Tổng quan luận án

Điều trị ung thư bằng các thuốc hướng đích có tác dụng chọn lọc lên tế bào ung thư, hạn chế tối đa độc tính trên tế bào lành, đang là hướng nghiên cứu trọng điểm của hóa dược hiện đại. Các dẫn xuất chứa khung quinazoline đã khẳng định vị trí quan trọng trong nhóm thuốc ức chế enzyme Tyrosine Kinases (TKs), với các hoạt chất tiêu biểu được thương mại hóa như gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) và vandetanib (Caprelsa). Tuy nhiên, hiệu quả lâm sàng của các thuốc này thường bị suy giảm theo thời gian do hiện tượng kháng thuốc xuất phát từ đột biến thụ thể và tính không đồng nhất của khối u. Nhằm khắc phục hạn chế này, chiến lược thiết kế các phân tử lai (hybrid molecules) kết hợp đa hợp phần có cơ chế tác dụng khác nhau trên cùng một phân tử duy nhất đang mở ra khả năng mở rộng phổ tác dụng và hạn chế hiện tượng kháng thuốc.

Trong thiết kế phân tử lai, cầu nối 1,2,3-triazole thể hiện tính ưu việt nhờ độ bền vững cao trong môi trường acid, base cũng như trước các tác nhân oxy hóa - khử; bản thân dị vòng triazole còn sở hữu nhiều hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng khuẩn và chống co giật. Hoạt chất kháng virus Zidovudine (AZT) – một dẫn xuất nucleoside – đã được chứng minh có tác dụng chống ung thư rõ rệt trong các thử nghiệm lâm sàng pha I khi phối hợp với 5-fluorouracil và leucovorin. Song song với hướng điều trị ung thư, khung quinazoline còn được chứng minh có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) nhờ khả năng tương tác đồng thời với vùng xúc tác (CAS) và vùng ngoại vi (PAS) của enzyme, mở ra triển vọng phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer (AD). Khoảng trống nghiên cứu then chốt mà luận án xác định là: chưa có công trình nào nghiên cứu việc đưa AZT vào mạch nhánh của khung 4-aminoquinazoline thông qua cầu nối 1,2,3-triazole nhằm tạo ra các phân tử lai đa đích chống ung thư và chống Alzheimer, đồng thời các cấu trúc lai dạng dimer quinazoline cũng chưa từng được nghiên cứu tổng hợp.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể gồm ba nội dung:

  1. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc một số dẫn xuất 4-aminoquinazoline chứa nhóm thế prop-2-yn-1-yloxy ở vị trí C-6; nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc hợp chất lai chứa khung quinazoline bao gồm dimer quinazoline và các hợp chất lai 4-aminoquinazoline-triazole.
  2. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc của các hợp chất lai 4-aminoquinazoline-triazole-AZT.
  3. Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các hợp chất tổng hợp được; nghiên cứu protein docking và dự đoán tính chất dược động học của một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các dẫn xuất 4-aminoquinazoline thế prop-2-yn-1-yloxy tại C-6, hợp chất dimer quinazoline, các hợp chất lai 4-aminoquinazoline-triazole và các hợp chất lai 4-aminoquinazoline-triazole-AZT.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Toàn bộ quá trình tổng hợp hóa học, phân tích phổ xác định cấu trúc được thực hiện tại Phòng Hóa dược, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro được tiến hành tại Phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học. Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2020 tại Hà Nội.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hóa học và hoạt tính sinh học của dị vòng quinazoline, các phương pháp tổng hợp khung quinazoline cũng như các định hướng thiết kế phân tử lai hướng đích:

Các hướng nghiên cứu tiền đề được tác giả tổng thuật bao gồm:

  • Về nhóm thuốc ức chế Tyrosine Kinases (TKs): Các thuốc thế hệ đầu như gefitinib và erlotinib ức chế thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) dùng trong điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ; lapatinib ức chế kép EGFR và HER2/neu; vandetanib ức chế đồng thời VEGFR, EGFR và RET-tyrosine kinase. Cấu trúc 4-anilinoquinazoline gắn các nhóm thế đặc thù tại vòng anilino (tạo tương tác kỵ nước với hốc liên kết ATP) và tại C-6, C-7 của vòng quinazoline (điều biến tính chất lý hóa và tương tác sinh học).
  • Về các phương pháp tổng hợp khung quinazoline:
    1. Phương pháp clo hóa 4(3H)-quinazolinone: Dựa trên phản ứng Niementowski giữa dẫn xuất anthranilic và formamide, clo hóa bằng $\text{POCl}3$ rồi thế ái nhân bằng amine thích hợp. Nhóm A. Goossens đã tổng hợp các dẫn xuất N-alkylanilinoquinazoline từ 4-chloro-6,7-dimethoxyquinazoline, ghi nhận chất 21d có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư ruột kết HT-29 với $\text{IC}{50} = 5{,}6\ \mu\text{M}$. Malose Jack Mphahlele và cộng sự tổng hợp dãy 4-(halogenoanilino)-6-bromoquinazoline và 6-(4-fluorophenyl)quinazoline có hoạt tính ức chế tế bào HeLa, MCF-7 và ức chế EGFR-TKs. Tarek Mohamed và cộng sự (2017) tổng hợp các dẫn xuất quinazoline ức chế AChE từ acid chloro-2-aminobenzoic, thu được hợp chất 33h ($\text{IC}{50} = 6{,}8\ \mu\text{M}$) và 33e ($\text{IC}{50} = 6{,}5\ \mu\text{M}$).
    2. Phương pháp đóng vòng giữa formamidine và amine: Được ứng dụng trong tổng hợp hoạt chất erlotinib. Kun Hu và cộng sự (2018) phát triển phản ứng đóng vòng từ nitrile và 2-aminobenzonitrile với xúc tác phức paladi như $\text{Pd(OAc)}_2$, $\text{Pd(acac)}_2$, tổng hợp 58 dẫn xuất quinazoline với hiệu suất 48–91%. Dhawwal và cộng sự (2018) sử dụng hệ oxy hóa $\text{I}_2/\text{O}_2$ không dùng dung môi để tổng hợp các 2-arylquinazoline từ 2-aminobenzaldehyde và benzylamine với hiệu suất 49–90%.
    3. Phương pháp domino đa thành phần dùng xúc tác kim loại: Đóng vòng oxy hóa $\text{C(sp}^3\text{)–H/C(sp}^2\text{)–H}$ từ N-alkyl-N'-arylamidine sử dụng $\text{K}_2\text{S}_2\text{O}_8$ đạt hiệu suất tới 99%; hoặc phản ứng cộng hợp đóng vòng [2+2+2] giữa muối diaryliodonium và hai phân tử nitrile xúc tác bởi $\text{Cu(OTf)}_2$.
  • Về các hợp chất lai của quinazoline:
    • Tony Fröhlich và Christoph Reiter (2017) lai hóa quinazoline với artemisinin, tạo ra hợp chất lai 70 có hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum 3D7 ($\text{EC}{50} = 1{,}4\ \text{nM}$) và gây độc dòng tế bào ung thư bạch cầu CCRF-CEM ($\text{EC}{50} = 2{,}8\ \mu\text{M}$), CEM/ADR5000 ($\text{EC}{50} = 0{,}6\ \mu\text{M}$); hợp chất 68 và 69 kháng cytomegalovirus ($\text{EC}{50} = 0{,}15\text{–}0{,}21\ \mu\text{M}$).
    • B. Biswadip và cộng sự (2018) tổng hợp các phân tử lai quinazoline-triazole bằng phản ứng click azide-alkyne (xúc tác $\text{CuI}$), trong đó hợp chất 76 ức chế dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với $\text{IC}_{50} = 20{,}71\ \mu\text{M}$, tạo liên kết hydro với Met769 của EGFR.
    • Min, J. và cộng sự (2016) tổng hợp quinazoline chứa nhân 1,2,4-triazole (các hợp chất 86, 87, 88) có khả năng ức chế enzyme kinase ATM tương đương chất chuẩn KU55933.
    • Mahboobi, S. và cộng sự (2010) thiết kế phân tử lai giữa lapatinib và (E)-3-(aryl)-N-hydroxyacrylamide, tạo ra dẫn chất 94a ức chế kép EGFR/HER2 và HDAC với $\text{IC}_{50} = 0{,}011\ \mu\text{M}$ trên HER2.
    • Zhang, Y. và cộng sự (2015) gắn nhóm thuốc chống viêm không steroid (NSAID) vào vị trí C-6 hoặc C-7 của khung quinazoline, thu được hợp chất 100d (với naproxen) ức chế mạnh EGFR ($\text{IC}_{50} = 0{,}08\ \mu\text{M}$) và enzyme COX-2.
    • Xiong Cai và cộng sự (2010) tổng hợp 24 chất lai quinazoline - acid hydroxamic ức chế HDAC, EGFR và HER2, tiêu biểu là hợp chất 113a có giá trị $\text{IC}_{50}$ lần lượt là 4,4 nM (HDAC), 2,4 nM (EGFR) và 15,7 nM (HER2).
    • Nghiên cứu trong nước của nhóm GS. Nguyễn Văn Tuyến đã thực hiện phản ứng click tạo dẫn xuất lai giữa triterpenoid khung lupan với AZT, đồng thời tổng hợp thành công erlotinib hydroclorid.

