Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation the growth and lipid accumulation of the microalgae scenedesmus obliquus under different cultivation conditions

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluation the growth and lipid accumulation of the microalgae, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Thach Thi Giang Huong
• Người hướng dẫn: Huynh Vinh Khang, Ph.D.
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Tăng Trưởng và Tích Lũy Lipid của Vi Tảo Scenedesmus obliquus Dưới Các Điều Kiện Nuôi Cấy Khác Nhau
• Loại tài liệu: Thesis
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• AFFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Overview of Scenedesmus Obliquus
• 1.2. Morphological characteristics and cell Structure
• 1.3. Nutritional forms Of S.
• 1.4. Factors affecting the growth and development of S.
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Lipid extraction methods and Solvent
• 2.2. Biological activity
• 2.3. Recent studies on the impacts of nutritional stress on the growth and lipid accumulation by the microalgae
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Investigation of different extraction methods
• 3.2. Ultrasonic-assisted extraction with HEXANE
• 3.3. Ultrasonic-assisted extraction with a mixture of hexane and methanol
• 3.4. Ultrasonic-assisted extraction with a mixture of chloroform and methanol
• 3.5. Investigation of the influences of culture conditions on the growth and lipid
• 3.6. Phosphorus
• 3.7. 3-indole acetic acid (IAA) concentration
• 3.8. The response surface methodology - central composite design (RSM-CCD)
• 3.9. Statistical analysis
• 4. CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN
• 4.1. Lipid extraction methods
• 4.2. Effects of culture conditions on the growth and lipid accumulation of the microalgae
• 4.3. Correlation between cell density and optical density
• 4.4. The effects of nitrogen concentrations
• 4.5. The effects of phosphorus concentrations
• 4.6. The effects of 3-Indole acetic acid (IAA) concentrations
• 4.7. The response surface method - central composite design (RSM-CCD)
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• APPENDIX
• LIST OF TABLE
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Vi Tảo Scenedesmus obliquus và Tăng Trưởng

Vi tảo Scenedesmus obliquus là một trong những loại vi tảo quan trọng trong nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học. Chúng có khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tích lũy lipid cao, làm cho chúng trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất biodiesel. Nghiên cứu về sự tăng trưởng và tích lũy lipid của vi tảo này dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau là rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình sản xuất. Các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành phần dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và hàm lượng lipid trong vi tảo.

1.1. Đặc Điểm Hình Thái và Cấu Trúc của Scenedesmus obliquus

Vi tảo Scenedesmus obliquus có hình dạng tế bào đa dạng, thường là hình cầu hoặc hình trụ. Cấu trúc tế bào của chúng cho phép thực hiện quá trình quang hợp hiệu quả, từ đó sản xuất ra năng lượng và các hợp chất hữu ích như lipid.

1.2. Vai Trò của Vi Tảo Trong Môi Trường

Vi tảo không chỉ đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon mà còn giúp giảm thiểu khí nhà kính. Chúng hấp thụ CO2 và sản xuất oxy, góp phần vào sự cân bằng sinh thái.

II. Thách Thức Trong Việc Tăng Trưởng và Tích Lũy Lipid

Mặc dù vi tảo Scenedesmus obliquus có tiềm năng lớn, nhưng việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đạt được sự tăng trưởng và tích lũy lipid cao vẫn gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như thiếu hụt dinh dưỡng, điều kiện ánh sáng không phù hợp và pH không ổn định có thể ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình này. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các điều kiện tối ưu để cải thiện hiệu suất sản xuất lipid.

2.1. Ảnh Hưởng của Thiếu Hụt Dinh Dưỡng

Thiếu hụt nitơ và phốt pho có thể dẫn đến sự giảm sút trong quá trình tổng hợp lipid. Nghiên cứu cho thấy rằng khi vi tảo bị thiếu hụt dinh dưỡng, chúng sẽ chuyển hướng từ tổng hợp protein sang tích lũy lipid.

2.2. Tác Động của Điều Kiện Môi Trường

Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ không phù hợp có thể làm giảm khả năng quang hợp của vi tảo, từ đó ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và tích lũy lipid. Việc nghiên cứu các điều kiện này là rất quan trọng để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy.

III. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Tăng Trưởng và Tích Lũy Lipid

Để tối ưu hóa sự tăng trưởng và tích lũy lipid của vi tảo Scenedesmus obliquus, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu. Các phương pháp này bao gồm điều chỉnh nồng độ dinh dưỡng, sử dụng hormone thực vật và thay đổi điều kiện nuôi cấy. Việc áp dụng các phương pháp này có thể giúp tăng cường hiệu suất sản xuất lipid một cách đáng kể.

3.1. Điều Chỉnh Nồng Độ Dinh Dưỡng

Nghiên cứu cho thấy rằng việc tăng cường nồng độ nitơ và phốt pho có thể thúc đẩy sự phát triển của vi tảo và tăng cường tích lũy lipid. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng nồng độ tối ưu của các chất dinh dưỡng này là rất quan trọng.

