, làm cho nó trở thành một phân tử linh hoạt để điều chế dược phẩm.

Thioctat trometamol là muối của acid thioctic với trometamol, cải thiện đáng kể sinh khả dụng và ổn định hóa học so với acid thioctic nguyên chất. Hợp chất này được sử dụng rộng rãi trong các công thức dược phẩm để tăng cường hiệu quả trị liệu và giảm các vấn đề tiêu hóa liên quan đến acid nguyên chất. Muối thioctat trometamol mang lại nhiều lợi ích lâm sàng đáng kể.

1.1. Đặc điểm hóa học của Acid Thioctic

Acid thioctic sở hữu công thức cấu tạo độc đáo với hai nhóm thiol (-SH) được kết nối trong một vòng dithiolane. Cấu trúc này cho phép nó tham gia vào các phản ứng redox quan trọng. Phân tử này có khối lượng phân tử 206,33 g/mol và thường được tìm thấy ở dạng hoạt tính sinh học với độ tinh khiết cao. Tính chất này làm cho nó trở thành chất chuẩn lý tưởng cho các phương pháp phân tích hiệu năng cao.

1.2. Ưu điểm của muối Thioctat Trometamol

Muối trometamol thioctat cung cấp độ ổn định tốt hơn, tính hòa tan cao hơn và khả năng hấp thụ tăng cường. Trometamol là một tác nhân kiềm yếu, giúp bảo vệ acid thioctic khỏi phân hủy. Công thức này thích hợp cho các đường dùng khác nhau bao gồm tiêm tĩnh mạch và uống đường miệng, mở rộng khả năng ứng dụng lâm sàng.

II. Ứng dụng lâm sàng của Thioctat Trometamol

Thioctat trometamol đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ và khả năng điều chỉnh các đường dẫn truyền tín hiệu sinh học quan trọng. Nó có tiềm năng trong điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh Alzheimer và các bệnh ung thư nhất định. Các nghiên cứu cho thấy rằng acid thioctic có thể giảm nồng độ gốc oxy hóa hoạt động (ROS) và tăng cường hoạt động của AMPK protein kinase. Những tính chất này kích hoạt các cơ chế bảo vệ tế bào, cải thiện chuyển hóa glucose, và hỗ trợ chức năng thần kinh. Sự hiểu biết sâu sắc về các cơ chế hoạt động này là nền tảng cho việc phát triển các liệu pháp hiệu quả.

2.1. Khả năng chống tiểu đường

Acid thioctic có khả năng cải thiện nhạy cảm insulin và giảm kháng insulin ở bệnh nhân đái tháo đường type 2. Nó tham gia vào quá trình chuyển hóa glucose bằng cách kích hoạt AMPK pathway quan trọng. Các bằng chứng lâm sàng cho thấy sử dụng thioctat trometamol giúp kiểm soát mức đường huyết tốt hơn và giảm các biến chứng liên quan đến neuropathy chu biên trong bệnh tiểu đường.

2.2. Tiềm năng chống Alzheimer và ung thư

Nghiên cứu gợi ý rằng acid thioctic có thể giảm tích lũy amyloid beta (Aβ) và viêm trong não, hai yếu tố chính trong bệnh Alzheimer. Ngoài ra, khả năng ức chế COX và điều chỉnh EGFR signaling của nó cho thấy tiềm năng chống ung thư. Hoạt động chống viêm thông qua giảm TNF-α, IL-6, IL-1β làm cho nó trở thành ứng cử viên hứa hẹn cho các bệnh viêm mãn tính.