Vị trí của luận án: Kế thừa hướng tổng hợp khung 4-aminoquinazoline thông qua dẫn xuất trung gian formamidine xuất phát từ nguyên liệu 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde; phát triển chiến lược gắn nối các hợp phần có hoạt tính cao là dị vòng 1,2,3-triazole và thuốc kháng virus AZT vào vị trí C-6; đồng thời mở rộng tổng hợp hệ phân tử dimer quinazoline và dimer lai quinazoline-triazole hướng tới mục tiêu ức chế kép ung thư và Alzheimer.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Đặc điểm cấu tạo và khả năng phản ứng của khung quinazoline: Quinazoline (1,3-benzodiazine) là hệ dị vòng thơm gồm vòng benzene ngưng tụ với vòng pyrimidine, chứa hệ thống 10 electron $\pi$ phân bố không đều. Hợp chất có tính base yếu ($\text{p}K_a = 3{,}51$), bền với các tác nhân oxy hóa. Phản ứng thế ái điện tử ($\text{S}_E$) ưu tiên xảy ra tại vị trí C-6 do có sự tạo muối ở giai đoạn trung gian làm định hướng thế khác với các diazine khác. Phản ứng thế ái nhân ($\text{S}_N$) thuận lợi về mặt năng lượng tại vị trí C-2 và C-4.
  • Cơ chế ức chế Tyrosine Kinases: Phân tử 4-anilinoquinazoline cạnh tranh trực tiếp với phân tử ATP tại vị trí gắn kết của enzyme TKs (EGFR, HER2, VEGFR, RET). Khung quinazoline cùng nhóm anilino tại C-4 lấp đầy hốc kỵ nước, ngăn cản quá trình phosphoryl hóa tyrosine trên chuỗi polypeptide, làm ngừng con đường truyền tín hiệu tăng sinh tế bào khối u.
  • Cơ chế ức chế Acetylcholinesterase (AChE): Khoang hoạt động của AChE sâu $20\ \text{Å}$ và rộng $5\ \text{Å}$, gồm hai vị trí gắn kết chính:
    1. Vùng xúc tác (CAS) ở đáy khoang: chứa bộ ba xúc tác Ser200, His440, Glu327; túi oxyanion (Gly118, Gly119, Ala201); túi acyl (Phe288, Phe290); và vị trí anion (Trp84, Tyr130, Phe330, Phe331) chịu trách nhiệm liên kết nhóm amoni bậc bốn bằng tương tác cation-$\pi$.
    2. Vùng ngoại biên (PAS) ở lối vào khoang: gồm Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279 và Tyr334, trong đó Trp279 đóng vai trò thúc đẩy sự kết tập mảng $\beta$-amyloid ($\text{A}\beta$). Các phân tử có cấu trúc liên hợp kéo dài hoặc phân tử lai có khả năng gắn kết đồng thời lên cả CAS và PAS sẽ ức chế quá trình thủy phân acetylcholine đồng thời giảm kết tập $\text{A}\beta$.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp tổng hợp hữu cơ: Tiến hành các phản ứng alkyl hóa ether hóa nhóm phenol, phản ứng ngưng tụ tạo oxime, phản ứng dehydrat hóa chuyển oxime thành benzonitrile, phản ứng khử chọn lọc nhóm nitro bằng natri dithionite ($\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_4$), phản ứng tạo dẫn xuất formamidine bằng N,N-dimethylformamide dimethyl acetal (DMF-DMA), phản ứng đóng vòng tạo dẫn xuất 4-aminoquinazoline, và phản ứng cộng hợp đóng vòng 1,3-lưỡng cực CuAAC (phản ứng Click) giữa alkyne và azide có mặt xúc tác $\text{Cu(I)}$.
  • Phương pháp xác định cấu trúc:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ ở tần số 500 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ ở tần số 125 MHz, cùng các phổ 2D-NMR gồm HMBC, HSQC) đo trên máy Bruker Avance XL-500, sử dụng dung môi $\text{CDCl}_3$ hoặc $\text{DMSO-}d_6$, chất chuẩn nội TMS.
    • Phổ khối lượng phân giải thấp (ESI-MS) ghi trên máy Hewlett Packard Mass Spectrometer 5989 MS và LC-MSD-Trap-SL.
    • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) ghi trên máy LTQ Orbitrap XL.
    • Phổ hồng ngoại (IR) đo dạng viên ép KBr trên máy Impact 410-Nicolet.
    • Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Buchi Melting Point B-545.
    • Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC, silica gel 60 $\text{GF}_{254}$) và tinh chế chất bằng sắc ký cột (CC, silica gel $0{,}040\text{–}0{,}063\ \text{mm}$).

