MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên được tạo thành từ quá trình sinh tổng hợp trong thực động vật, vi sinh vật thường có các hoạt tính sinh học rất đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào cơ thể và ít tác dụng phụ. Vì thế, nhiều chất trong số chúng đã được sử dụng rộng rãi trong thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị các bệnh này được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chúng. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên thường rất phức tạp mà bằng con đường tổng hợp toàn phần sẽ không kinh tế vì phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý môi trường cao, thời gian phản ứng dài. Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập các chất dẫn đường, sau đó chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt hơn chất dẫn đường đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học.
Gần đây, các nhà khoa học đã khám phá nhiều hoạt tính sinh học của hợp chất indirubin và dẫn xuất, một bisindole alkaloid có thể được thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều ở Việt Nam hoặc bằng phản ứng giữa isatin và indoxyl acetate. Hoạt chất này và dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quí như gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với cơ chế rõ ràng, đến thời điểm hiện tại các công bố về các hoạt tính này vẫn đang tiếp tục. Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất này vào thực tế vẫn còn khó khăn do độ tan kém trong nước, một số công trình đã và đang nghiên cứu sử dụng hướng thứ nhất để cải thiện độ tan của indirubin, theo hướng thứ hai một số dẫn xuất cũng đã được tổng hợp tuy nhiên các công bố vẫn chưa nhiều. Theo hướng này, đề tài của luận án đề cập tới tổng hợp một số dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất dị vòng chứa S, N, O; các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine, sau đó đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung các dữ liệu về hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tìm kiếm các thuốc mới để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có trong nước.
Vì thế, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin”. 1 luan an Mục tiêu của luận án: - Tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia. - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra. Nội dung của luận án: 1.
Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine; 2. Xác định cấu trúc của các dẫn xuất mới tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại; 3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) của các dẫn xuất mới tổng hợp được; 4. Nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất mới tổng hợp được sử dụng phần mềm AutoDock 4.
Giới thiệu về indirubin và một số đồng phân Indirubin là một bisindole alkaloid có màu đỏ thẫm có công thức phân tử là C16H10N2O2 (M = 262 g/mol), tên IUPAC: (3Z)-3-(3-oxo-1,3-dihydro-2H-indol-2- ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one, nhiệt độ nóng chảy 356,2÷357,8 oC, hợp chất này không tan trong nước, tan ít trong methanol, ethanol, tan nhiều hơn trong acetone, DMSO, DMF. Phổ UV-VIS của nó trong dung môi 1,1,2,2-tetrachloroethane có các cực đại ở 291, 356 và 540 nm [1]. Indirubin có công thức cấu tạo như Hình 1. Công thức cấu tạo của indirubin 1 Phân tử indirubin có một liên kết hydro nội phân tử được hình thành giữa nguyên tử H-1ʹ với nguyên tử O của nhóm C=O ở C-2 và liên kết này được chứng minh qua nhiễu xạ tia X đơn tinh thể [2].
Nhóm tác giả cũng chỉ ra sự liên hợp giữa các phân tử indirubin với nhau, đây cũng là một trong những lý do kém tan của indirubin. Indirubin 1 và một số đồng phân của nó như indigotin 2 màu xanh, indigo 3 màu xanh, isoindirubin 4 màu đỏ, isoindigo 5 màu nâu được tìm thấy trong lá của cây Isatis tinctoria [3] (Hình 1. Công thức cấu tạo của một số đồng phân của indirubin 3 luan an Từ bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc tên là Danggui Longhui Wan để điều trị bệnh ung thư bạch cầu Leukemia, gồm 11 thảo dược khác nhau. Năm 1966 các nhà khoa học thuộc Viện Huyết học, Viện Dược khoa Trung Quốc đã xác nhận tác dụng này nằm trong một vị thuốc có tên Thanh Đại [4].
Thanh Đại là bột màu xanh đen được làm từ lá của một số cây như: Strobilanthes cusia (Nees. Kuntze - chàm mèo (Acanthaceae), Polygonum tinctorium (Polygonaceae) ở Nhật Bản, Isatis indigotica (Brassicaceae), Indigofera suffrutticosa (Fabaceae) và Indigofera tinctoria L. Bột chàm chứa hàm lượng lớn indigotin 2, một phẩm nhuộm tự nhiên màu chàm xanh. Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng chúng có chứa indirubin 1 và hoạt tính chống ung thư bạch cầu của bột chàm là do hoạt tính indirubin mà có.
Năm 1999, các nhà khoa học Đức đã công bố indirubin và các dẫn xuất có tác dụng ức chế enzyme kinase phụ thuộc cyclin (CDK) [4]. Các enzyme CDK, một họ kinase protein được hoạt hóa bởi cyclin, có chức năng điều khiển chu trình tế bào thông qua việc gắn các nhóm photphat vào cơ chất protein (quá trình phosphoryl hóa) kiểm soát các quá trình này trong tế bào. Các CDK còn tham gia vào việc điều khiển các quá trình phiên mã, xử lý mRNA và quá trình tự chết của tế bào. Các CDK photphoryl hóa các protein ở các đoạn chứa các aminoaxit Serin và Threonin thuộc vùng vị trí hoạt động.