3.2. Sử Dụng Hormone Thực Vật

Hormone như axit indole-3-axetic (IAA) đã được chứng minh là có tác dụng tích cực đến sự phát triển và tích lũy lipid của vi tảo. Việc bổ sung hormone này có thể giúp cải thiện hiệu suất sản xuất lipid.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn và Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy có thể dẫn đến sự gia tăng đáng kể trong hàm lượng lipid của vi tảo Scenedesmus obliquus. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng việc sử dụng phương pháp chiết xuất hiệu quả có thể thu được hàm lượng lipid cao, từ đó mở ra cơ hội cho việc sản xuất biodiesel từ nguồn nguyên liệu tái tạo này.

4.1. Kết Quả Chiết Xuất Lipid

Nghiên cứu cho thấy rằng phương pháp chiết xuất bằng dung môi chloroform: methanol (2:1) có hiệu suất chiết lipid cao nhất, đạt 160.89 mg/g DW. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của phương pháp này trong sản xuất lipid từ vi tảo.

4.2. Ứng Dụng Trong Sản Xuất Biodiesel

Việc sử dụng vi tảo Scenedesmus obliquus trong sản xuất biodiesel không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn cung cấp nguồn năng lượng bền vững. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp năng lượng tái tạo.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về sự tăng trưởng và tích lũy lipid của vi tảo Scenedesmus obliquus dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các yếu tố môi trường có thể dẫn đến sự gia tăng đáng kể trong sản xuất lipid. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực năng lượng tái tạo và bảo vệ môi trường.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tối ưu hơn trong việc tăng cường tích lũy lipid và cải thiện hiệu suất sản xuất. Việc áp dụng công nghệ mới và các phương pháp sinh học có thể mang lại kết quả khả quan.

5.2. Tác Động Đến Ngành Công Nghiệp

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong lĩnh vực sinh học mà còn có tác động lớn đến ngành công nghiệp năng lượng. Việc phát triển các quy trình sản xuất bền vững từ vi tảo sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của xã hội.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Khủng hoảng năng lượng toàn cầu cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu do việc tiêu thụ nhiên liệu hóa thạch đang đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các nguồn năng lượng tái tạo. Trong số hơn 300.000 loài vi tảo được ghi nhận trên thế giới, chi Scenedesmus nổi lên như một nguồn nguyên liệu sinh học giàu tiềm năng nhờ tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng thích nghi môi trường khắc nghiệt và hàm lượng dầu cao dùng để sản xuất biodiesel thế hệ thứ ba. Tuy nhiên, thách thức kỹ thuật lớn nhất hiện nay là mâu thuẫn sinh học giữa sự tích lũy sinh khối và hàm lượng lipid: các điều kiện tối ưu hóa sinh khối thường mang lại hàm lượng lipid thấp và ngược lại.

Nghiên cứu được thực hiện nhằm giải quyết nút thắt này thông qua việc khảo sát các phương pháp chiết xuất lipid hiệu quả và đánh giá toàn diện ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng bao gồm nitơ (NaNO3), phốt pho (K2HPO4, KH2PO4) cùng chất điều hòa sinh trưởng Indole-3-Acetic Acid (IAA) đến vi tảo Scenedesmus obliquus. Đề tài được triển khai trong mốc thời gian từ tháng 8/2023 đến tháng 12/2023 tại Phòng thí nghiệm Sinh học Môi trường (BIO 315), Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Ý nghĩa thực tiễn của luận văn thể hiện ở việc xác lập thành công mô hình toán học tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, giúp tăng hàm lượng lipid của vi tảo lên mức 163,83 mg/g trọng lượng khô (DW). Kết quả này cho phép cắt giảm 25% lượng nitơ và 50% lượng phốt pho so với công thức môi trường dinh dưỡng BBM chuẩn, từ đó hỗ trợ giảm thiểu từ 30% đến 40% chi phí hóa chất đầu vào trong quy mô nuôi cấy công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên cơ chế chuyển hóa sinh hóa dòng carbon dưới điều kiện áp lực dinh dưỡng ở tế bào thực vật phù du. Khi môi trường cạn kiệt nguồn nitơ hoặc phốt pho, quá trình tổng hợp protein và phân chia tế bào bị ức chế, dòng carbon từ quang hợp sẽ chuyển hướng sang tích lũy các hợp chất cao phân tử dự trữ năng lượng, chủ yếu là triacylglycerol (TAG). Triacylglycerol là nguồn cơ chất lý tưởng nhất cho phản ứng chuyển hóa este hóa tạo diesel sinh học.

Đồng thời, đề tài ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) kết hợp mô hình thiết kế phức hợp tâm (Central Composite Design - CCD) của George E. P. Box và K. B. Wilson. Đây là công cụ toán học và thống kê hiện đại giúp đánh giá tương tác đa biến giữa nitơ, phốt pho và phytohormone IAA đến hàm lượng lipid mục tiêu. Ba khái niệm cốt lõi xuyên suốt luận văn gồm: quang tự dưỡng (photoautotrophic), cơ chế tích lũy lipid trung tính và chỉ số mật độ quang học (OD680) trong việc xác định động thái phát triển quần thể vi tảo.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vi tảo thuần khiết Scenedesmus obliquus được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II tại Thành phố Hồ Chí Minh. Tảo được nhân sinh khối trong môi trường Bold's Basal Medium (BBM) tiêu chuẩn trong 12 ngày để đạt chỉ số OD680 xấp xỉ 1,0 trước khi bố trí thí nghiệm.

Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế đồng bộ với hệ thống bình nuôi cấy Polyethylene terephthalate (PET) dung tích 5 lít, chứa từ 1 đến 4 lít môi trường dinh dưỡng. Phương pháp chọn mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design - CRD) được áp dụng với ít nhất 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức độc lập. Thí nghiệm tối ưu hóa RSM-CCD bao gồm tổng cộng 20 nghiệm thức (8 điểm góc nhân tố, 6 điểm trục alpha với khoảng cách bằng 1,0 và 6 lần lặp lại ở điểm tâm).

Về kỹ thuật chiết xuất, nghiên cứu so sánh phương pháp Soxhlet truyền thống (thực hiện từ 6 đến 8 giờ với dung môi hexane) và kỹ thuật chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) ở tần số 40 kHz, công suất 120 W trong 30 phút với 3 hệ dung môi: hexane đơn thuần, hỗn hợp hexane:methanol tỷ lệ 1:1, và chloroform:methanol tỷ lệ 2:1. Kỹ thuật chiết siêu âm được lựa chọn nhờ khả năng tạo hiệu ứng xâm thực khí mạnh mẽ, phá vỡ hiệu quả lớp vách tế bào dày cấu tạo từ pectin và cellulose của S. obliquus. Toàn bộ dữ liệu được phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA), kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê bằng phép thử Tukey's HSD (mức ý nghĩa p < 0,05) và giải phương trình hồi quy bậc hai bằng phần mềm thống kê Minitab 21.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Khảo sát phương pháp chiết xuất cho thấy hệ dung môi chloroform:methanol tỷ lệ 2:1 có hỗ trợ siêu âm mang lại hiệu suất tách chiết lipid cao nhất, đạt 160,89 mg/g DW (tương đương 160,64 ± 4,89 mg/g DW). Giá trị này cao hơn rõ rệt so với chiết siêu âm bằng hexane (129,84 mg/g DW) và hỗn hợp hexane:methanol tỷ lệ 1:1 (127,66 mg/g DW). Phương pháp Soxhlet sử dụng hexane đạt 135,14 mg/g DW nhưng tiêu tốn thời gian gấp nhiều lần so với siêu âm.

Về ảnh hưởng của nồng độ nitơ, nghiệm thức thiếu hoàn toàn nitơ (0% NaNO3) kích thích tích lũy lipid đạt mức kỷ lục 184,42 mg/g DW (tăng khoảng 142% so với nghiệm thức đối chứng 100% NaNO3 chỉ đạt 76,00 mg/g DW). Tuy nhiên, mật độ tế bào ở nghiệm thức 0% N chỉ đạt 1,55 x 10^6 tế bào/mL và sinh khối khô chỉ đạt 0,95 g/L sau 12 ngày. Ngược lại, nghiệm thức 75% NaNO3 cho sinh khối khô cao nhất đạt 3,95 g/L và mật độ tế bào đạt 38,50 x 10^6 tế bào/mL, không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với mức đối chứng 100% N.

Đối với nhân tố phốt pho, sự suy giảm nồng độ phốt pho xuống mức 50% trong môi trường BBM vẫn duy trì mật độ tế bào 31,50 x 10^6 tế bào/mL và sinh khối khô 3,65 g/L, không chênh lệch đáng kể so với mức 100% P (35,42 x 10^6 tế bào/mL và 3,95 g/L). Khi kết hợp bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IAA ở nồng độ tối ưu 0,55 mg/L cùng 75% N và 50% P trong mô hình RSM-CCD, hàm lượng lipid thực nghiệm thu được đạt mức đỉnh 163,83 mg/g DW, hoàn toàn tương thích với giá trị dự báo từ mô hình hồi quy.

Thảo luận kết quả

Cơ chế sinh hóa đằng sau sự gia tăng lipid khi giảm nitơ bắt nguồn từ sự thiếu hụt các amino acid cần thiết cho quá trình tổng hợp protein tế bào. Dư lượng nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) tích tụ trong tế bào sẽ ức chế enzyme citrate synthase, ngăn các phân tử acetyl-CoA đi vào chu trình tricarboxylic acid (TCA). Nồng độ acetyl-CoA nội bào tăng cao sẽ kích hoạt enzyme acetyl-CoA carboxylase chuyển đổi acetyl-CoA thành malonyl-CoA, định hướng dòng năng lượng carbon sang tổng hợp các chuỗi acid béo no và không no dạng triacylglycerol.

Các dữ liệu nghiên cứu này có thể được biểu thị trực quan thông qua đồ thị đường biểu diễn động thái tăng trưởng tế bào theo thời gian từ ngày 0 đến ngày 12, kết hợp biểu đồ cột so sánh sản lượng lipid giữa các nghiệm thức dinh dưỡng khác nhau. Ngoài ra, biểu đồ bề mặt đáp ứng 3D và đồ thị đồng mức (contour plot) phản ánh trực quan sự tương tác phi tuyến tính giữa hàm lượng IAA, nitơ và phốt pho đến mục tiêu tối ưu hóa lipid.

