Luận án tiến sĩ: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

Luận án tiến sĩ phân tích và đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn xuất indirubin, cung cấp cái nhìn sâu sắc về tiềm năng ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Trọng Dân
• Người hướng dẫn: TS. Tô Đạo Cường
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Đánh Giá Tác Dụng Sinh Học Của Dẫn Xuất Indirubin
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC SƠ ĐỒ
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
• 2.2.1.1. Hóa chất, dung môi, dòng tế bào nghiên cứu
• 2.2.1.2. Thiết bị dùng cho nghiên cứu
• 2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.2.2.1. Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp (hoạt tính gây độc tế bào)
• 2.2.2.2. Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch (hoạt tính chống tăng sinh)
• 2.2.3. Chuẩn bị các phối tử và protein
• 2.2.4. Mô phỏng tương tác sử dụng phần mềm AutoDock
• 3. CHƯƠNG III: TỔNG HỢP CÁC TỔ HỢP LAI CỦA INDIRUBIN VỚI CÁC HỢP CHẤT 1,3,4-OXADIAZOLE, 1,3,4-THIADIAZOLE, 6-MERCAPTOPURIN QUA LIÊN KẾT TRIMETHYLEN (CHUYỂN HÓA Ở NHÓM HYDROXYL CỦA C-3ʹ-OXIME)
• 3.1. Tổng hợp indirubin-3ʹ-oxime 25 và indirubin-3′-[O-(3-bromoprop-1-yl)oxime] 26
• 3.2. Tổng hợp các hợp chất 1,3,4-oxadiazole; 1,3,4-thiadiazole
• 3.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen từ chất trung gian chìa khóa 26
• 3.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)
• 3.5. Tổng hợp indirubin-3ʹ-(O-oxiran-2-ylmethyl)oxime 27
• 3.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen từ chất trung gian chìa khóa 27
• 3.7. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở N-1)
• 3.8. Tổng hợp (2ʹZ)-1-(oxiran-2-ylmethyl)indirubin 44
• 3.9. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen từ chất trung gian chìa khóa 44
• 3.10. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)
• 3.11. Tổng hợp các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l
• 3.12. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime] 52
• 3.13. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole từ chất trung gian chìa khóa 52
• 3.14. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1)
• 3.15. Tổng hợp chất trung gian (2ʹZ)-1-(prop-2-ynyl)indirubin 54
• 3.16. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime 55
• 3.17. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole từ chất trung gian chìa khóa 55
• 3.18. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1)
• 3.19. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của indirubin
• 3.19.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào
• 3.19.2. Thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin
• 4.2. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)
• 4.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)
• 4.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurine qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở vị trí N-1)
• 4.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)
• 4.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1)
• 4.7. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1)
• 4.8. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro các dẫn xuất mới của indirubin
• 4.8.1. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i
• 4.8.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i
• 4.8.3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 45a-45h
• 4.8.4. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l
• 4.8.5. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 56a-56p
• 4.9. Mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của các chất
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về dẫn xuất indirubin

Dẫn xuất indirubin là một nhóm hợp chất có nguồn gốc từ indirubin, một bisindole alkaloid, được chiết xuất từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng indirubin và các dẫn xuất của nó có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý, bao gồm khả năng chống ung thư, kháng viêm, và chống oxy hóa. Việc tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn xuất này là cần thiết để phát triển các liệu pháp điều trị mới. Theo một nghiên cứu, tác động sinh học của indirubin có thể được giải thích qua cơ chế tác động lên các enzyme và thụ thể trong tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào ung thư.

1.1. Tác dụng sinh học của indirubin

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng indirubin có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư như Hep-G2, LU-1, và SW480. Các dẫn xuất của indirubin cũng cho thấy hoạt tính chống viêm và kháng virus. Một nghiên cứu cho thấy rằng indirubin có thể ức chế hoạt động của enzyme GSK-3β, một enzyme quan trọng trong quá trình phát triển ung thư. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư từ indirubin.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp hóa học và sinh học hiện đại. Các hợp chất được tổng hợp từ indirubin thông qua các phản ứng hóa học với các chất khác nhau như isatin và indoxyl acetate. Sau khi tổng hợp, các dẫn xuất được đánh giá tác dụng sinh học thông qua các thử nghiệm in vitro. Phương pháp xác định tính độc tế bào và hoạt tính chống tăng sinh được áp dụng để đánh giá hiệu quả của các dẫn xuất mới. Các kết quả thu được sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng ứng dụng của các dẫn xuất này trong điều trị ung thư.

2.1. Tổng hợp các dẫn xuất mới

Quá trình tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp hóa học như sắc ký và phổ khối lượng. Các hợp chất được tổng hợp sẽ được phân tích để xác định cấu trúc và tính chất hóa học. Việc tổng hợp thành công các dẫn xuất mới sẽ mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học của chúng.

III. Đánh giá tác dụng sinh học

Đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn xuất indirubin là một phần quan trọng trong nghiên cứu này. Các thử nghiệm in vitro cho thấy rằng một số dẫn xuất mới có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư một cách hiệu quả. Kết quả cho thấy rằng các dẫn xuất này không chỉ có tác động sinh học mạnh mẽ mà còn có thể được phát triển thành các liệu pháp điều trị mới. Việc phân tích mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất cũng là một điểm nhấn trong nghiên cứu này.

3.1. Kết quả thử nghiệm in vitro

Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng các dẫn xuất mới của indirubin có hoạt tính chống ung thư cao, với IC50 thấp trên nhiều dòng tế bào. Các dẫn xuất này không chỉ ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà còn có khả năng gây chết tế bào thông qua các cơ chế khác nhau. Điều này chứng tỏ rằng indirubin và các dẫn xuất của nó có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư hiệu quả.

