Khóa luận: Định lượng một số Acid Amin trong Củ Mỡ Tím bằng LC-MS/MS

Khóa luận Dược sĩ phân tích định lượng acid amin trong củ mỡ tím bằng phương pháp LC-MS/MS. Trình bày quy trình, thẩm định và kết quả nghiên cứu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu An
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên cứu định lượng một số acid amin trong củ mỡ tím bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Củ Mỡ Tím và Thành Phần Acid Amin

Củ mỡ tím là một loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và công nghiệp thực phẩm. Thành phần hóa học của củ mỡ tím rất đa dạng, đặc biệt là các acid amin thiết yếu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng acid amin trong củ mỡ tím bao gồm methionin (Met) và phenylalanin (Phe), những chất có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và hỗ trợ sức khỏe. Định lượng acid amin chính xác là yêu cầu cấp thiết để đánh giá chất lượng sản phẩm và tác dụng dưỡng chất. Việc hiểu rõ về thành phần acid amin giúp tối ưu hóa quá trình sử dụng và bảo quản. Nghiên cứu định lượng các acid amin có trong củ mỡ tím góp phần nâng cao giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn của loại cây này.

1.1. Đặc Điểm Thực Vật và Phân Bố Địa Lý

Loài Dioscorea alata (tên gọi khác là mỡ tím) phân bố ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Lá của cây có hình tim, thân leo quanh giới hạn, rễ độc lập phát triển thành củ mỡ tím với đặc tính lưu trữ năng lượng. Việc trồng cây mỡ tím phổ biến ở các nước châu Á như Việt Nam, Nhật Bản, Đài Loan. Đặc tính sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu ôn hòa làm cho cây mỡ tím trở thành cây trồng có tiềm năng kinh tế cao.

1.2. Thành Phần Hóa Học Chính

Thành phần hóa học của củ mỡ tím bao gồm carbohydrate, protein, chất béo, và đặc biệt là các acid amin. Trong đó, methionin và phenylalanin là hai acid amin quan trọng nhất. Methionin (Met) là acid amin chứa lưu huỳnh, đóng vai trò trong quá trình thải độc và tổng hợp chất gốc. Phenylalanin (Phe) là acid amin thơm, tiền chất cho serotonin và dopamine, hỗ trợ sức khỏe tinh thần và bộ não.

II. Phương Pháp LC MS MS Trong Định Lượng Acid Amin

LC-MS/MS (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) là phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi trong định lượng acid amin. Phương pháp này kết hợp ưu điểm của sắc ký lỏng giúp tách chiết các chất cần phân tích và khối phổ để xác định cấu trúc chính xác. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho phép tách các acid amin khác nhau dựa trên độ hút của chúng. Kỹ thuật MRM (Multiple Reaction Monitoring) nâng cao độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp. Định lượng acid amin bằng LC-MS/MS có độ chính xác cao, giới hạn phát hiện thấp, phù hợp cho phân tích các mẫu tự nhiên phức tạp như mẫu từ củ mỡ tím.

2.1. Nguyên Lý Sắc Ký Lỏng HILIC

Sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) là phương pháp phân chia dựa trên cơ chế tương tác thân nước. Pha tĩnh là chất có tính lưỡng tính, pha động chứa hỗn hợp acetonitril (ACN) và nước. Các acid amin được phân chia theo mức độ phân cực, nước yếu hơn tương tác với pha tĩnh nên rút ra trước. Phương pháp HILIC đặc biệt hiệu quả cho phân tích acid amin vì đặc tính thân nước mạnh của những hợp chất này.

2.2. Kỹ Thuật Khối Phổ và MRM

Khối phổ hai lần (MS/MS) cho phép phân mảnh ion phân tử thành các ion con đặc trưng. Kỹ thuật MRM theo dõi sự chuyển đổi từ ion tiền chất sang ion sản phẩm cụ thể. Với methionin (m/z 150→104) và phenylalanin (m/z 166→120), kỹ thuật MRM cung cấp độ nhạy và chọn lọc tối đa. Phương pháp LC-MS/MS giảm thiểu ảnh hưởng của các chất phụ với cấu trúc tương tự, nâng cao độ chính xác định lượng acid amin trong mẫu thực tế.