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học và mô phỏng in silico

  • Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Sử dụng phương pháp MTT của Mosmann thử nghiệm trên 3 dòng tế bào ung thư người có nguồn gốc từ ATCC: ung thư biểu mô KB ($\text{CCL-17}^{\text{TM}}$), ung thư gan Hep-G2 ($\text{HB-8065}^{\text{TM}}$) và ung thư phổi Lu-1 ($\text{HTB-57}^{\text{TM}}$).
  • Thử hoạt tính ức chế acetylcholinesterase in vitro: Thực hiện theo phương pháp đo quang của Ellman.
  • Nghiên cứu mô phỏng gắn kết phân tử (Protein Docking): Sử dụng phần mềm ICM-Pro Molsoft 3.8 trên mô hình cấu trúc tinh thể AChE người (chuỗi A, mã PDB ID: 4EY7), đối chứng với phối tử Donepezil. Phân tích tương tác không gian bằng phần mềm MOE và Discovery Studio.
  • Dự đoán thông số dược động học và độc tính:
    • Đánh giá độ phù hợp đường uống theo Quy tắc số 5 của Lipinski (MW < 500 Da, $\text{HBD} \le 5$, $\text{HBA} \le 10$, $\text{MlogP} \le 4$).
    • Dự đoán độc tính theo quy tắc của Jason D. Hughes.
    • Tính toán độ hòa tan trong nước (ESOL) theo phương trình Delaney.
    • Dự đoán khả năng hấp thu qua tế bào biểu mô ruột Caco-2 theo mô hình PRule (Phạm Thế Hải).
    • Dự đoán khả năng thấm qua hàng rào máu não (BBB) theo mô hình cây phân loại của Juan A. Castillo-Garit.
    • Dự đoán tương tác chất nền/chất ức chế P-glycoprotein (mô hình Jurica Levatić) và hệ thống ADMET qua cơ sở dữ liệu admetSAR (Feixiong Cheng).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu tạo, tính chất lý hóa, các quy luật phản ứng thế ái điện tử và thế ái nhân của dị vòng quinazoline. Trình bày chi tiết các nhóm thuốc ức chế Tyrosine Kinases thương mại và mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của khung 4-anilinoquinazoline (vị trí nhóm thế tại vòng aniline và vòng quinazoline). Tổng thuật các con đường bệnh sinh của bệnh Alzheimer, cấu tạo không gian của enzyme acetylcholinesterase với các acid amin đặc hiệu tại vùng CAS (Ser200, His440, Glu327, Trp84, Tyr130, Phe330, Phe331) và vùng PAS (Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279, Tyr334).