IV. Kết luận và triển vọng

Nghiên cứu về tác dụng sinh học của các dẫn xuất indirubin đã chỉ ra rằng chúng có nhiều tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Việc tổng hợp và đánh giá các dẫn xuất mới không chỉ mở ra hướng nghiên cứu mới mà còn có thể góp phần vào việc phát triển các loại thuốc mới từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện độ tan và tính ổn định của các dẫn xuất này để tăng cường hiệu quả điều trị.

4.1. Triển vọng nghiên cứu

Triển vọng nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tổng hợp và đánh giá thêm các hoạt tính sinh học khác của các dẫn xuất indirubin. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các dẫn xuất này sẽ giúp hiểu rõ hơn về khả năng ứng dụng của chúng trong điều trị ung thư và các bệnh lý khác.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Nguyễn Trọng Dân với đề tài "Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin" thuộc chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (mã số: 9 44 01 17), được thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam năm 2021 dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Tô Đạo Cường và TS. Lưu Văn Chính.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Indirubin là một bisindole alkaloid tự nhiên có màu đỏ thẫm, tồn tại trong vị thuốc Thanh Đại được chế biến từ các loài thực vật như chàm mèo (Strobilanthes cusia). Các nghiên cứu quốc tế và trong nước đã chứng minh indirubin cùng các dẫn xuất sở hữu phổ hoạt tính sinh học đa dạng như gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, chống kết tập tiểu cầu, kháng virus, chống vẩy nến, chống oxy hóa và kháng nấm. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất hạn chế khả năng ứng dụng dược học của indirubin là độ tan rất kém trong nước do mạng lưới liên kết hydro nội phân tử bền vững giữa nhóm H-1ʹ và nguyên tử oxy tại C-2 cùng hệ liên hợp phẳng giữa các phân tử.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định gồm:

• Đa phần các dẫn xuất của indirubin trước đây được điều chế thông qua phản ứng ngưng tụ giữa dẫn xuất isatin và dẫn xuất indoxyl acetate; rất ít nghiên cứu xuất phát trực tiếp từ nguyên liệu nguồn indirubin tự nhiên sẵn có trong nước.
• Các công trình chuyển hóa trực tiếp trên khung indirubin tự nhiên chủ yếu tập trung tại vị trí C-3ʹ, một số ít tại N-1 hoặc vòng phenyl, cấu trúc đa phần chỉ chứa các nguyên tố C, H, O, N và halogen, hiếm khi kết hợp dị tố lưu huỳnh (S) hoặc các dị vòng có hoạt tính sinh học cao.
• Chưa có các nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các tổ hợp lai (molecular hybrids) giữa indirubin tự nhiên với các dị vòng chứa S, N, O (1,3,4-oxadiazole; 1,3,4-thiadiazole; 6-mercaptopurin), các hợp chất hydroxychalcone hoặc các hợp phần amine mang tính bazơ nhằm đồng thời cải thiện độ tan và nâng cao hoạt tính gây độc tế bào ung thư.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát được xác định:

1. Tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguồn nguyên liệu đầu indirubin phân lập từ cây chàm mèo (Strobilanthes cusia).
2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra trên các dòng tế bào ung thư người.

Để đạt được các mục tiêu trên, luận án triển khai 4 nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các dẫn xuất mới tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại (NMR 1D, 2D, HR-MS, nhiễu xạ tia X đơn tinh thể).
3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro (gây độc và chống tăng sinh tế bào trên 4 dòng: ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60) của các dẫn xuất mới.
4. Nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học thông qua mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking) trên enzyme glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) sử dụng phần mềm AutoDock 4.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất bisindole alkaloid indirubin tự nhiên có độ sạch trên 95% thu nhận từ lá cây chàm mèo (Strobilanthes cusia) do GS.TS. Nguyễn Mạnh Cường (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên) cung cấp; hợp chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-oxime và các tác nhân lai hóa gồm các dẫn xuất thiol của 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone và các hợp chất amine.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Về không gian và điều kiện thực nghiệm: Nghiên cứu tổng hợp hữu cơ và đo đạc phổ cấu trúc tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên; thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro tại phòng thí nghiệm sinh hóa thuộc Phân viện Công nghệ Sinh học / Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Về mô hình thử nghiệm: Đánh giá hoạt tính tế bào trên 4 dòng ung thư người (SW480, LU-1, HepG2, HL-60) và dòng tế bào lành thận phôi người HEK-293; mô phỏng docking phân tử trên enzyme GSK-3β (PDB ID: 1Q41).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu tiền nhiệm được điểm lại

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu về indirubin từ bài thuốc cổ truyền "Danggui Longhui Wan" và vị thuốc Thanh Đại dùng trong điều trị bệnh bạch cầu tủy mãn tính (CML) tại Trung Quốc từ năm 1966. Về mặt hóa học và hoạt tính sinh học, tác giả điểm lại các công trình tiêu biểu:

• Phương pháp tổng hợp: Baeyer lần đầu tổng hợp indirubin từ isatin và indoxyl; Russell và Kaupp (1969) cải tiến phản ứng ngưng tụ giữa isatin và indoxyl acetate trong methanol có xúc tác kiềm $\text{Na}_2\text{CO}_3$; Cuiling Wang và cộng sự (2017) phát triển phản ứng khử isatin bằng $\text{KBH}_4$ trong methanol hồi lưu đạt hiệu suất 90,8%; Cheng và cộng sự (2010, 2017) ngưng tụ các dẫn xuất isatin và indoxyl acetate; Libnow (2008) tổng hợp các dẫn xuất $N^1$-glycoside của indirubin ($N$-$\beta$-L-rhamnopyranosyl, glucopyranosyl, galactopyranosyl...) để cải thiện độ tan; Nguyễn Hải Nam và cộng sự (2020) tổng hợp các dẫn xuất hydroxamic của indirubin ức chế enzyme histone deacetylase (HDAC).
• Chuyển hóa trên khung indirubin: Các công trình của tác giả quốc tế và Nguyễn Mạnh Cường về việc tạo oxime tại C-3ʹ, phản ứng $O$-alkyl hóa nhóm 3ʹ-oxime, phản ứng $N$-acetyl hóa và $N$-alkyl hóa tại vị trí N-1, cũng như chuyển hóa nhóm thế tại vòng phenyl thông qua các phản ứng ghép nhóm ester pentafluorophenyl (PFPTFA) hoặc khử nhóm 5ʹ-nitro thành 5ʹ-amino bằng $\text{H}_2/\text{Pd-C}$.
• Cơ chế tác dụng sinh học:
  • Hoessel và cộng sự (1999) chứng minh indirubin và dẫn xuất ức chế chọn lọc các kinase phụ thuộc cyclin (CDK1, CDK2) và GSK-3β. Indirubin-3ʹ-oxime gắn vào vùng liên kết ATP của CDK2 và bắt giữ chu kỳ tế bào tại pha G2/M hoặc G0/G1 thông qua tăng biểu hiện protein $\text{p27}^{\text{Kip1}}$.
  • Tác dụng ức chế thụ thể Aryl hydrocarbon (AhR), điều hòa giảm protein sinh ung thư PML-RARα trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), can thiệp con đường tín hiệu NF-$\kappa\text{B}$, Src và STAT3 (các dẫn xuất E564, E728, E804, E738).
  • Khả năng ức chế tạo mạch máu thông qua giảm biểu hiện VEGF và ức chế thụ thể VEGFR-2 (được chứng minh trên phôi cá ngựa vằn và mô hình chuột Matrigel plug bởi Sa và cộng sự, 2011).
  • Tác dụng chống kết tập tiểu cầu qua con đường GPVI/PLC$\gamma 2$/ERK1/2 (Lee và cộng sự, 2014); kháng viêm qua ức chế sản xuất interferon-$\gamma$ và NO do LPS gây ra; kháng virus cúm H9N2, virus HIV-1 thông qua ức chế CDK9 và P-TEFb (Heredia và cộng sự, 2005); kháng virus viêm gan B (HBV) trên tế bào HepG2.2.15; kháng nấm da (Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum).
• Khái quát về các hợp phần ghép nối: Dị vòng 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole và 6-mercaptopurin có hoạt tính kháng u và nhóm thiol (-SH) thuận lợi cho phản ứng thế nucleophin; khung hydroxychalcone có phổ ức chế tăng sinh tế bào, cảm ứng apoptosis và ức chế caspase-3/9 (Lưu Văn Chính và cộng sự; Kun-Hung Shen; Cesar Echeverria).

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết

Luận án định vị nghiên cứu tại giao điểm giữa hóa học bán tổng hợp các hợp chất tự nhiên và thiết kế phân tử lai hướng đích chống ung thư. Bằng cách tận dụng nguồn indirubin tự nhiên dồi dào từ cây chàm mèo Việt Nam, tác giả đã giải quyết khoảng trống về thiếu hụt các dẫn xuất lai đa cấu trúc mang dị tố lưu huỳnh, cầu nối triazole và các hợp phần amine/chalcone, đồng thời cung cấp các dẫn liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào và tương tác gắn kết với enzyme đích GSK-3β.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết thiết kế thuốc lai (Hybrid Pharmacophore): Kết hợp khung cấu trúc bisindole alkaloid của indirubin với các phân tử nhỏ có hoạt tính sinh học độc lập (dị vòng azole, purine, chalcone) thông qua các cầu nối linh động (trimethylen, 2-hydroxypropylen, methylen-1,2,3-triazole) nhằm tạo ra tác động hiệp đồng hoặc cải thiện tính chất hóa lý và ái lực gắn kết sinh học.
• Hóa học phản ứng Click: Sử dụng phản ứng cộng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyne và azide xúc tác bởi muối đồng(I) (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition) tạo vòng 1,2,3-triazole làm cầu nối liên kết bền vững giữa khung indirubin và các hợp phần chalcone hoặc amine.
• Khung phân tích gắn kết phân tử trên enzyme GSK-3β: Dựa trên cấu trúc tinh thể của GSK-3β (PDB ID: 1Q41), khảo sát các liên kết hydro và tương tác tĩnh điện/Van der Waals tại túi gắn kết ATP gồm các amino acid bảo thủ: Lys85, Glu97, Leu130, Leu132, Asp133, Val135, Pro136, Glu137, Arg141, Glu185 và Asp200.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