Cho tới nay đã có 9 CDKs (cdk1-9) và khoảng trên 16 cyclin gắn kết đã được xác định và đang từng bước được làm rõ mối liên quan đến các bệnh khác nhau như ung thư, tiểu đường, Alzheimer’s, thần kinh… Indirubin và dẫn xuất của nó là các chất có hoạt tính sinh học cao, chúng ức chế các enzyme CDK1, CDK2, GSK-3β [5, 6], qua đó tác động đến chu trình hình thành và phát triển của tế bào ung thư, bởi vậy chúng là các đối tượng nhận được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Thu nhận, tổng hợp indirubin 1. Thu nhận indirubin từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia Indirubin 1 có thể được thu nhận từ lá chàm mèo Strobilanthes cusia theo quy trình của Nguyễn Mạnh Cường và cộng sự [7]. Lá chàm mèo được thái nhỏ, để lên men 3 ngày sau đó lọc rồi kiềm hóa, tách lấy bột chàm.
Bột chàm thu được chiếm 0,75% lượng mẫu tươi, nhiều hơn so với lượng bột chàm nhận được khi tiến hành theo quy trình trong dân gian, hàm lượng indirubin cũng cao hơn so với hàm lượng 4 luan an indirubin trong bột chàm theo quy trình trong dân gian. Indirubin được phân tách bằng sắc ký cột silicagel (cỡ hạt 0,063÷0,4 mm) hệ dung môi rửa giải n- hexan/dichloromethan tăng dần độ phân cực. Ngoài ra, một lượng lớn indirubin có thể thu được bằng phản ứng của dịch chiết nước giàu indican từ lá chàm mèo với isatin trong môi trường kiềm theo phương pháp của chính nhóm tác giả [8]. Tổng hợp indirubin từ nguyên liệu hóa học Indirubin được Baeyer tổng hợp từ khá sớm bằng phản ứng ngưng tụ giữa isatin 6 và indoxyl 7 sử dụng dung môi ethanol, xúc tác Na2CO3 (Sơ đồ 1.
Tuy nhiên, indoxyl 7 là chất trung gian khó tổng hợp và không bền, dễ bị dime hóa để tạo thành indigotin 2. Để khắc phục nhược điểm này, năm 1969, Rusell và Kaupp cải tiến phương pháp tổng hợp của Baeyer bằng cách thay indoxyl 7 bằng indoxyl acetate 8 bền hơn, thay dung môi ethanol bằng methanol (Sơ đồ 1.2), cũng giống như nghiên cứu của Bayer các tác giả không công bố hiệu suất của phản ứng [10]. Hiện nay phương pháp này được sử dụng khá phổ biến để điều chế indirubin và hầu hết các dẫn xuất của nó. Tổng hợp indirubin từ isatin và indoxyl Sơ đồ 1.
Tổng hợp indirubin theo Rusell và Kaupp Năm 2017, Cuiling Wang và cộng sự công bố qui trình tổng hợp indirubin 1 giai đoạn bằng cách khử isatin 6 bởi tác nhân KBH4 trong dung môi methanol. Phản ứng tiến hành trong không khí ở nhiệt độ hồi lưu với tỷ lệ mol của isatin/KBH4 là 2/1. Phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu suất tạo thành sản phẩm indirubin cao (90,8%) (Sơ đồ 1. Tổng hợp indirubin bằng cách khử isatin 6 bởi KBH4 Tóm lại, indirubin có thể được tổng hợp từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia hoặc được tổng hợp từ các phản ứng hóa học khác nhau, trong đó phản ứng của Russel và Kaupp (Sơ đồ 1.2) là phản ứng thường được dùng để điều chế indirubin hiện nay.
Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 1. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin từ các dẫn xuất của isatin và indoxyl acetate. Trong hai công trình được công bố vào các năm 2010 và 2017, Cheng và các cộng sự đã thực hiện phản ứng ngưng tụ giữa các dẫn xuất của isatin 9 và indoxyl acetate 10 trong dung môi methanol, xúc tác Na2CO3 và đã nhân được các dẫn xuất của indirubin 11 với hiệu suất tốt (Sơ đồ 1. Bản chất của phản ứng này vẫn là phương pháp của Rusell và Kaupp [10].
Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 11 Năm 2017, Wang và các cộng sự đã đưa ra một phương pháp để tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 12 có hai nhóm thế giống nhau ở hai bên vòng phenyl đó là thực hiện phản ứng khử hóa các dẫn xuất của isatin 9 bởi KBH4 trong dung môi MeOH, không khí, điều kiện hồi lưu (Sơ đồ 1.5), hiệu suất nhận được các dẫn xuất indirubin là 76,4÷88,4% [11]. Glycosyl hóa indirubin là một phương pháp khá thú vị để cải thiện độ tan của indirubin do sự xuất hiện của nhóm đường. Theo hướng này, một số các hợp chất indirubin N1-glycoside cũng đã được Libnow giới thiệu [14]. Trước hết N-(2,3,4-Tri- O-acetyl-α,β-L-rhamnopyranosyl)isatin 16α,β được điều chế từ đường L-rhamnose (Sơ đồ 1.
Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 12 bằng cách khử hóa các dẫn xuất của isatin 9 bởi KBH4 Sơ đồ 1.