Kết quả thu được hoàn toàn tương đồng với các công bố khoa học quốc tế khi nghiên cứu trên các chủng vi tảo lục họ Scenedesmaceae và Chlorella vulgaris. Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IAA ở nồng độ 0,55 mg/L đã phát huy vai trò kích hoạt quá trình phân chia tế bào, cải thiện hoạt tính quang hợp và bù đắp lượng sinh khối bị suy giảm do thiếu hụt dinh dưỡng cục bộ, tạo ra sự cân bằng hài hòa giữa năng suất sinh khối và hàm lượng lipid tổng số.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa và chuyển giao quy trình chiết xuất lipid bằng công nghệ siêu âm (UAE) sử dụng hệ dung môi thân thiện môi trường hexane:methanol tỷ lệ 1:1. Giải pháp này giúp cắt giảm thời gian chiết xuất từ 8 giờ xuống còn 90 phút, giảm thiểu 60% năng lượng tiêu hao so với phương pháp Soxhlet và loại bỏ nguy cơ độc hại từ chloroform đối với người vận hành. Mục tiêu chuyển giao công nghệ cho các cơ sở sản xuất thử nghiệm trong vòng 6 đến 12 tháng tới do các kỹ sư hóa sinh thực hiện.

Thứ hai, áp dụng chiến lược nuôi cấy hai pha (Two-stage cultivation strategy) trong các trang trại vi tảo. Pha 1 kéo dài từ 6 đến 8 ngày trong điều kiện dinh dưỡng tối ưu (75% NaNO3, 50% phốt pho và 0,55 mg/L IAA) để đạt mật độ sinh khối cực đại trên 3,90 g/L. Pha 2 tiến hành rút kiệt nguồn nitơ trong 4 ngày tiếp theo nhằm đẩy hàm lượng lipid tích lũy lên trên 180 mg/g DW. Quy trình này do các chuyên viên nuôi cấy vi sinh vật triển khai trong giai đoạn 2024-2025 nhằm tăng năng suất lipid toàn phần thêm 35%.

Thứ ba, tận dụng các nguồn nước thải sinh hoạt hoặc công nghiệp giàu hợp chất nitơ và phốt pho sau xử lý sơ bộ làm môi trường nuôi cấy thay thế cho phân bón vô cơ. Phương án này hướng đến việc xử lý triệt để 80% đến 90% lượng nitrat và phosphat dư thừa trong nước thải, đồng thời giảm 50% chi phí hóa chất BBM thương mại, được thực hiện bởi các doanh nghiệp công nghệ môi trường từ quý III năm 2025.

Thứ tư, đầu tư và vận hành hệ thống photobioreactor khép kín có gắn cảm biến tự động kiểm soát các thông số quang chu kỳ, cường độ ánh sáng đạt mức khoảng 6.000 Lux, nhiệt độ dao động 27 đến 30°C và độ pH duy trì từ 7,0 đến 8,0. Giải pháp này do các trung tâm công nghệ sinh học nông nghiệp công nghệ cao chủ trì hoàn thiện trong vòng 18 tháng nhằm nâng cao năng suất thu hồi sinh khối đạt ngưỡng trên 4,5 g/L.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Môi trường và Sinh học Ứng dụng. Luận văn cung cấp nguồn tài liệu học thuật bài bản về phương pháp bố trí thí nghiệm bề mặt đáp ứng RSM-CCD, các kỹ thuật phân tích hóa sinh tế bào và số liệu thực nghiệm chuẩn xác về vi tảo.

Thứ hai, kỹ sư nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel) và dầu bôi trơn sinh học. Nghiên cứu mang lại quy trình công nghệ chiết xuất siêu âm rút ngắn thời gian và tối ưu hóa chi phí nguyên liệu thô với hiệu suất lipid đạt trên 160 mg/g DW.

Thứ ba, các chuyên gia quản lý môi trường và vận hành trạm xử lý nước thải. Nội dung luận văn minh chứng rõ nét khả năng hấp thụ nitơ và phốt pho linh hoạt của chủng Scenedesmus obliquus, mở ra giải pháp công nghệ sinh học tích hợp xử lý chất thải hữu cơ và thu hồi sinh khối có giá trị.

Thứ tư, các cơ quan hoạch định chính sách năng lượng xanh và nhà đầu tư nông nghiệp tuần hoàn. Luận văn cung cấp cơ sở khoa học tin cậy để thẩm định tính khả thi kinh tế của các dự án khai thác sinh khối vi sinh vật, hướng tới việc tiết kiệm từ 30% đến 40% chi phí đầu vào và giảm thiểu phát thải khí nhà kính.

Câu hỏi thường gặp

Vi tảo Scenedesmus obliquus có những ưu thế sinh học nào nổi bật trong sản xuất diesel sinh học? Loài vi tảo này sở hữu tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng chịu nhiệt lên đến 30°C và thích nghi tốt trong các môi trường dinh dưỡng đa dạng. Hàm lượng lipid tích lũy có thể đạt từ 160 đến 184 mg/g DW, chứa tỷ lệ cao các acid béo chuỗi dài phù hợp hoàn hảo cho phản ứng este hóa tạo biodiesel chất lượng cao.

Phương pháp chiết xuất lipid có hỗ trợ sóng siêu âm mang lại lợi ích gì so với phương pháp Soxhlet truyền thống? Kỹ thuật chiết siêu âm với công suất 120 W giúp phá vỡ màng và vách tế bào nhanh chóng thông qua hiện tượng tạo bọt khí xâm thực. Phương pháp này chỉ mất khoảng 90 phút xử lý thay vì 6 đến 8 giờ như Soxhlet, đồng thời nâng cao hiệu suất thu hồi lipid lên mức 160,89 mg/g DW.