III. Phương pháp HPLC trong Định lượng Acid Thioctic

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích chính xác, nhanh chóng và đáng tin cậy để định lượng acid thioctic trong các mẫu dược phẩm. Kỹ thuật này cho phép tách riêng các thành phần dựa trên tương tác hóa học với pha tĩnh và pha động. Phương pháp HPLC cung cấp độ phân giải cao, độ nhạy cao, và khả năng định lượng chính xác hàng loạt mẫu. Nó có khả năng xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thioctat trometamol, đánh giá sự ổn định của sản phẩm trong các điều kiện bảo quản khác nhau, và phát hiện các tạp chất tiềm ẩn. HPLC là tiêu chuẩn vàng trong kiểm nghiệm chất lượng dược phẩm.

3.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC

Một hệ thống HPLC bao gồm bơm cao áp, bộ tiêm mẫu tự động, cột phân tách, và bộ phát hiện UV-Vis. Bơm tạo áp lực cao để đưa pha động qua cột với tốc độ chính xác. Mẫu được tiêm vào và tương tác với pha tĩnh trong cột. Các hợp chất tách riêng dựa trên độ ái lực khác nhau, được phát hiện bởi detector UV tại bước sóng cụ thể.

3.2. Các thông số đặc trưng trong HPLC

Các thông số quan trọng bao gồm thời gian lưu trữ (tR), hệ số phân tách, độ phân giải, và hiệu suất cột. Độ đặc hiệu được đánh giá bằng cách khảo sát bước sóng phát hiện (thường 254-268 nm cho acid thioctic). Pha động tối ưu thường là hỗn hợp acetonitril và dung dịch đệm kali phosphate với pH điều chỉnh, đảm bảo phân tách tốt và baseline ổn định.

IV. Thẩm định phương pháp phân tích HPLC

Thẩm định phương pháp là quy trình thiết yếu để đảm bảo độ tin cậy và độ chính xác của phương pháp HPLC theo hướng dẫn ICH. Quá trình này bao gồm đánh giá độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại, và độ chính xác trung gian. Mỗi thông số được kiểm tra kỹ lưỡng để xác nhận rằng phương pháp có khả năng định lượng chính xác acid thioctic trong thioctat trometamol. AOAC International và ICH đã thiết lập các tiêu chuẩn nghiêm ngặt cho thẩm định phương pháp phân tích trong lĩnh vực dược phẩm, đảm bảo mức độ tin cậy cao nhất trong kiểm nghiệm chất lượng.

4.1. Độ thích hợp hệ thống và Độ đặc hiệu

Độ thích hợp hệ thống (SST) được đánh giá bằng cách tiêm chuẩn nhiều lần để xác minh rằng độ lặp lại và hình dạng peak là chấp nhận được. Độ đặc hiệu được xác định bằng cách khảo sát các mẫu chứa tạp chất tiềm ẩn để đảm bảo rằng acid thioctic được xác định rõ ràng mà không bị can thiệp từ các hợp chất khác. Độ tuyến tính được thiết lập bằng cách phân tích các nồng độ khác nhau của chuẩn acid thioctic để xác nhận mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.

4.2. Độ chính xác Độ lặp lại và Độ chính xác trung gian

Độ chính xác (accuracy) được đánh giá bằng cách phục hồi chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau (80%, 100%, 120%). Độ lặp lại (repeatability) được xác định bằng cách phân tích một mẫu nhiều lần trong cùng một ngày. Độ chính xác trung gian (intermediate precision) được kiểm tra bằng cách lặp lại thử nghiệm vào các ngày khác nhau hoặc bởi các nhà phân tích khác nhau. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thường phải nhỏ hơn 5% để đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về acid thioctic 1. Công thức cấu tạo  Công thức cấu tạo: Hình 1. Cấu trúc hóa học của acid thioctic  Tên khoa học: 5-(1,2-Dithiolan-3-yl)pentanoic acid [4].

 Công thức phân tử: C8H14O2S2 [4].  Khối lượng phân tử: 206,3 g/mol [4].  Một số tên gọi khác: acid alpha lipoic, acid lipoic. Tính chất lý hóa  Cảm quan: ALA có dạng bột tinh thể màu vàng, trơn chảy kém [5].