III. Quy Trình Thẩm Định Phương Pháp Phân Tích

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đảm bảo độ chính xác định lượng acid amin bằng LC-MS/MS. Quá trình thẩm định bao gồm đánh giá độ thích hợp hệ thống, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), xây dựng đường chuẩn và kiểm tra độ lặp lại. Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của acid amin có thể phát hiện được, trong khi giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất có thể định lượng chính xác. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) được tính để đánh giá độ lặp lại của phương pháp. Quá trình thẩm định này đảm bảo rằng phương pháp đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế AOAC và có thể ứng dụng tin cậy cho định lượng acid amin trong các mẫu từ củ mỡ tím.

3.1. Xác Định Giới Hạn Phát Hiện và Định Lượng

LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (signal-to-noise ratio). Giới hạn phát hiện (LOD) thường tương ứng với tỷ số 3:1, giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng 10:1. Với methionin và phenylalanin, LOD thường ở mức ppm thấp, cho phép phát hiện acid amin trong các mẫu từ củ mỡ tím ở nồng độ tự nhiên. Việc xác định chính xác LOD và LOQ là nền tảng cho các phân tích định lượng đáng tin cậy.

3.2. Xây Dựng Đường Chuẩn và Kiểm Tra Tuyến Tính

Đường chuẩn được xây dựng bằng cách dùng chất chuẩn tinh khiết của methionin và phenylalanin ở các nồng độ khác nhau. Độ tuyến tính (R²) của đường chuẩn phải ≥0,99 để đảm bảo tính chính xác định lượng. Phương pháp kiểm tra tuyến tính giúp xác định khoảng nồng độ phù hợp cho phân tích các mẫu từ củ mỡ tím. Đường chuẩn ổn định cho phép định lượng acid amin một cách đáng tin cậy trong các phân tích định kỳ.

IV. Ứng Dụng và Ý Nghĩa Của Nghiên Cứu

Định lượng acid amin trong củ mỡ tím bằng LC-MS/MS có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng. Phương pháp LC-MS/MS cho phép xác định chính xác hàm lượng methionin và phenylalanin trong các mẫu từ vùng trồng khác nhau của cây mỡ tím. Kết quả định lượng acid amin giúp đánh giá chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm, hỗ trợ phát triển các sản phẩm chức năng. Nghiên cứu định lượng acid amin cung cấp dữ liệu cơ sở cho tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia. Phương pháp này cũng có thể áp dụng cho các loại cây dợp phẩm khác, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm nông sản và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng thông qua kiểm soát hàm lượng acid amin chính xác.

4.1. Ứng Dụng Trong Kiểm Nghiệm Chất Lượng Sản Phẩm

Định lượng acid amin là tiêu chí quan trọng trong kiểm nghiệm chất lượng các sản phẩm từ cây mỡ tím. Các nhà sản xuất có thể sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng acid amin và đảm bảo tính nhất quán của sản phẩm. Hàm lượng methionin và phenylalanin phản ánh giá trị dinh dưỡng và tác dụng thực phẩm chức năng. Kết quả định lượng acid amin hỗ trợ ghi nhãn chính xác và tiếp thị sản phẩm dựa trên thực tế khoa học.

4.2. Ý Nghĩa Khoa Học và Phát Triển Sản Phẩm

Nghiên cứu định lượng acid amin trong củ mỡ tím mở ra hướng đi mới cho phát triển các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng. Dữ liệu hàm lượng acid amin từ phương pháp LC-MS/MS cho phép tối ưu hóa công thức thực phẩm chức năng. Phương pháp này cũng hỗ trợ nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện trồng trọt đến hàm lượng acid amin trong cây mỡ tím, từ đó cải thiện năng suất chất lượng canh tác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ CỦ MỠ TÍM 1. Tên gọi Tên khoa học: Dioscorea alata Linnaeus. Tên khác: Dioscorea alata var.