Sự thiếu hụt nguồn nitơ ảnh hưởng như thế nào đến sự phát triển của vi tảo S. obliquus? Khi cắt giảm 100% nguồn nitơ, quá trình tổng hợp protein bị đình trệ khiến sinh khối giảm xuống còn 0,95 g/L. Tuy nhiên, sự ức chế này lại kích hoạt enzyme acetyl-CoA carboxylase, thúc đẩy tế bào tổng hợp và tích trữ lipid tăng vọt lên mức 184,42 mg/g DW, gấp 2,4 lần so với điều kiện đủ dinh dưỡng.

Chất điều hòa sinh trưởng Indole-3-Acetic Acid (IAA) đóng vai trò gì trong nuôi cấy vi tảo? Phytohormone IAA ở nồng độ tối ưu 0,55 mg/L kích thích phân chia tế bào, cải thiện hiệu quả quang hợp và khả năng hấp thụ dưỡng chất của vi tảo. Nhờ đó, IAA giúp bù đắp lượng sinh khối bị suy giảm trong điều kiện thiếu hụt nitơ và phốt pho, duy trì năng suất thu hồi lipid ở mức cao 163,83 mg/g DW.

Mô hình tối ưu hóa RSM-CCD đã xác định được công thức môi trường nuôi cấy chuẩn xác nào? Mô hình toán học đã xác định điểm tối ưu gồm: nồng độ nitơ ở mức 75% (tương đương 187,5 mg/L NaNO3), nồng độ phốt pho ở mức 50% (37,5 mg/L K2HPO4 và 87,5 mg/L KH2PO4) so với môi trường BBM gốc, kết hợp bổ sung 0,55 mg/L IAA để đạt hàm lượng lipid 163,83 mg/g DW.

Kết luận

Luận văn đã làm sáng tỏ các đặc tính sinh trưởng và động học tích lũy lipid của vi tảo Scenedesmus obliquus dưới tác động của các yếu tố dinh dưỡng và kỹ thuật chiết xuất với 5 đóng góp học thuật và thực tiễn nổi bật:

• Xác lập hiệu quả vượt trội của phương pháp chiết siêu âm với hệ dung môi chloroform:methanol tỷ lệ 2:1 đạt hiệu suất 160,89 mg/g DW, đồng thời đề xuất hệ hexane:methanol tỷ lệ 1:1 đạt 127,66 mg/g DW an toàn cho quy mô công nghiệp.
• Chứng minh môi trường thiếu hụt nitơ tuyệt đối đẩy hàm lượng lipid lên 184,42 mg/g DW, tạo tiền đề cho chiến lược nuôi cấy kích thích stress dinh dưỡng.
• Khẳng định khả năng cắt giảm 25% nitơ và 50% phốt pho mà vẫn duy trì sinh khối khô vượt trội đạt 3,95 g/L và mật độ tế bào 38,50 x 10^6 tế bào/mL.
• Ứng dụng thành công mô hình toán học RSM-CCD để tìm ra tổ hợp tối ưu (75% N, 50% P, 0,55 mg/L IAA) mang lại hàm lượng lipid thực nghiệm 163,83 mg/g DW.
• Mở ra tiềm năng ứng dụng kép trong việc xử lý triệt để dưỡng chất dư thừa trong nước thải và tạo nguồn nguyên liệu sinh khối bền vững cho ngành năng lượng sinh học.

Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo, các nghiên cứu tiếp nối cần mở rộng thử nghiệm ở quy mô pilot từ 50 đến 100 lít trong điều kiện ngoài trời tự nhiên. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp công nghệ năng lượng cần tăng cường liên kết chuyển giao công nghệ, hiện thực hóa chuỗi sản xuất biodiesel tuần hoàn từ vi tảo tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATION THE GROWTH AND LIPID ACCUMULATION OF THE MICROALGAE Scenedesmus obliquus UNDER DIFFERENT CULTIVATION CONDITIONS Major : BIOTECHNOLOGY Student : THACH THỊ GIANG HUONG Student ID : 19126062 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 04/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS EVALUATION THE GROWTH AND LIPID ACCUMULATION OF THE MICROALGAE Scenedesmus obliquus UNDER DIFFERENT CULTIVATION CONDITIONS Advisor Student HUYNH VINH KHANG, Ph. THACH THI GIANG HUONG NGUYEN THI VAN ANH, Msc. Thu Duc City, 04/2024 i ACKNOWLEDGEMENT To complete this thesis, I would like to sincerely thank the Board of Directors, the Department of Biological Sciences of Ho Chi Minh City University of Agriculture and Forestry and the Institute of Biotechnology and Environmental Research for their enthusiastic support. Supported and created favorable conditions for me to complete my graduation thesis recently.

I would like to especially express my sincere thanks to Dr. Huynh Vinh Khang and Msc. Nguyen Thi Van Anh has dedicatedly guided and advised me during the process of implementing, researching and completing the thesis. Thank you to the teachers of the Department of Biological Sciences for always dedicatedly helping and supporting me in answering my questions throughout my research and study process at school.