 Độ tan: ALA rất kém tan trong nước (khoảng 1,214 mg/mL ở 25ºC), tan rất tốt trong DMF, ethanol, methanol, cloroform (khoảng 100 mg/mL ở 25ºC) [5], [6].  Nhiệt độ nóng chảy: 60,5℃ [6].  Tính chất hóa học: Axit thioctic chứa nhóm chức carboxyl (-COOH), do đó thể hiện các phản ứng đặc trưng của nhóm này. Cụ thể, nhóm carboxyl có khả năng tương tác với các bazơ như hydroxyd kim loại kiềm, bazơ amin, axit amin,… để tạo thành muối tương ứng.

Ngoài ra, nhóm carboxyl cũng tham gia phản ứng với alcohol thông qua quá trình este hóa, tạo ra các dẫn xuất ester. Đồng thời, khi phản ứng với ure, nhóm carboxyl có thể tạo thành hợp chất amid, mở ra các ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực hóa dược [7]. Tổng quan về thioctat trometamol 1. Công thức cấu tạo  Công thức cấu tạo: Hình 1.

Cấu trúc hóa học của thioctat trometamol 2  Tên khoa học: 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol,5-(dithiolan-3-yl)pentanoic acid [8].  Công thức phân tử: C12H25NO5S2 [8].  Khối lượng phân tử: 327,5 g/mol [8].  Một số tên gọi khác: trometamol alpha lipoat, thioctat trometamol.

Tính chất lý hóa  Cảm quan: T-ALA có dạng bột tinh thể trắng ngà hoặc vàng nhạt [6], [7].  Độ tan: T-ALA tan tốt trong nước khoảng 440,5 mg/ml ở 25°C [5] , tan tốt trong cồn nóng, khó tan trong cồn lạnh, có thể tan trong các alcol mạch thẳng hoặc phân nhánh có 1-6 C, octanol, aceton [6].  Nhiệt độ nóng chảy: 120,3°C ± 5°C [6], [7]. Ưu điểm của muối trometamol thioctat Việc chuyển đổi acid thioctic sang dạng muối trometamol mang lại nhiều lợi ích vượt trội, góp phần cải thiện các đặc tính lý hóa và dược lý của hoạt chất.

Như được nêu trong nghiên cứu của nhóm của Strokov I. [9] và nhóm của Borsa M. [10], dạng muối không chỉ khắc phục những hạn chế vốn có của acid thioctic mà còn mở rộng tiềm năng ứng dụng của hoạt chất này trong thực tiễn như:  Tăng độ tan của thuốc: Acid thioctic rất kém tan trong nước.  Tăng sinh khả dụng của thuốc.

 Tăng độ ổn định của hoạt chất: Acid thioctic có độ ổn định kém do cấu trúc vòng dithiolan khiến nó kém bền với ánh sáng, nhiệt độ, và ở dạng bột dễ hút ẩm.  Dễ bảo quản hơn. Tác dụng dược lý Thioctat trometamol, hay muối của alpha-lipoic acid (ALA), được sử dụng trong các chế phẩm để cung cấp ALA nhằm khắc phục các hạn chế của ALA. ALA vốn là một chất chống oxy hóa mạnh, đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa, cải thiện chuyển hóa năng lượng và hỗ trợ điều trị bệnh thần kinh do đái tháo đường [2].

Tuy nhiên, ALA có độ ổn định thấp và dễ gây kích ứng đường tiêu hóa. Sự kết hợp với trometamol không chỉ giúp cải thiện độ ổn định hóa học và khả năng hấp thu, mà còn giảm các tác dụng không mong muốn, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị. Những đặc tính này làm nổi bật vai trò của muối trometamol như một cải tiến trong việc tối ưu hóa các lợi ích dược lý của ALA. Khả năng chống oxy hóa Dữ liệu trong nhiều tài liệu nghiên cứu đã cho thấy tác dụng chống oxy hóa của ALA.