Tên Việt Nam: Củ cái, khoai mỡ, khoai vạc, củ mỡ, củ đầu, khoai tía; khoai ngà; khoai ngọt…[8]. Tên nước ngoài: yam, winged yam, purple yam, water yam (tiếng Anh), 参薯 - shen shu (tiếng Trung Quốc) [9]. Đặc điểm thực vật Củ Mỡ tím là loại cây có bộ nhiễm sắc thể cơ bản là 2n = 20. Tuy nhiên trong thực tế có thể gặp các giống có bộ nhiễm sắc thể 2n = 40, 90 và 100 [10].

Rễ của loài Mỡ tím thuộc loại rễ chùm, ăn ngang trong đất. Hệ thống sợi rễ nằm gần mặt đất, hầu hết ở độ sâu 30 cm.Củ Mỡ tím có nhiều hình dạng như hình trụ, hình trứng, hình oval… Củ Mỡ tím trồng thường có hình thường có hình cầu hoặc hình nón, bên ngoài màu nâu bần hoặc màu đen tía, mặt cắt ngang có màu tím. Trong khi đó củ mọc dại có hình trụ hoặc hình dẹt thường phân nhiều nhánh, thân ngoài có màu nâu bần hoặc vàng xám, mặt cắt ngang có màu trắng. Có các củ con với hình dạng thay đổi.

Thân leo dây cuốn phải, có gờ, có gai ở gốc. Thân phát triển dài vài mét trước khi phân nhánh. Thân nhẵn không có lông, thỉnh thoảng có những nốt sần con, lát cắt ngang có tiết diện vuông và có bốn cánh mỏng ở bốn góc với màng chạy dọc theo chiều dài của thân. Phần cánh mỏng này thỉnh thoảng có màu đỏ hay tím bởi sự có mặt của chất sắc tố.

Lá đơn, mọc so le ở gốc thân, mọc so le ở phía thân trên. Phiến lá hình trứng, hình tim, nhẵn, mỏng, dài từ 6-20 cm gốc lá hình trái tim, sâu hình tim, đỉnh lá nhọn ngắn hoặc có đuôi. Cuống lá có màu xanh lục hay đỏ tía, dài từ 4-15 cm. Gân lá chính xuất phát từ gốc lá, các gân phụ phân bố theo hình mắt lưới [9], [10].

Hoa đực với các hoa mọc đơn hoặc mọc thành chùm, dài từ 1,5-4 cm. Trục hoa có hình ziczac. Thùy bao hoa ngoài hình trứng, rộng. Hoa gồm 6 nhị.

Hoa cái mọc đơn độc hoặc 2-3 hoa mọc cùng nhau. Hoa cái với bộ nhụy 6 gồm các nhụy lép. Quả nang không hướng ra ngoài, dẹt, có thể có hình tim ngược, dài từ 1,5-2,5 cm với cánh quả rộng từ 1,2-2,2 cm. Hạt đính vào gần giữa quả, bao bên ngoài bởi các cánh màng.Mùa hoa: từ tháng 11- tháng 1, mùa quả: từ tháng 12-tháng 1 [9], [10].

Hình ảnh lá và rễ củ của loài D. Phân bố Củ Mỡ tím có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, châu Phi và châu Á. Cây được trồng rất nhiều ở Ấn Độ, Malaysia, các nước châu Phi [1]. Phân bố vùng trồng cây Mỡ tím trên thế giới [1] Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á- nơi có khí hậu, thổ nhưỡng thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tốt.

Theo báo cáo kết quả đánh giá đa dạng nguồn gen cây Mỡ tím (Dioscorea alata L.) năm 2009, cây Mỡ tím ở Việt Nam có tính thích nghi rất cao, chúng có mặt ở cả 7 vùng sinh thái trong cả nước [2]. Mỡ tím thích hợp với thổ nhưỡng ở những khu vực bán sơn địa, các vùng ven sông và đặc biệt cây chịu được phèn nên được coi là cây trồng chủ lực, trồng nhiều ở các tỉnh thuộc khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long như Đồng Tháp, Long An, Tiền Giang,…[11]. Thành phần hóa học 1. Carbohydrat Cây Mỡ tím (Dioscorea alata) là một nguồn cung cấp carbohydrat quan trọng, với hàm lượng tinh bột chiếm từ 60% đến 80% tổng khối lượng khô.