Thank you to the student body of the Environmental Biology Department - Faculty of Biological Sciences as well as the DH19SHD class for always encouraging, supporting and helping me during the time of completing my graduation thesis. I would like to thank my parents for not being afraid to work hard and always creating the best conditions for me to study and practice. Because I am initially participating in scientific research and have many limitations in knowledge, experience and skills that I cannot see, I look forward to receiving more comments from teachers. and you to make this thesis more complete.

Finally, I wish all teachers good health and confidence to complete their mission of leading and imparting knowledge to future generations. Thank you sincerely. Thu Duc City, April 10, 2024 li AFFIRMATION AND COMMITMENT My name is Thach Thi Giang Huong, student ID: 19126062, class: DHI9SHD (Phone: [phone], email: [e-mail]), Faculty of Biological Sciences, Nong Lam university. I declared that all results presented in this graduate thesis were conducted by myself.

All the data and information are entirely accurate and unbiased. I fully accept responsibility for these commitments in front of the committee. Thu Duc City, April 10" ,2023 Student’s signature Thach Thi Giang Huong ill ABSTRACT This study aimed to explore the influence of extraction methods and solvents on lipid extraction efficiency and to identify optimal culture conditions for enhancing the growth and lipid accumulation of the microalga Scenedesmus obliquus. Soxhlet extraction methods, using hexane as a solvent, and the ultrasound-assisted extraction involved three solvent systems: hexane, hexane:methanol (1:1), and chloroform:methanol (2:1).

The investigation included evaluating the effects of microalgae culture conditions through response surface method to assess the growth and lipid accumulation potential of S. The highest lipid extraction efficiency (160.89 mg/g DW) was achieved using the chloroform: methanol (2:1) solvent system with ultrasound assistance. The results indicated that the ultrasound-assisted organic solvent method was as effective as, or superior to, the traditional Soxhlet method, offering time and energy savings in the extraction process. The study revealed that the highest lipid content (163.83 mg/g DW) was attained under culture conditions, including 75% nitrogen (NaNO3), 50% phosphorus (K2HPO,4 and KH;PO¿) compared to the original BBM nutrient medium, and 0.55 mg/L 3-indole-acetic acid (IAA).

The findings contribute valuable insights for optimizing lipid extraction processes and cultivating microalgae for lipid production. Key words: BBM, lipids, nitrogen, phosphorus, and Scenedesmus obliquus. iv TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá ảnh hưởng của phương pháp chiết và dung môi đến hiệu quả chiết lipid và xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng cường sự sinh trưởng và tích lũy lipid của vi tảo Scenedesmus obliquus. Phương pháp chiết Soxhlet, sử dụng hexane làm dung môi và chiết có sự hỗ trợ của siêu âm bao gồm ba hệ dung môi: hexane, hexane:metanol (1:1) và chloroform:metanol (2:1).

Khảo sát bao gồm đánh giá tác động của điều kiện nuôi cấy vi tảo thông qua phương pháp bề mặt đáp ứng dé đánh giá khả năng tăng trưởng và tích lũy lipid của S. Hiệu suất chiết lipid cao nhất (160,64 + 4,89 mg/g DW) đạt được khi sử dụng hệ dung môi chloroform: methanol (2:1) có hỗ trợ siêu âm. Kết quả chỉ ra rằng phương pháp dung môi hữu cơ có sự hỗ trợ của siêu âm có hiệu quả tương đương hoặc vượt trội so với phương pháp Soxhlet truyền thống, giúp tiết kiệm thời gian và năng lượng trong quá trình chiết xuất. Nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid cao nhất (163,22 + 0,83 mg/g DW) đạt được trong điều kiện nuôi cấy, bao gồm 75% nitơ (NaNO3), 50% phốt pho (KzHPO¿ và KHzPO¿) so với môi trường dinh dưỡng BBM ban dau và 0,55 mg.

/L axit indole-3-axetic (IAA). Những phát hiện này đóng góp những hiểu biết có giá trị để tối ưu hóa quá trình chiết xuât lipid và nuôi cay vi tao dé sản xuat lipid. Từ khóa: BBM, lipids, nito, photpho va Scenedesmus obliquus. LIST OF ABBREVIATIONS ACE : Angiotensin-converting enzymes ATP : Adenosine triphosphate BBM : Bold's Basal Medium CCD : Central composite design CO2 : Carbon dioxide DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DW : Dry weight IAA : Indole-3-Acetic Acid MAE : Microwave extraction : Nitrogen NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate OD : Optical density : Phosphorus RSM : Response surface methodology (RSM TAG : Triacylglycerol UAE : Ultrasonic extraction vi CONTENTS Trang AFFIRMATION AND COMMTTMENT.

SH HH HH TH HH gà, ili K11 asim i ic te Se ia iv SO rte eee eee eee eee ằằẶẰẽ V LATS 1. CÚP ABV LATING sua tượgggaguyngBaitgkGkS4aES00N010,36488408004D-3S48G86SuSX38448568u/8u8698855800u38,3048N016L.Gu1N6 vi COIN TEN T00 u/ygmm 47. ee vil TUL TẤT, LA BLD cesarean src tic i CW i CC X TBE CF TCE nreseeenesootiresotogpioinglgongtpsn0li6i5i0:0SDIRGIGGGNGSEIASGUHSGEC000000/20030nnĐ3E xi caer 1. NUÃ, TÌ sansssesnigasipgadgsgtituoatSgXiggiiL4Ă6008630308đi2:4i048020330035781G0g88HG3/Giã30090830/40884680010304500SE880/863ã 1 Lda Preble SEn le NGHÊ sec bsennaagititnltigtntiigihiBSHGIGNSGDSGISIGGS)/00001G19.0000/5B144/01/5050GI300000)0000948 | OC) ÏímugnanusgrosgtitgriatioioitigtitNGt0REB0NM010010180043N008800805004998G(1G/0800131000G1800008GMPSGĐEEGNIGĐNHESHISISMSGN 2 1D.