Cụ thể, chúng hoạt động như các chất tạo phức kim loại, chất bắt giữ gốc tự do, 3 tái tạo các chất chống oxy hóa nội sinh như glutathione, vitamin C và E, cũng như sửa chữa các tổn thương do oxy hóa gây ra [11]. Sự tồn tại của các nhóm thiol trong ALA chịu trách nhiệm cho khả năng tạo phức kim loại của nó [12]. Hơn nữa, ALA có thể làm tăng nồng độ glutathione bên trong tế bào, tạo phức và đào thải nhiều loại độc tố, đặc biệt là kim loại độc hại ra khỏi cơ thể. Ví dụ, nghiên cứu của Goralska và cộng sự cho thấy việc sử dụng ALA dẫn đến giảm ion sắt trong tế bào biểu mô [13].

Sự thay đổi này đi kèm với việc tăng khả năng đề kháng của tế bào trước tác động của hydrogen peroxide, chứng tỏ rằng ALA có tác động trực tiếp đến việc giảm stress oxy hóa [13]. Tóm lại, ALA được được xem như một chất chống oxy hóa với đặc tính hòa tan cả trong nước và chất béo và có khả năng trung hòa ROS ở mọi nơi trong cơ thể, cả bên trong lẫn bên ngoài tế bào. Vì lý do này, ALA được coi là chất chống oxy hóa phổ biến [14], [15]. Tiềm năng chống tiểu đường Trong số các rối loạn chuyển hóa, đái tháo đường (ĐTĐ) là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, hiện đang ảnh hưởng đến khoảng 422 triệu người trên toàn thế giới.

Bệnh được đặc trưng bởi sự rối loạn trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, lipid và protein. Hơn nữa, đái tháo đường được công nhận là yếu tố nguy cơ chính cho sự phát triển của nhiều bệnh lý ở người, bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, suy tim, nhồi máu cơ tim, đau thần kinh và thậm chí là đột quỵ [16]. Các bằng chứng mới chứng minh rằng ĐTĐ là kết quả của việc tạo ra quá nhiều ROS và suy giảm tiềm năng chống oxy hóa [17], [18]. Nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh tiềm năng sử dụng ALA trong điều trị đái tháo đường nhờ khả năng tăng cường hấp thu đường trong cả mô cơ nhạy cảm với insulin và kháng insulin [19].

ALA còn có thể kích thích hấp thu glucose thông qua việc điều phối lại các chất vận chuyển glucose đến màng tế bào và phosphoryl hóa tyrosine của chất nền thụ thể insulin-1 [20]. Tiềm năng chống bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh lý thần kinh đặc trưng bởi những thay đổi về nhận thức, chức năng và hành vi. Mất trí nhớ có liên quan đến sự hình thành các mảng beta-amyloid và sự gia tăng protein tau ở dạng bệnh lý ở những bệnh nhân mắc AD [21]. Có nhiều bằng chứng đáng kể đã chứng minh vai trò của stress oxy hóa trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer (AD) [22], [23].

Thuốc chống viêm không steroid (NSAID) đã được đề xuất để điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh, bao gồm cả AD. Tuy nhiên, việc sử dụng NSAID kéo dài sẽ gây ra độc tính đường tiêu hóa do ức chế cyclooxygenase (COX) [24]. Để vượt qua hạn chế này, (ALA) đã được chọn dựa trên vai trò tiềm năng của stress oxy hóa trong sự phát triển của AD. Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng ALA có tác dụng bảo vệ thần kinh đối với độc tính tế bào do Aβ gây ra [25] cụ thể là thông qua việc bảo vệ các tế bào thần kinh 4 vỏ não khỏi độc tính tế bào do Aβ hoặc H2O2 gây ra [26], một phần là do sự kích hoạt của con đường truyền tín hiệu PKB/Akt.