Chương này cũng phân tích 3 phương pháp tổng hợp chính của dẫn xuất 4-aminoquinazoline (clo hóa quinazolinone, đóng vòng formamidine - amine, phản ứng domino xúc tác kim loại), các cấu trúc phân tử lai tiêu biểu của quinazoline với artemisinin, triazole, ATM kinase inhibitor, HDAC inhibitor, NSAID, hydroxyacrylamide và AZT. Đồng thời, chương 1 trình bày nguyên lý kỹ thuật docking phân tử và các mô hình dự đoán ADMET phục vụ định hướng sàng lọc thuốc.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, điều kiện phản ứng, hóa chất và thiết bị phân tích cấu trúc, cũng như các bước tổng hợp hóa học:

Hợp chất / Nhóm chất Tên hóa học / Quy trình điều chế Điều kiện phản ứng chính Hiệu suất Điểm nóng chảy ($^\circ\text{C}$) / Trạng thái
125 2-nitro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)benzaldehyde 124 + propargyl bromide, $\text{Cs}_2\text{CO}_3$, DMF, rt, 8h 97% 84–85 $^\circ\text{C}$ (rắn nâu)
126 (E)-2-nitro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)benzaldehyde oxime 125 + $\text{NH}_2\text{OH}\cdot\text{HCl}$, MeOH/$\text{H}_2\text{O}$, NaOH 1N, 25–30 $^\circ\text{C}$ 95% 64–65 $^\circ\text{C}$ (dầu rắn nâu)
127 2-nitro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)benzonitrile 126 + acetic anhydride, hồi lưu 130 $^\circ\text{C}$, 12h 85% Dầu màu nâu
128 2-amino-5-(prop-2-yn-1-yloxy)benzonitrile 127 + $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_4$, $\text{MeOH/H}_2\text{O}$, 50–65 $^\circ\text{C}$, HCl đđ 65% 163–164 $^\circ\text{C}$ (rắn vàng nhạt)
129 (E)-N'-(2-cyano-4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl)-N,N-dimethylformimidamide 128 + DMF-DMA, AcOH, toluene, hồi lưu 4h 80% Dầu vàng nhạt
130a N-(3-nitrophenyl)-6-(prop-2-yn-1-yloxy)quinazolin-4-amine 129 + 3-nitroaniline, AcOH, toluene, 60 $^\circ\text{C}$ đến hồi lưu — 222–223 $^\circ\text{C}$ (rắn vàng)
130b N-benzyl-6-(prop-2-yn-1-yloxy)quinazolin-4-amine 129 + benzylamine, AcOH, toluene, 60 $^\circ\text{C}$ đến hồi lưu — 114–115 $^\circ\text{C}$ (rắn trắng)
130c 4-(4-methylpiperazin-1-yl)-6-(prop-2-yn-1-yloxy)quinazoline 129 + 1-methylpiperazine, AcOH, toluene 65% Dầu xanh đậm
130d N-(3-ethynylphenyl)-6-(prop-2-yn-1-yloxy)quinazolin-4-amine 129 + 3-ethynylaniline, AcOH, toluene 65% 164–165 $^\circ\text{C}$ (rắn trắng)
140 5,5'-(propane-1,3-diylbis(oxy))bis(2-nitrobenzaldehyde) 124 + 1,3-dibromopropane, $\text{Cs}_2\text{CO}_3$, MeCN, 50 $^\circ\text{C}$, 12h 70% 159–160 $^\circ\text{C}$ (rắn vàng nhạt)
141 5,5'-(propane-1,3-diylbis(oxy))bis(2-nitrobenzaldehyde) dioxime 140 + $\text{NH}_2\text{OH}\cdot\text{HCl}$, MeOH, NaOH, 25–30 $^\circ\text{C}$ 97% 64–65 $^\circ\text{C}$ (rắn trắng ngà)
142 5,5'-(propane-1,3-diylbis(oxy))bis(2-nitrobenzonitrile) 141 + acetic anhydride, hồi lưu 130 $^\circ\text{C}$, 8–12h 70% < 60 $^\circ\text{C}$ (rắn nâu nhạt)
143 5,5'-(propane-1,3-diylbis(oxy))bis(2-aminobenzonitrile) 142 + $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_4$, $\text{H}_2\text{O}$, 50–65 $^\circ\text{C}$, HCl đđ 75% 129–130 $^\circ\text{C}$ (rắn trắng)
145 6,6'-(propane-1,3-diylbis(oxy))bis(N-(3-ethynylphenyl)quinazolin-4-amine) 143 + DMF-DMA tạo 144, sau đó + 3-ethynylaniline, AcOH, 60 $^\circ\text{C}$ — Dimer quinazoline