Combet taanggvesaoreosettoei BIAESSGIHI044S0600090/0G0/0/G140-GI21600ISENGBIRSIBGBEĐISMGGESH.1: Overview of Scenedesmus ObDLIQUUS coixisosscsgig tát t1333645543138145614358330540464318455. Morphological characteristics and cell Structure .-- 5 5c +22 * +22 ‡++++sssxseeses 5 ess: TẾ DIðTUIE PHÔ cscs we Gc SS open aa 6 2. Nutritional forms Of S.L HỘI EiDIEIWVGNHEEssueasuienaBticiiuittiagtssBloiniioitbqoogiltvgtigpisd/GisgiHlioisi0344Gii458/46ã0601/0Gãgã540161 6 2. 7 22:3 MIKOOPHIC tenccionempunmmneanm enna EE 7 2.

Factors affecting the growth and development of S.- --«55«<5+<<+2 Ỷ 21:3alz -L€TTIPETRIT sa ggg bonnngnntgag1016811493340603388SHLÄ4G153.S0-ÀNGINSS3H01883)AS048gS135GNHENGASSESS88S59E83N/8gã938g88083688 7 850 | uy. NUÍTI€TIE. SÁT HT TH TH HT TH TT HH TH TH TT HT TH TT Tà nh 9 231. NWO S60 sen ceorueeremesconcnranerersennsneucmcuse ranean 9 D3 AD.usenroenesecconevenatoansieneonsseurven ng ng nnsnvasenteuntenevenansedevneneaeestsnnen ea¢ounennncontienys 10 ee) nunageeoendoieDigicgutedniopiilsE0000GEĐS0G901G140B63910C00GEI-DHESSUESLAEDHHBIDSGIDDILSGKGUTDGGSSG.

Componds accumulate 1n the alga S.ceceseseeseeeseeseeeeseeeeeeeeeneeeeeeaeeneenees 10 ce 6 ee ee ee ee 10 Es GIỮTT,.- ecouinxeerogbii<nircgatodrigargildogeroirdndicAtrrdcinnidz2trgdioniiptgtikdisym.rgriámgimtrstgmigiD—csgimtrgitrdrroigtirista II 2.0nitlexldani: Com pov sseusaseaeusaaraarostdfoiointdhOESSBGSBNIBS400165/01SHEG33489i20029. Lipid extraction methods and Solvent ., ĐT HHIWElisoessaoisnioiatigitllsilasosseDl44l)9(SRSLSISEAEIIRIGMSESSSĐiNiSEDSgilpstag 14 D6.) BIOLOGY CHEE DY, cscs HH HH sectsastisins hiNgiioDGELRL0ESGIL38.0L038S880SL- CR HGENGHD2LS000/90040.20060D8E 14 2,62) Biological activity bus ion wsem mses numero wenn eeeteens aeeeER TENET 15 2:6;3'. WaStE Wale? GRHTNETÏĂGsinseenginidiginDnSGE00311800303810L386508033153G80Đ4SES5SSS141485ES8E4XE4GBIEESHG58 15 2. Recent studies on the impacts of nutritional stress on the growth and lipid accumulation by the microalgae S.

Time Btid LOCATOR GL INE (5L ws scasccssieseananssuasaaxeaninsnnechasnninednninthanaiiesnpainadniiesacsancamineasnawiies 18 Sie Witenes PTE susesspeeesnaeueierhakuiirbilEs0iiek0ts(Etrnigalo8xiess6xlkls6ifeIISHSL.1 SOULCE OF SEANCH CSTNUS (0 D HN HỒN sx cwacsvna ssn nhggga nh N h3 4 GHI Q4 159 ThủNAgũgãg0k3h/SixSĐ018S18U7538I0730848838 18 3. Investigation of differentextraction methods, sccseevaenrneunmaurmumencmnonenmenaons 20 BiDoks DI TỘC GILDHLDTTLaseseiseiotnndiadbiiduiBEu01A00116160008060081066080560148313618116GE0090806160644. Ultrasonie-assisted extraction with HEXATE vcs: sessseessssezseasiteisgSIE16314615086002455611 30002068 20 3. Ultrasonic-assisted extraction with a mixture of hexane and methanol.

Ultrasonic-assisted extraction with a mixture of chloroform and methanol. Investigation of the influences of culture conditions on the growth and lipid Ce Ome ne 21 BA. Ly Cul Gur inie “(IMG sesvosssssoaoslil9kidbetRnSagtlGiAESIEBDHIEHNGISIGBIGXIISEIMGRESANELEEBEGMONIMEDBRBSBRA 21 3. cssessmmsmasemnnmnnnancmecmmnmmemm mamma anenine 22, 34,3.