• Phương pháp tổng hợp và phân lập:
  • Kỹ thuật phản ứng hóa học: phản ứng tạo oxime, phản ứng thế nucleophin alkyl hóa ($O$-alkyl hóa, $N$-alkyl hóa) sử dụng xúc tác bazơ ($\text{K}_2\text{CO}_3$, $\text{Cs}_2\text{CO}_3$, NaH), phản ứng mở vòng epoxide (oxiran), phản ứng Click cộng hợp alkyne-azide xúc tác $\text{CuSO}_4 \cdot 5\text{H}_2\text{O}$ / Sodium ascorbate trong hệ dung môi thích hợp.
  • Kỹ thuật theo dõi và tinh chế: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản silica gel $60\text{ F}_{254}$; sắc ký cột (CC) sử dụng chất hấp phụ silica gel cỡ hạt $0,063 \div 0,400\text{ mm}$ với hệ dung môi giải ly phân cực tăng dần ($n$-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol).
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: $^{1}\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz}$), DEPT-135, và các phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân/dị hạt nhân: $^{1}\text{H-}^{1}\text{H COSY}$, HSQC, HMBC, NOESY đo trên máy Bruker Avance 500.
  • Phổ khối lượng phân giải cao: High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry (HR-ESI-MS) để xác định chính xác khối lượng phân tử và công thức nguyên.
  • Nhiễu xạ tia X đơn tinh thể: Xác định cấu hình không gian 3 chiều đối với hợp chất trung gian (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime (55).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
  • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp (HepG2, LU-1, SW480, HEK-293) theo phương pháp Sulforhodamine B (SRB) hoặc MTT.
  • Đánh giá hoạt tính chống tăng sinh đối với dòng tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch (HL-60).
  • Xác định nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh/phát triển của tế bào ($\text{IC}_{50}$, đơn vị $\mu\text{M}$ hoặc $\mu\text{g/mL}$) so với các chất đối chứng dương tiêu chuẩn (Ellipticine, Camptothecin).
• Phương pháp mô phỏng tính toán phân tử (Molecular Docking):
  • Phần mềm: AutoDock 4.2 / AutoDockTools.
  • Chuẩn bị thụ thể: Protein GSK-3β (PDB ID: 1Q41) được xử lý loại bỏ phân tử nước, thêm nguyên tử hydro phân cực, tính điện tích Kollman.
  • Chuẩn bị phối tử: Tối ưu hóa cấu trúc 3D, gán điện tích Gasteiger, xác định các liên kết xoay tự do.
  • Thiết lập hộp lưới (Grid box) bao trùm tâm hoạt động liên kết ATP của enzyme; tính toán năng lượng tự do liên kết ($\Delta G_{\text{bind}}$, $\text{kcal/mol}$) và hằng số ức chế dự đoán ($K_i$).
  • Dự đoán các thông số dược động học và quy tắc Lipinski (Rule of Five) cùng độc tính thông qua các công cụ in silico.

---

Nội dung chính theo từng chương

Luận án được tổ chức thành 4 chương chính cùng phần Mở đầu, Kết luận và Danh mục công trình:

Chương I. Tổng quan

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở dữ liệu khoa học về indirubin và các dẫn xuất:

• Khái quát cấu trúc, tính chất hóa lý, các đồng phân tự nhiên (indigotin, indigo, isoindirubin, isoindigo) và nguồn thu nhận từ cây chàm mèo (Strobilanthes cusia).
• Điểm luận các quy trình bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần indirubin và dẫn xuất qua các thập kỷ.
• Hệ thống hóa các cơ chế hoạt tính sinh học: ức chế kinase chu kỳ tế bào (CDK, GSK-3β), cảm ứng apoptosis thông qua con đường ty thể và caspase, ức chế tín hiệu STAT3, cản trở quá trình hình thành mạch máu khối u (VEGF/VEGFR-2), chống kết tập tiểu cầu và kháng viêm.
• Giới thiệu tiềm năng cấu trúc của các dị vòng 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin và khung hydroxychalcone, cùng nguyên lý ứng dụng kỹ thuật molecular docking trên enzyme GSK-3β.

Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu, hóa chất, chủng dòng tế bào và hệ thống trang thiết bị nghiên cứu:

• Quy trình chuẩn bị indirubin độ sạch cao từ nguyên liệu thực vật tự nhiên.
• Mô tả các phương pháp phổ nghiệm hiện đại ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, HR-ESI-MS, X-ray) phục vụ sáng tỏ cấu trúc.
• Quy trình chuẩn thử nghiệm độc tính tế bào in vitro (SRB assay) trên các dòng tế bào ung thư người (SW480, LU-1, HepG2, HL-60) và tế bào lành HEK-293.
• Các bước thực hiện mô phỏng tương tác docking phân tử trên enzyme GSK-3β bằng phần mềm AutoDock 4.

Chương III. Thực nghiệm

Trình bày chi tiết quy trình tổng hợp hóa học, điều kiện phản ứng, phương pháp tinh chế và dữ liệu phổ đầy đủ cho từng dãy chất dẫn xuất mới của indirubin:

• Dãy 1 (42a-42i): Chuyển hóa indirubin 1 thành oxime 25, sau đó phản ứng với 1,3-dibromopropane tạo chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[$O$-(3-bromoprop-1-yl)oxime] (26). Ghép 26 với các dẫn xuất thiol 41a-41i của 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole và 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen.
• Dãy 2 (43a-43i): Phản ứng $O$-alkyl hóa oxime 25 với epichlorohydrin tạo trung gian epoxit indirubin-3ʹ-($O$-oxiran-2-ylmethyl)oxime (27). Mở vòng epoxit của 27 bằng các tác nhân thiol 41a-41i tạo các dẫn xuất lai qua liên kết 2-ol-1,3-propylen.
• Dãy 3 (45a-45h): Phản ứng $N$-alkyl hóa indirubin 1 tại vị trí N-1 với epichlorohydrin tạo trung gian (2ʹZ)-1-(oxiran-2-ylmethyl)indirubin (44), sau đó mở vòng bằng các dẫn xuất thiol tạo các tổ hợp lai chuyển hóa ở N-1 mang liên kết 2-ol-1,3-propylen.
• Dãy 4 (53a-53l): Phản ứng $O$-alkyl hóa oxime 25 với propargyl bromide tạo trung gian indirubin-3ʹ-[$O$-(prop-2-ynyl)oxime] (52). Tổng hợp các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l từ phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt và thế azide. Thực hiện phản ứng Click giữa alkyne 52 và các azide 51a-51l tạo tổ hợp lai indirubin-hydroxychalcone qua cầu nối methylen-1,2,3-triazole tại C-3ʹ-oxime.
• Dãy 5 (56a-56p): Chuyển hóa đồng thời tại N-1 và C-3ʹ: Propargyl hóa N-1 của indirubin tạo 54, sau đó tạo oxime tại C-3ʹ thu được trung gian chìa khóa (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime (55). Ghép Click chất 55 với các azide chalcone 51a-51l thu được dãy 56a-56l; ghép với các dẫn xuất azide mang nhóm amine thu được dãy 56m-56p.