Thành phần tinh bột của củ Mỡ tím đặc trưng bởi tỷ lệ amyloza cao, đặc biệt là sự hiện diện đáng kể của tinh bột kháng (Resistant Starch – RS). Điều này giúp cây Mỡ tím có nhiều tiềm năng về dinh dưỡng được sử dụng trong chế biến thực phẩm và ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp [12]. Theo nghiên cứu của Shuo Jiang và các cộng sự (2023), củ Mỡ tím rất giàu tinh bột và tổng hàm lượng tinh bột dao động từ 59,81 đến 83,80% [12]. Kết quả này cũng 3 phù hợp với nghiên cứu của Wanasundera và Ravindran (1994) với hàm lượng tinh bột 79,5% ± 3,4 tính trên củ khô [13] và nghiên cứu của F.

Baah và các cộng sự (2009), D. alata chứa từ 60,3- 74,4% tinh bột [14]. Protein và các acid amin Theo các nghiên cứu năm 2009 của F. Baah và các cộng sự, hàm lượng protein trong các giống Mỡ tím dao động trong khoảng từ 4,3- 8,7% với trung bình là 6,0% [14].

Hàm lượng protein trung bình là 6,7% theo nghiên cứu của E. Udensi và cộng sự (2008) [15]. Theo nghiên cứu về cây củ Mỡ tím thu hái tại một số vùng trên thế giới gần đây, V. Lebot và các cộng sự (2023) cho rằng hàm lượng protein có trong củ Mỡ tím dao động trong một khoảng rộng từ 1,30- 21,0%.

Trong đó, hàm lượng protein cao nhất là 6,30–21,0% có trong mẫu Mỡ tím tại Vanuatu và hàm lượng protein thấp nhất ở mẫu lấy từ Indonesia là 1,30–3,00% [16]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng acid amin trong củ Mỡ tím có sự biến động tùy thuộc vào địa điểm trồng và thu hái. Nghiên cứu của Doss A. và cộng sự ( 2019) trên củ Mỡ tím trồng tại Ấn Độ cho thấy acid aspartic có hàm lượng cao nhất, đạt 8,12 g/100 g, trong khi cystein có hàm lượng thấp nhất, chỉ 0,52 g/100 g.

Các acid amin khác có hàm lượng dao động từ 0,82 g/100 g đến 6,29 g/100 g [17]. Tương tự, nghiên cứu của Godfrey E. và cộng sự ( 2023) tại Niger báo cáo rằng tổng hàm lượng acid amin thiết yếu trong củ Mỡ tím đạt 33,42 ± 0,41 g/100 g, trong khi tổng hàm lượng acid amin không thiết yếu là 33,95 ± 0,18 g/100 g [18]. Sự khác biệt này có thể liên quan đến yếu tố di truyền, điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác tại các khu vực nghiên cứu.

Các nguyên tố vi lượng Các nghiên cứu đánh giá hàm lượng nguyên tố vi lượng có trong củ Mỡ tím đều cho kết quả hàm lượng nguyên tố kali là cao nhất. Nghiên cứu của J.Wanasundera và cộng sự (1994) cho kết quả hàm lượng các nguyên tố vi lượng như sau: kali (K) 1620±281,7 mg/100g; natri (Na) 66,6±10,1 mg/100g; photpho (P) 163±23,1 mg/100g; canxi (Ca) 68,6±5,4 mg/100g; magnesi (Mg) 69,6±3,6 mg/100g; đồng (Cu) 6,6±0,2 mg/100g; sắt (Fe) 10,4±0,3 mg/100g; mangan (Mn) 3,6±0,4 mg/100g; kẽm (Zn) 3,9±0,4 mg/100g [13]. Một nghiên cứu khác của F.Baah và cộng sự ( 2009) cũng đã phân tích được một số nguyên tố vi lượng với hàm lượng trung bình như sau: photpho (P) 1535,7 mg/kg; kali (K) 15334,4 mg/kg; magnesi (Mg) 474,1 mg/kg; canxi (Ca) 328,8 mg/kg; natri (Na) 106,9 mg/kg; mangan (Mn) 11,7 mg/kg; đồng 14,1 mg/kg và kẽm (Zn) 12,2 mg/kg [14]. Báo cáo gần đây với loài Mỡ tím thu hái tại Trung Quốc, P.

