Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM REALTIME-PCR 1. Lịch sử ra đời xét nghiệm Realtime-PCR [1] Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ tên là Kary Mullis phát minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction gọi là phản ứng chuỗi polymerase). Với nguyên lý tạo ra một lượng lớn các bản sao DNA từ một đoạn DNA chọn lọc chỉ trong một thời gian ngắn, sự sao chép DNA được diễn ra trong môi trường in vitro tương tự như trong quá trình phân bào.
Phát minh của ông đã tạo ra một cuộc cách mạng lớn đối với nền y học thế giới, nhờ công trình này ông đã được trao giải thưởng danh giá Nobel vào năm 1993. PCR được ứng dụng rộng rãi trong y học để chẩn đoán những bệnh đặc hiệu, liên quan đến các căn nguyên mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được. Đặc biệt là khả năng cho phép người làm xét nghiệm có thể phát hiện, định lượng được sự hiện diện của căn nguyên gây bệnh trong một đơn vị mẫu bệnh phẩm, đã góp phần không nhỏ trong nâng cao chất lượng chẩn đoán và hiệu quả điều trị. Đã có nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn.
Holland và cộng sự (1991) đã phát hiện chức năng 5’ exonuclease của Taq polymerase. Bassler và cộng sự (1995), Lee và cộn sự (1993), Livak và cộng sự (1995) đã phát triển các loại mẫu dò có khả năng chuyển năng lượng huỳnh quang. Việc ứng dụng những phát hiện khoa học và phát triển về thiết bị công nghệ của các công ty như: Perkin Elmer, Idaho Technologies, Acugen…đã góp phần cải tiến kỹ thuật PCR lên một tầm cao mới, một phương pháp định lượng mới ra đời - đó là kỹ thuật Realtime PCR. Xét nghiệm Realtime PCR [1] Realtime-PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại phân tử DNA in vitro, có khả năng phát hiện và định lượng trực tiếp sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ của phản ứng.
Phương pháp này đòi hỏi một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo 3 cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình phần mềm cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại 1. Nguyên lý kỹ thuật: [1] Phản ứng Realtime PCR được thực hiện trong một máy luân nhiệt có khả năng chiếu sáng mỗi một mẫu với một chùm ánh sáng có chiều dài bước sóng nhất định. Ngoài ra, máy luân nhiệt này còn có bộ phận cảm biến xác định được bước sóng ánh sáng phát ra từ phân tử phát huỳnh quang bị kích hoạt trong ống PCR. Từ đó máy có thể xác định được tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử DNA được tổng hợp tăng lên do đó tính được lượng sản phẩm DNA thu được sau mỗi phản ứng.
Như vậy, quy trình thực hiện kỹ thuật Realtime PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi. Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (Realtime - thời gian thực). Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: Nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận hoặc nghịch với số đoạn DNA được tạo thành. Sơ đồ xét nghiệm Realtime PCR: Lấy mẫu xét nghiệm Tách huyết tương Tách chiết DNA/RNA Realtime-PCR Phân tích kết quả In phiếu trả kết quả + Lưu hồ sơ 4 1.
Ứng dụng Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật Realtime-PCR trong các phòng thí nghiệm. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến trong cả chẩn đoán và nghiên cứu cơ bản. Trong công nghiệp, kỹ thuật này được sử dụng để định lượng các vi sinh vật có trong thức ăn và rau củ quả, hoặc sử dụng để xác định các sinh vật biến đổi gen và định lượng, xác định kiểu gen các virus gây bệnh ở người. Ứng dụng trong chẩn đoán: Realtime-PCR được sử dụng trong việc phát hiện nhanh các acid nucleic có ý nghĩa chẩn đoán như: Xét nghiệm viêm gan virus B, viêm gan virus C, xét nghiệm HIV.
Ung thư, và có thể cả các bất thường di truyền. Ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh vật học: Kỹ thuật được sử dụng trong các lĩnh vực về an toàn thực phẩm, hư hỏng thực phẩm và lên men. Ứng dụng trong nghiên cứu: Realtime-PCR được sử dụng với mục đích chính là định lượng số bản phiên mã của gen. Kỹ thuật được sử dụng trong phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một gen qua thời gian.
Định lượng lâm sàng và kiểm tra hiểu gen: Sự có mặt của kỹ thuật Real time PCR giúp cùng lúc định lượng và kiểm tra kiểu gen của một virus. Mức độ nhiễm được định lượng bằng số bản sao của hệ gen virus trên một đơn vị. Ưu nhược điểm của kỹ thuật Realtime-PCR 1.1 Ưu điểm: Xét nghiệm Realtime-PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông thường khác như: - Cho kết quả xét nghiệm nhanh - Độ đặc hiệu rất cao - Phát hiện được nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm hóa, sinh hay miễn dịch truyền thống không phát hiện được - Cho kết quả định lượng số bản copies của virus, hỗ trợ bác sĩ điều trị đánh giá giai đoạn, hiệu quả điều trị, và tiên lượng bệnh - Phát hiện các đột biến gene gây ung thư, và các bệnh tật di truyền khác.nhằm có biện pháp phòng ngừa 5 1. Nhược điểm - Phải có Labo hiện đại, chuẩn mực - Kỹ thuật Realtime-PCR cũng đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ thực hiện phải có trình độ chuyên môn sâu - Chi phí đầu tư nhiều, giá thành xét nghiệm Realtime-PCR còn khá cao - Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại rất dễ xãy ra trong phòng xét nghiệm lâm sàng vì nguy cơ tích tụ và dễ dàng dẫn đến ngoại nhiễm 1.