Phosphorus 'OTGEHdEOTSitoskizssests6yne08010800N0ADI0485001A560305610100S4ISIBISSMQSNGISGIESGASGAng8Sđ 23 3. 3-indole acetic acid (IAA) concentrafiOTNS. The response surface methodology - central composite design (RSM-CCD). 25 Decl CISC IE OSA) CORT DO seeeeenaanraraetrinitiintidttiouriiiERGIGESUDEESISIGGUGNIABSSM09020001g0014071800161000/008 2 3.

Statistical analysis nh n. 28 Chapter 4, RESULTS AND DISCUSSION sounnnarseoeeiontnnpybrronttieiietDDDDDIGIETGIB24G(DSIOGHG000006740 29 4. Lipid extraction mmethOS. - 6 6 2131191131851 351 19111111 1 1 911 11 v1 Hàng nh ng 29 4.

Effects of culture conditions on the growth and lipid accumulation of the microalgae3 | 4. Correlation between cell density and optical density. ee eee eeeeeeeeeeeeeeeeeenees 3] 4. The effects of nitrogen COnC€TTAfIOTNS.

Eeffects of phosphorus concentrafIOTNS. EHEGIS:Of culturin: tite usesiseresitisnilsibssedld bikt34s 39a ngã ghiath 32gb ÄtokoaSEiNkingldflagbaaflEpknone 39 4. The effects of 3-Indole acetic acid (IAA) concentrafIOns. The response surface method - central composite design (RSM-CCD).

TERS Ota! e#tfaifiHf GHN-THDTTS se cauassesseidinidede cavenansasnunnnetannensannawanacaannwassines 47 Chapter 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS. ssccvsssssesasorsvrvevessecevenverssonuonevead 49 S1 10115) (5 (0) ) eee 0 0858E32IHDS.0RSE303843800004305806L388i/E0399REĐN8iI2E610148Đ3H84803180004008010080 49 5.2, SUDDESÍOTTSt680á6120510210015866000100000Đ101G9G0003Y51610078E50130297BE59)dg81100g940-I2Q8B388083)80.3a89028Q380880 and 49 APPENDIX ix LIST OF TABLE Trang Table 3. Bold's Basal Medium (BBM) (CCALP).- ch nhe 1g ViPS TSO GIG ¿sang si2Eg620858ã65305400352a8380252883.2882a25:534355233405846i798 19 COHEN ANON MG. Experimental setup to evaluate the effects of culturing time.

Experimental setup to evaluate the effects of nitrogen deficiency. Experimental setup to evaluate the effects of phosphorus deficiency. Experimental setup to evaluate the effects of 3-indole acetic acid (IAA) AMCNAMEN. eee eeeeeeseeseeeeeeesecseeeseesesseeseeeeeeessesseceesseceeesessessesaessecseseeessesseseseseeeeeesaeeaees 25 Table 3.

Levels of optimization for the three varIabÌes.- -- -- ¿+55 +++<<£+ex+esseesss 26 Table 4. Results of the experimental setup for optimizing the culture conditions. ANOVA analysis of the effects of the three factors on the objective function 47 Table 34. Optitnal culture CONGITIONG «sc sevcenccewsseesssvaessssseuseersoxvsoveenevanevessusenveresnseresveeweouss 48 LIST OE EIGURES Trang Figure 2.

obliquus microalgae cells under an optical microscope (Carlos et al. Chemical structure of chlorophyll (Mandal and Dutta, 2020). Lipid content from S. obliquus extracted using different methods.

C: chloroform, H: hexane, M: methanol. Different letters indicated statistically significant PTI [TH TD) scscssscrnasercsssanesicnoss eso a ces ac RO AS OR NEN 30 Figure 4. Standard curve showing the correlation between cell density and the absorbance at 680 nm wavelength of microalga S. obliquus cell density during 12 days of culture.

Jn the same sampling day, different letters indicated statistically significant differences (p < (. Dry biomass of S. obliquus after 12 days of culture. Different letters indicated StatistiGally SiONIfiCaTL-GIJEFENCES (TS.

Effect of nitrogen on lipid accumulation of S. obliquus after 12 days of culture. Different letters have statistically significant differences (p < 0. obliquus cell density during 12 days of culture.

Jn the same sampling day, different letters indicated statistically significant differences (p < 0. Effect of phosphorus on lipid accumulation of S. obliquus after 12-day of culture. Different letters have statistically significant differences (p < 0.

Effect of culturing time on cell density of S. In the same treatment, different letters indicated statistically significant differences (p < 0. Effect of culturing time on dry biomass of S. In the same treatment, different letters indicated statistically significant differences (p < 0.

Effects of IAA concentrations on the dry biomass of S. Different letters indicated statistically significant differences (p < (). Effect of IAA concentration on lipid content of S. Different letters indicated statistically significant differences (P~<0.

Optimal culture conditions as proposed by Minitab 21 software. Problem statement Fossil fuels are finite resources. Using fossil fuels for energy generation is the leading cause of air pollution and global warming (Klass, 2004). One of the most important dilemmas of the modern world is providing sufficient energy with minimal impact on the environment.

The use of biofuels to replace fossil fuels will not only contribute to reducing air pollution and preventing global warming but also help to be proactive about energy sources (Thanh ef al. Since then, the issue of needing to find bioenergy sources from this and other renewable biofuels is receiving more and more attention, research, and use, in which the highlight is biodiesel obtained from organic matter (Amaro et al.