Dãy dẫn xuất	Vị trí chuyển hóa trên khung indirubin	Bản chất cầu nối liên kết	Hợp phần ghép lai
42a – 42i	Nhóm hydroxyl tại C-3ʹ-oxime	Trimethylen ($-\text{CH}_2\text{CH}_2\text{CH}_2-$)	1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin
43a – 43i	Nhóm hydroxyl tại C-3ʹ-oxime	2-ol-1,3-propylen ($-\text{CH}_2\text{CH(OH)CH}_2-$)	1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin
45a – 45h	Vị trí dị vòng nitơ N-1	2-ol-1,3-propylen ($-\text{CH}_2\text{CH(OH)CH}_2-$)	1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin
53a – 53l	Nhóm hydroxyl tại C-3ʹ-oxime	Methylen-1,2,3-triazole	Dẫn xuất 2-hydroxychalcone
56a – 56l	Đồng thời tại C-3ʹ-oxime và N-1	Methylen-1,2,3-triazole (ở N-1)	Dẫn xuất 2-hydroxychalcone
56m – 56p	Đồng thời tại C-3ʹ-oxime và N-1	Methylen-1,2,3-triazole (ở N-1)	Hợp phần amine hữu cơ

Chương IV. Kết quả và thảo luận

Chương IV phân tích cấu trúc hóa học, biện giải phổ, đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư và mô phỏng tương tác phân tử:

• Biện giải cấu trúc: Sử dụng tập hợp dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D và HR-MS để quy kết toàn bộ tín hiệu proton và carbon. Cấu trúc tinh thể tia X của chất trung gian 55 xác nhận cấu hình đồng phân hình học là $(2^\prime Z, 3^\prime E)$.
• Hoạt tính sinh học in vitro:
  • Hầu hết các dẫn xuất tổng hợp đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng HepG2, LU-1, SW480 và chống tăng sinh trên dòng HL-60 tốt hơn đáng kể so với chất đầu indirubin tự nhiên.
  • Các dẫn xuất thuộc dãy lai hydroxychalcone (53a-53l và 56a-56l) thể hiện giá trị $\text{IC}_{50}$ vượt trội trên nhiều dòng tế bào, nhiều chất có hoạt tính ở dải micro-mol thấp, tương đương hoặc mạnh hơn chất đối chứng dương.
  • Sự xuất hiện của nhóm phân cực (như -OH trên cầu nối 2-ol-1,3-propylen ở dãy 43a-43i và 45a-45h) và các nhóm amine ở dãy 56m-56p giúp cải thiện tính tan và duy trì hoạt tính độc tế bào chọn lọc.
• Mối tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR) và kết quả Molecular Docking:
  • Mô phỏng tương tác trên enzyme GSK-3β (PDB ID: 1Q41) cho thấy các phân tử lai định vị thuận lợi vào túi gắn ATP.
  • Khung indirubin duy trì các liên kết hydro quan trọng với các amino acid bản lề như Val135, Asp133.
  • Các nhánh bên (1,3,4-oxadiazole, triazole, chalcone) tạo thêm các tương tác liên kết hydro bổ sung với Lys85, Glu97, Arg141 hoặc tương tác kỵ nước với Leu130, Leu132, làm tăng năng lượng liên kết và giảm hằng số ức chế dự đoán ($K_i$).
  • Có sự tương quan thuận giữa năng lượng gắn kết dock tính toán ($\Delta G_{\text{bind}}$) với hoạt tính ức chế thực nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khảo sát.
  • Dự đoán các thông số ADMET chỉ ra một số dẫn xuất đáp ứng tốt quy tắc Lipinski, cho thấy tiềm năng phát triển thành các hoạt chất dạng thuốc.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Phát triển chiến lược bán tổng hợp phân tử lai từ indirubin tự nhiên: Luận án đã thiết lập thành công các quy trình tổng hợp đa bước để điều chế hơn 40 dẫn xuất mới chưa từng được công bố của indirubin, tận dụng trực tiếp nguồn nguyên liệu tự nhiên chiết xuất từ cây chàm mèo (Strobilanthes cusia) của Việt Nam.
2. Sáng tỏ cấu trúc hóa học và cấu hình không gian: Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của tất cả các hợp chất mới tổng hợp bằng các phương pháp phổ hiện đại ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, HR-ESI-MS) và chứng minh cấu hình lập thể $(2^\prime Z, 3^\prime E)$ của dẫn xuất trung gian then chốt 55 bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
3. Mở rộng hiểu biết về mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR): Cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm toàn diện về hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các tổ hợp lai giữa indirubin với dị vòng chứa S, N, O, cầu nối triazole và hydroxychalcone; làm rõ vai trò của các cầu nối phân cực và vị trí biến đổi hóa học (C-3ʹ-oxime so với N-1) trong việc cải thiện hoạt tính sinh học.
4. Cơ chế tương tác phân tử trên đích enzyme GSK-3β: Kết hợp thực nghiệm sinh học với tính toán mô phỏng docking phân tử, xác định được phương thức gắn kết của các dẫn xuất mới tại vùng liên kết ATP của enzyme GSK-3β, giải thích cơ sở phân tử của hoạt tính ức chế tế bào ung thư.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Cung cấp một thư viện phong phú các hợp chất bisindole alkaloid lai hóa có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao, đóng vai trò là các hợp chất dẫn đường (lead compounds) tiềm năng cho công tác sàng lọc và phát triển thuốc chống ung thư mới.
• Nâng cao giá trị sử dụng nguồn dược liệu cây chàm mèo bản địa của Việt Nam thông qua việc chuyển hóa hóa học từ hoạt chất tự nhiên thành các dẫn chất có giá trị khoa học và hoạt tính sinh học cao.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung được công bố trong văn bản luận án:

• Hạn chế:
  • Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất mới tổng hợp mới dừng lại ở mức độ đánh giá in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người (SW480, LU-1, HepG2, HL-60) và tế bào thường thận HEK-293; chưa thực hiện các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm.
  • Nghiên cứu cơ chế tác dụng trên enzyme GSK-3β mới chỉ được tiếp cận qua mô phỏng tương tác phân tử in silico (molecular docking), chưa tiến hành đo hoạt tính ức chế trực tiếp enzyme kinase GSK-3β và các kinase CDK bằng các xét nghiệm enzyme chuyên biệt.
  • Chưa tiến hành thử nghiệm toàn diện về độ tan định lượng thực tế trong nước và tính khả dụng sinh học dạng bào chế của các muối dẫn xuất amine.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Lựa chọn các dẫn xuất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trong các dãy chất lai để tiến hành thử nghiệm ức chế trực tiếp trên các protein kinase tinh khiết (GSK-3β, CDK1, CDK2, CDK9).
  • Đánh giá sâu hơn cơ chế chết tế bào (apoptosis, chu kỳ tế bào, điện thế màng ty thể, mức độ hoạt hóa caspase-3/9) trên các dòng tế bào ung thư nhạy cảm.
  • Triển khai thử nghiệm độc tính cấp và hoạt tính kháng u in vivo trên mô hình chuột mang khối u ghép dị loài (xenograft).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị tham khảo cao đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Hóa hữu cơ: Có thể tham khảo phương pháp luận bán tổng hợp, quy trình thực hiện các phản ứng ghép nối dị vòng, phản ứng Click cộng hợp alkyne-azide, cũng như phương pháp phân tích, biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D và phổ khối phân giải cao.
• Các nhà khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc (R&D Dược phẩm): Cung cấp dữ liệu chi tiết về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của khung bisindole alkaloid, hỗ trợ định hướng thiết kế các cấu trúc phân tử lai hướng đích kinase.
• Các cơ sở nghiên cứu và giảng dạy đại học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các học phần chuyên đề về biến đổi hóa học các hợp chất thiên nhiên, sàng lọc hoạt tính sinh học và ứng dụng công cụ tin sinh học/docking phân tử trong nghiên cứu hóa dược.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn indirubin tự nhiên từ cây chàm mèo thay vì tổng hợp toàn phần từ isatin và indoxyl acetate?

Indirubin tự nhiên có thể thu nhận với hàm lượng lớn từ lá cây chàm mèo (Strobilanthes cusia) sẵn có tại Việt Nam qua phương pháp lên men kiềm hóa đơn giản và rẻ tiền, hoặc ngưng tụ dịch chiết indican với isatin. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên này làm chất đầu giúp rút ngắn quy trình tổng hợp toàn phần, giảm chi phí hóa chất độc hại, tận dụng hiệu quả nguồn dược liệu trong nước để tạo ra các dẫn xuất có giá trị cao.

2. Luận án đã tổng hợp bao nhiêu dãy dẫn xuất mới và biến đổi ở những vị trí nào trên khung indirubin?

Luận án đã tổng hợp 5 dãy dẫn xuất chính (hơn 40 hợp chất mới) thông qua các vị trí biến đổi:

• Biến đổi tại nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime: Dãy 42a-42i (cầu nối trimethylen gắn dị vòng azole/purine), dãy 43a-43i (cầu nối 2-ol-1,3-propylen gắn dị vòng azole/purine), và dãy 53a-53l (cầu nối methylen-1,2,3-triazole gắn hydroxychalcone).
• Biến đổi tại dị vòng nitơ N-1: Dãy 45a-45h (cầu nối 2-ol-1,3-propylen gắn dị vòng azole/purine).
• Biến đổi đồng thời tại cả C-3ʹ-oxime và N-1: Dãy 56a-56l (mang nhóm oxime tại C-3ʹ và nhóm methylen-1,2,3-triazole-chalcone tại N-1) và dãy 56m-56p (gắn các hợp phần amine tại N-1).

3. Phản ứng Click được ứng dụng như thế nào trong luận án?

Phản ứng Click cộng đóng vòng 1,3-lưỡng cực Huisgen xúc tác đồng(I) ($\text{CuSO}_4 \cdot 5\text{H}_2\text{O}$ và sodium ascorbate) được sử dụng để liên kết các hợp phần indirubin mang nhóm alkyne (chất trung gian 52 hoặc 55) với các dẫn xuất chalcone mang nhóm azide (51a-51l) hoặc các dẫn xuất amine mang nhóm azide, tạo ra cầu nối 1,2,3-triazole bền vững với hiệu suất phản ứng cao.

4. Đơn tinh thể tia X được đo cho hợp chất nào và mang lại thông tin cấu trúc gì?

Nhiễu xạ tia X đơn tinh thể được thực hiện thành công trên hợp chất trung gian (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime (55). Kết quả khẳng định chắc chắn cấu hình không gian của liên kết đôi $\text{C-2}=\text{C-2}^\prime$ là đồng phân $(Z)$ và cấu hình của nhóm oxime tại vị trí C-3ʹ là đồng phân $(E)$.