Wang và các cộng sự ( 2023) đã so sánh hàm lượng các nguyên tố vi lượng. Kết quả vẫn cho thấy kali có hàm 4 lượng cao nhất (7727,02 μg/g – 11833,23 μg/g tính theo khối lượng khô) trong các nguyên tố phát hiện được và cao hơn đáng kể so với các nghiên cứu trước đây. Hàm lượng các nguyên tố còn lại được sắp xếp như sau: magnesi (Mg) > natri (Na) > sắt (Fe) > bo (B) > kẽm (Zn) > đồng (Cu) [19]. Các thành phần khác Củ Mỡ tím (Dioscorea alata L.) là một loài thực vật có củ giàu dinh dưỡng với sự hiện diện của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho sức khỏe.

Một trong những nhóm hợp chất quan trọng nhất trong loài này là anthocyanin, thuộc nhóm flavonoid, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ. Theo nghiên cứu của Safitri và cộng sự (2021), anthocyanin chiết xuất hiệu quả bằng methanol, với hàm lượng đạt 16,72 mg/kg mẫu khô. Không chỉ tạo nên hoạt tính chồng oxy hóa, anthocyanin còn tạo nên màu sắc đặc trưng của củ [20]. Bên cạnh flavonoid, Mỡ tím còn chứa nhóm hợp chất phenolic.

Hàm lượng phenolic tổng số trong dịch chiết methanol được xác định đạt 0,68 g/100 g [21]. Sự hiện diện của các hợp chất phenolic và flavonoid góp phần quan trọng vào khả năng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do [22]. Ngoài ra, theo báo cáo của Ezeabara và các cộng sự (2018), phân tích thành phần hóa học của củ Mỡ tím cho thấy sự hiện diện của một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm alkaloid (0,43 mg/100 g), tannin (0,38 mg/100 g), saponin (0,44 mg/100 g), phytate (0,36 mg/100 g), HCN (0,25 mg/100 g) và phenol (0,44 mg/100 g) [23]. Những hợp chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ Mỡ tím, bao gồm tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm và bảo vệ sức khỏe con người.

Tác dụng hạ đường huyết Dịch chiết ethanol từ củ Mỡ tím đã được chứng minh có đặc tính chống đái đường và được đánh giá là có tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh lý này. và các cộng sự (2023) đã tiến hành nghiên cứu tác dụng ức chế in vitro của dịch chiết đối với hoạt động của α-glucosidase và so sánh với Acarbose. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết D. alata ức chế hiệu quả hoạt động của α-glucosidase dẫn đến giảm đáng kể lượng đường trong máu khi đói.

Kết quả cho thấy tác dụng ức chế α-glucosidase của dịch chiết hiệu quả ở liều 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể tương đương với Metformin- một thuốc điều trị tiểu đường phổ biến hiện nay [24]. Tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Nghiên cứu của K. Wallace và cộng sự (2021) đã đánh giá tác dụng chống ung thư của các dịch chiết từ Dioscorea alata, kết quả cho thấy dịch chiết aceton với hiệu quả tiêu diệt trên 90% tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở nồng độ 100 μg/mL và giá trị IC50 đạt 31,45 μg/mL [25]. Hai hợp chất chính có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư là diosgenin 5 và dioscin, với cơ chế gây chết rụng tế bào thông qua con đường ty thể nội tại.

Ngoài ra, saponin có trong D. alata đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự phân chia và phát triển của tế bào ung thư [26]. Tác dụng chống oxy hóa Dioscorea alata là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng với tiềm năng chống oxy hóa mạnh mẽ nhờ hàm lượng cao các hợp chất phenolic và flavonoid. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất từ Dioscorea alata có khả năng tiêu diệt gốc tự do hiệu quả [27].

Ngoài ra, anthocyanin – một sắc tố tự nhiên có trong củ Mỡ tím đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa. Nghiên cứu của Pingfei Qiu và cộng sự (2023) cho thấy anthocyanin tinh khiết được chiết xuất từ D.