Một nghiên cứu khác cũng cho thấy ALA có khả năng bảo vệ hiệu quả các tế bào thần kinh vùng đồi hải mã trong môi trường nuôi cấy khỏi độc tính gây ra bởi cả peptide Aβ và Fe/H2O2 [27]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ALA thể hiện đặc tính chống chứng mất trí nhớ hoặc chống AD bằng cách tăng sản xuất acetylcholine (ACh) thông qua hoạt hóa choline acetyltransferase, làm tăng hấp thu glucose và do đó cung cấp nhiều acetyl-CoA hơn cho sản xuất ACh [28]. Mặt khác, tình trạng viêm có chức năng chính trong bệnh AD. Tình trạng này liên quan đến các mảng bám amyloid, được bao quanh bởi các tế bào thần kinh đệm và vi tế bào hoạt hóa, và được đặc trưng bởi mức tăng cao của các gốc tự do và cytokine tiền viêm [29], trong đó TNF-α được xem là dấu hiệu từ suy giảm nhận thức nhẹ đến AD [28].

ALA có các tác động đa dạng và phức tạp trong lĩnh vực này, cụ thể là loại bỏ ROS, các ion kim loại chuyển tiếp, tăng mức glutathione dạng khử [28], loại bỏ các sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid [30] và thậm chí tác động lên các con đường truyền tín hiệu [31]. Tương tự, nghiên cứu của Dinicola và cộng sự [32] phát hiện ra rằng ALA làm giảm mức độ của các cytokine gây viêm IL-1β và IL-6 trong các tế bào thần kinh đệm SK-N-BE của người thông qua cơ chế điều chỉnh phụ thuộc vào methyl hóa DNA, mở ra tiềm năng ứng dụng các cơ chế di truyền biểu sinh trong kiểm soát/phòng ngừa AD. Tiềm năng chống ung thư Ngày càng có nhiều tài liệu nhấn mạnh tiềm năng ứng dụng của ALA trong điều trị ung thư. Các tế bào ung thư ưu tiên chuyển hóa glucose thành lactat để tạo ra ATP, hiện tượng này được gọi là hiệu ứng Warburg hoặc đường phân hiếu khí.

Sự hoạt hóa liên tục của đường phân hiếu khí trong các tế bào ung thư dẫn đến việc kích hoạt các oncogen hoặc mất các chất ức chế khối u, do đó gây ra sự tiến triển của ung thư. Do đó, việc ức chế chu trình hiếu khí có thể góp phần vào các hiệu ứng chống ung thư [33]. Enzym pyruvate dehydrogenase xúc tác chuyển đổi pyruvate thành acetyl CoA, ngăn chặn sự hình thành lactat. Feuerecker và cộng sự đã nghiên cứu liệu ALA có khả năng hoạt hóa pyruvate dehydrogenase trong các tế bào ung thư hay không.

Kết quả cho thấy ALA ức chế sự tăng sinh tế bào, hấp thu [18F]-FDG và hình thành lactat, đồng thời làm tăng apoptosis trong các dòng tế bào thần kinh đệm Kelly, SK-N-SH, Neuro-2a và trong dòng tế bào ung thư vú SkBr3. Trong mô hình chuột ghép dị chủng với tế bào SkBr3 dưới da, việc điều trị hàng ngày bằng ALA đã làm chậm sự phát triển của khối u [34]. ALA ức chế sự phát triển và tăng sinh tế bào ung thư tuyến giáp thông qua hoạt hóa AMPK và điều chỉnh giảm con đường tín hiệu mTOR-S6 trong các dòng tế bào BCPAP, HTH-83, CAL-62 và FTC-133. Trong cùng một nghiên cứu, người ta cũng 5 phát hiện ra rằng ALA cũng ức chế đáng kể sự phát triển của khối u trong mô hình chuột ghép dị chủng với tế bào BCPAP và FTC-133 [35].

Ở các tế bào ung thư phổi, ALA ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua điều chỉnh giảm EGFR qua trung gian Grb2 [36].