5. Kết quả mô phỏng docking phân tử trên enzyme GSK-3β cho thấy điều gì?

Mô phỏng bằng AutoDock 4 trên cấu trúc tinh thể GSK-3β (PDB ID: 1Q41) chỉ ra các dẫn xuất lai của indirubin gắn kết thuận lợi vào khoang liên kết ATP của enzyme. Khung indirubin tạo liên kết hydro với Asp133 và Val135, trong khi các nhánh dị vòng, triazole và chalcone mở rộng tương tác với các amino acid lân cận như Lys85, Glu97 và Arg141. Năng lượng tự do gắn kết tính toán ($\Delta G_{\text{bind}}$) có sự tương quan chặt chẽ với hoạt tính ức chế tế bào ung thư thực nghiệm in vitro.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Trọng Dân là công trình thực nghiệm hoàn chỉnh về hóa học bán tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học trên khung bisindole alkaloid indirubin phân lập từ cây chàm mèo (Strobilanthes cusia). Tác giả đã tổng hợp thành công hơn 40 dẫn xuất mới thuộc 5 dãy cấu trúc lai hóa với các dị vòng chứa S, N, O, khung hydroxychalcone và các hợp phần amine, đồng thời xác định cấu trúc đơn tinh thể tia X của hợp chất trung gian then chốt. Hầu hết các dẫn xuất mới đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro vượt trội so với indirubin tự nhiên trên 4 dòng tế bào ung thư người (SW480, LU-1, HepG2, HL-60). Kết quả tính toán docking phân tử trên enzyme GSK-3β đã làm sáng tỏ cơ chế gắn kết và mối tương quan cấu trúc - hoạt tính, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc nghiên cứu phát triển các thuốc kháng u mới từ nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên được tạo thành từ quá trình sinh tổng hợp trong thực động vật, vi sinh vật thường có các hoạt tính sinh học rất đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào cơ thể và ít tác dụng phụ. Vì thế, nhiều chất trong số chúng đã được sử dụng rộng rãi trong thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị các bệnh này được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chúng. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên thường rất phức tạp mà bằng con đường tổng hợp toàn phần sẽ không kinh tế vì phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý môi trường cao, thời gian phản ứng dài. Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập các chất dẫn đường, sau đó chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt hơn chất dẫn đường đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học.

Gần đây, các nhà khoa học đã khám phá nhiều hoạt tính sinh học của hợp chất indirubin và dẫn xuất, một bisindole alkaloid có thể được thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều ở Việt Nam hoặc bằng phản ứng giữa isatin và indoxyl acetate. Hoạt chất này và dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quí như gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với cơ chế rõ ràng, đến thời điểm hiện tại các công bố về các hoạt tính này vẫn đang tiếp tục. Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất này vào thực tế vẫn còn khó khăn do độ tan kém trong nước, một số công trình đã và đang nghiên cứu sử dụng hướng thứ nhất để cải thiện độ tan của indirubin, theo hướng thứ hai một số dẫn xuất cũng đã được tổng hợp tuy nhiên các công bố vẫn chưa nhiều. Theo hướng này, đề tài của luận án đề cập tới tổng hợp một số dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất dị vòng chứa S, N, O; các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine, sau đó đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung các dữ liệu về hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tìm kiếm các thuốc mới để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có trong nước.

Vì thế, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin”. 1 luan an Mục tiêu của luận án: - Tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia. - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra. Nội dung của luận án: 1.

Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine; 2. Xác định cấu trúc của các dẫn xuất mới tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại; 3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) của các dẫn xuất mới tổng hợp được; 4. Nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất mới tổng hợp được sử dụng phần mềm AutoDock 4.

Giới thiệu về indirubin và một số đồng phân Indirubin là một bisindole alkaloid có màu đỏ thẫm có công thức phân tử là C16H10N2O2 (M = 262 g/mol), tên IUPAC: (3Z)-3-(3-oxo-1,3-dihydro-2H-indol-2- ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one, nhiệt độ nóng chảy 356,2÷357,8 oC, hợp chất này không tan trong nước, tan ít trong methanol, ethanol, tan nhiều hơn trong acetone, DMSO, DMF. Phổ UV-VIS của nó trong dung môi 1,1,2,2-tetrachloroethane có các cực đại ở 291, 356 và 540 nm [1]. Indirubin có công thức cấu tạo như Hình 1. Công thức cấu tạo của indirubin 1 Phân tử indirubin có một liên kết hydro nội phân tử được hình thành giữa nguyên tử H-1ʹ với nguyên tử O của nhóm C=O ở C-2 và liên kết này được chứng minh qua nhiễu xạ tia X đơn tinh thể [2].

Nhóm tác giả cũng chỉ ra sự liên hợp giữa các phân tử indirubin với nhau, đây cũng là một trong những lý do kém tan của indirubin. Indirubin 1 và một số đồng phân của nó như indigotin 2 màu xanh, indigo 3 màu xanh, isoindirubin 4 màu đỏ, isoindigo 5 màu nâu được tìm thấy trong lá của cây Isatis tinctoria [3] (Hình 1. Công thức cấu tạo của một số đồng phân của indirubin 3 luan an Từ bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc tên là Danggui Longhui Wan để điều trị bệnh ung thư bạch cầu Leukemia, gồm 11 thảo dược khác nhau. Năm 1966 các nhà khoa học thuộc Viện Huyết học, Viện Dược khoa Trung Quốc đã xác nhận tác dụng này nằm trong một vị thuốc có tên Thanh Đại [4].

Thanh Đại là bột màu xanh đen được làm từ lá của một số cây như: Strobilanthes cusia (Nees. Kuntze - chàm mèo (Acanthaceae), Polygonum tinctorium (Polygonaceae) ở Nhật Bản, Isatis indigotica (Brassicaceae), Indigofera suffrutticosa (Fabaceae) và Indigofera tinctoria L. Bột chàm chứa hàm lượng lớn indigotin 2, một phẩm nhuộm tự nhiên màu chàm xanh. Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng chúng có chứa indirubin 1 và hoạt tính chống ung thư bạch cầu của bột chàm là do hoạt tính indirubin mà có.