MỘT SỐ KHÁI NIỆM 1.1 Khái quát chung về chất lượng, hệ thống quản lý chất lượng: [2][3] 1. Chất lượng (Quality): Cụm từ “chất lượng” được sử dụng rất phổ biến trong đời sống, cũng như trong các ngành khoa học. Có nhiều định nghĩa về cụm từ này, tuy nhiên người ta đều thống nhất đưa ra khái niệm cơ bản: “Chất lượng là một đại lượng đo tính ưu việt của một sản phẩm hoặc của một dịch vụ nhằm đảm bảo sản phẩm hoặc dịch vụ đó thỏa mãn những yêu cầu của người sử dụng hoặc khách hàng”. Trong lĩnh vực y tế, người cung cấp dịch vụ là nhân viên y tế.
Khách hàng là bệnh nhân, người trả tiền. Giá cả được hiểu trong ngữ cảnh của chất lượng. Nếu chất lượng là sự thỏa mãn yêu cầu thì giá cả chất lượng được hiểu là “giá của sự thỏa mãn và không thỏa mãn về chất lượng dịch vụ khám, chữa bệnh”. Hệ thống (System) Hệ thống là tập hợp các phần tử có quan hệ hữu cơ với nhau, tác động chi phối lẫn nhau theo các quy luật nhất định để trở thành một chỉnh thể.
Trong đó mỗi phần tử phải có chức năng nhất định và có tính độc lập tương đối. Hệ thống quản lý chất lượng (QMS-Quality Management System) Hệ thống quản lý chất lượng là một loạt các hoạt động phối hợp để chỉ dẫn và điều khiển một đơn vị nhằm liên tục cải tiến, nâng cao chất lượng, hiệu quả các hoạt động. Một số khái niệm về chất lượng xét nghiệm, kiểm tra chất lượng và đảm bảo chất lượng xét nghiệm (ĐBCLXN) 1.1 Chất lượng của một xét nghiệm: Một xét nghiệm được cho là chất lượng khi xét nghiệm đó có đủ các yếu tố: Đúng, đủ, chính xác, đáng tin cậy và kịp thời (đúng hạn).2 Kiểm tra chất lượng xét nghiệm (QC – Quality Control) Kiểm tra chất lượng là một khâu của đảm bảo chất lượng nhằm phát hiện sai số, tìm ra nguyên nhân gây sai số và từ đó đề ra biện pháp khắc phục. Tức là tiếp tục cải thiện điều kiện xét nghiệm, tăng cường công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm.
Hoạt động QC của một phòng xét nghiệm diễn ra hàng ngày theo những quy trình thích hợp nhằm đảm bảo chắc chắn rằng quá trình xét nghiệm có thể cung cấp các kết quả có độ chính xác và độ xác thực. Có thể nói đảm bảo chất lượng là công tác dự phòng, kiểm tra chất lượng là phương pháp kiểm tra, đánh giá các biện pháp dự phòng đó đã tốt hay chưa. Nội kiểm tra (Internal Quanlity Control- IQC) IQC là viết tắt của từ Internal Quality Control có nghĩa là Nội kiểm tra chất lượng hay gọi tắt là Nội kiểm. Là các quy trình được chính nhân viên phòng xét nghiệm thực hiện để giám sát liên tục và nhanh quy trình xét nghiệm.
IQC thực hiện phân tích trên mẫu chứng đã được biết trước giá trị. IQC được thực hiện hàng ngày trong phòng xét nghiệm. Nó giúp phát hiện lỗi trong khi thực hiện xét nghiệm thường quy. Tùy vào loại xét nghiệm mà mẫu này sẽ là mẫu định lượng, mẫu bán định lượng hoặc mẫu định tính.
Các mẫu này biết trước giá trị, phòng xét nghiệm sẽ tiến hành phân tích như mẫu bệnh nhân để xác định độ chính xác cũng như độ chụm. Ngoại kiểm tra (External Quanity Assessment - EQA) Theo WHO (tổ chức y tế thế giới - World Health Organization), thuật ngữ ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) được sử dụng để mô tả một phương pháp cho phép so sánh thử nghiệm/ xét nghiệm của một phòng thí nghiệm với một phòng thí nghiệm bên ngoài. Sự so sánh này có thể được thực hiện trong một nhóm các phòng thí nghiệm có chất lượng ngang hàng hoặc với một phòng thí nghiệm tham chiếu. Các phương pháp EQA phổ biến: 7 - So sánh liên phòng (PT): Nhà cung cấp bên ngoài gửi các mẫu không biết trước để kiểm tra một nhóm các phòng thí nghiệm.
Các kết quả của tất cả các phòng thí nghiệm được gửi về cho nhà cung cấp. Kết quả này được phân tích, so sánh và gửi báo cáo trở lại các phòng thí nghiệm. - Kiểm tra lại/ đánh giá lại (re-checking/ re-testing): Phòng thí nghiệm tự phân tích mẫu, sau đó gửi mẫu đến phòng thí nghiệm tham chiếu phân tích lại, sau đó so sánh kết quả. Hoặc phòng thí nghiệm phân tích một mẫu đã được phòng thí nghiệm tham chiếu thực hiện, sau đó so sánh hai kết quả lại với nhau.
- Đánh giá tại chỗ (on-site evaluation): Thường được thực hiện khi gặp khó khăn trong cả 2 phương pháp trên.