Năm 1999, các nhà khoa học Đức đã công bố indirubin và các dẫn xuất có tác dụng ức chế enzyme kinase phụ thuộc cyclin (CDK) [4]. Các enzyme CDK, một họ kinase protein được hoạt hóa bởi cyclin, có chức năng điều khiển chu trình tế bào thông qua việc gắn các nhóm photphat vào cơ chất protein (quá trình phosphoryl hóa) kiểm soát các quá trình này trong tế bào. Các CDK còn tham gia vào việc điều khiển các quá trình phiên mã, xử lý mRNA và quá trình tự chết của tế bào. Các CDK photphoryl hóa các protein ở các đoạn chứa các aminoaxit Serin và Threonin thuộc vùng vị trí hoạt động.

Cho tới nay đã có 9 CDKs (cdk1-9) và khoảng trên 16 cyclin gắn kết đã được xác định và đang từng bước được làm rõ mối liên quan đến các bệnh khác nhau như ung thư, tiểu đường, Alzheimer’s, thần kinh… Indirubin và dẫn xuất của nó là các chất có hoạt tính sinh học cao, chúng ức chế các enzyme CDK1, CDK2, GSK-3β [5, 6], qua đó tác động đến chu trình hình thành và phát triển của tế bào ung thư, bởi vậy chúng là các đối tượng nhận được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Thu nhận, tổng hợp indirubin 1. Thu nhận indirubin từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia Indirubin 1 có thể được thu nhận từ lá chàm mèo Strobilanthes cusia theo quy trình của Nguyễn Mạnh Cường và cộng sự [7]. Lá chàm mèo được thái nhỏ, để lên men 3 ngày sau đó lọc rồi kiềm hóa, tách lấy bột chàm.

Bột chàm thu được chiếm 0,75% lượng mẫu tươi, nhiều hơn so với lượng bột chàm nhận được khi tiến hành theo quy trình trong dân gian, hàm lượng indirubin cũng cao hơn so với hàm lượng 4 luan an indirubin trong bột chàm theo quy trình trong dân gian. Indirubin được phân tách bằng sắc ký cột silicagel (cỡ hạt 0,063÷0,4 mm) hệ dung môi rửa giải n- hexan/dichloromethan tăng dần độ phân cực. Ngoài ra, một lượng lớn indirubin có thể thu được bằng phản ứng của dịch chiết nước giàu indican từ lá chàm mèo với isatin trong môi trường kiềm theo phương pháp của chính nhóm tác giả [8]. Tổng hợp indirubin từ nguyên liệu hóa học Indirubin được Baeyer tổng hợp từ khá sớm bằng phản ứng ngưng tụ giữa isatin 6 và indoxyl 7 sử dụng dung môi ethanol, xúc tác Na2CO3 (Sơ đồ 1.

Tuy nhiên, indoxyl 7 là chất trung gian khó tổng hợp và không bền, dễ bị dime hóa để tạo thành indigotin 2. Để khắc phục nhược điểm này, năm 1969, Rusell và Kaupp cải tiến phương pháp tổng hợp của Baeyer bằng cách thay indoxyl 7 bằng indoxyl acetate 8 bền hơn, thay dung môi ethanol bằng methanol (Sơ đồ 1.2), cũng giống như nghiên cứu của Bayer các tác giả không công bố hiệu suất của phản ứng [10]. Hiện nay phương pháp này được sử dụng khá phổ biến để điều chế indirubin và hầu hết các dẫn xuất của nó. Tổng hợp indirubin từ isatin và indoxyl Sơ đồ 1.

Tổng hợp indirubin theo Rusell và Kaupp Năm 2017, Cuiling Wang và cộng sự công bố qui trình tổng hợp indirubin 1 giai đoạn bằng cách khử isatin 6 bởi tác nhân KBH4 trong dung môi methanol. Phản ứng tiến hành trong không khí ở nhiệt độ hồi lưu với tỷ lệ mol của isatin/KBH4 là 2/1. Phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu suất tạo thành sản phẩm indirubin cao (90,8%) (Sơ đồ 1. Tổng hợp indirubin bằng cách khử isatin 6 bởi KBH4 Tóm lại, indirubin có thể được tổng hợp từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia hoặc được tổng hợp từ các phản ứng hóa học khác nhau, trong đó phản ứng của Russel và Kaupp (Sơ đồ 1.2) là phản ứng thường được dùng để điều chế indirubin hiện nay.

Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 1. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin từ các dẫn xuất của isatin và indoxyl acetate. Trong hai công trình được công bố vào các năm 2010 và 2017, Cheng và các cộng sự đã thực hiện phản ứng ngưng tụ giữa các dẫn xuất của isatin 9 và indoxyl acetate 10 trong dung môi methanol, xúc tác Na2CO3 và đã nhân được các dẫn xuất của indirubin 11 với hiệu suất tốt (Sơ đồ 1. Bản chất của phản ứng này vẫn là phương pháp của Rusell và Kaupp [10].

Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 11 Năm 2017, Wang và các cộng sự đã đưa ra một phương pháp để tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 12 có hai nhóm thế giống nhau ở hai bên vòng phenyl đó là thực hiện phản ứng khử hóa các dẫn xuất của isatin 9 bởi KBH4 trong dung môi MeOH, không khí, điều kiện hồi lưu (Sơ đồ 1.5), hiệu suất nhận được các dẫn xuất indirubin là 76,4÷88,4% [11]. Glycosyl hóa indirubin là một phương pháp khá thú vị để cải thiện độ tan của indirubin do sự xuất hiện của nhóm đường. Theo hướng này, một số các hợp chất indirubin N1-glycoside cũng đã được Libnow giới thiệu [14]. Trước hết N-(2,3,4-Tri- O-acetyl-α,β-L-rhamnopyranosyl)isatin 16α,β được điều chế từ đường L-rhamnose (Sơ đồ 1.

Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 12 bằng cách khử hóa các dẫn xuất của isatin 9 bởi KBH4 Sơ đồ 1.