Chương 2 cũng trình bày quy trình tổng hợp các azide (123), tổng hợp dãy chất lai 4-aminoquinazoline-triazole (148–151, dimer 152), dãy chất lai chứa AZT (153–156), phương pháp đo MTT trên 3 dòng tế bào ung thư (KB, Hep-G2, Lu-1), phương pháp đo quang ức chế AChE của Ellman, cùng quy trình docking phân tử trên AChE (PDB ID: 4EY7) và các thuật toán tính toán ADMET.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày chi tiết kết quả tổng hợp hóa học, luận giải phổ xác định cấu trúc, cơ chế phản ứng và kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

  • Chiến lược tổng hợp và cơ chế đóng vòng: Luận án chứng minh phản ứng đóng vòng giữa dẫn xuất formamidine (129) và các amine mạch thẳng/thơm xảy ra theo cơ chế thế ái nhân và đóng vòng liên tiếp. Tác giả đề xuất hai mô hình đóng vòng nội phân tử: cơ chế kiểu 6-exo-trig tấn công vào nguyên tử carbon $\text{C(sp}^2\text{)}$ của nhóm imine, và cơ chế kiểu 6-exo-dig tại vị trí carbon $\text{C(sp)}$ của nhóm cyano.
  • Tổng hợp hệ dimer và phân tử lai:
    • Phân tử dimer quinazoline đối xứng 145 được tổng hợp thành công qua chuỗi phản ứng 5 bước từ chất đầu 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde với cầu nối 1,3-dioxypropane.
    • Phản ứng cộng vòng 1,3-lưỡng cực CuAAC giữa alkyne đầu mạch (ở vị trí C-6 hoặc trên vòng anilino) với các dẫn xuất azide tương ứng tạo ra các dãy chất lai 1,2,3-triazole (148–151) và dimer lai triazole (152a–d).
    • Phản ứng lai ghép ba thành phần giữa quinazoline, triazole và hoạt chất AZT tạo ra các hợp chất 153, 154a–c, 155a–d, 156. Cấu trúc của tất cả các chất được xác định đầy đủ qua phân tích chi tiết độ dịch chuyển hóa học ($\delta$), độ phân tách ($J$) trên phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, tương tác không gian trên phổ HMBC, HSQC và khối phổ phân giải cao HR-MS.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học:
    • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Sàng lọc trên 3 dòng tế bào KB, Hep-G2 và Lu-1 chỉ ra một số dẫn xuất 4-aminoquinazoline và các phân tử lai thể hiện hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh tế bào ung thư.
    • Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase: Các hợp chất lai quinazoline-triazole thể hiện khả năng ức chế enzyme AChE in vitro rõ rệt.
  • Kết quả Protein Docking và dự đoán dược động học:
    • Docking trên cấu trúc tinh thể AChE người (PDB ID: 4EY7) cho thấy các hợp chất lai tiêu biểu như 148a, 149a, 149b, 150a, 150b gắn kết vừa vặn vào khoang hoạt động của enzyme, tạo tương tác liên kết kép với cả vị trí anion xúc tác (CAS) và vị trí ngoại biên (PAS), tương đồng với cơ chế gắn kết của chất chuẩn Donepezil.
    • Dự đoán các chỉ số ADMET cho thấy các hợp chất lai khảo sát đáp ứng các tiêu chuẩn cơ bản về độ hòa tan, tính thấm qua màng tế bào Caco-2, khả năng vượt qua hàng rào máu não (BBB) và tương tác với protein vận chuyển P-glycoprotein.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Đóng góp về mặt tổng hợp hữu cơ:
    • Xây dựng thành công quy trình tổng hợp hiệu quả hệ dẫn xuất 4-aminoquinazoline mới chứa nhóm thế prop-2-yn-1-yloxy ở vị trí C-6 xuất phát từ nguyên liệu 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde thông qua phản ứng ngưng tụ đóng vòng giữa dẫn xuất formamidine và amine.
    • Đề xuất và luận giải cơ chế hình thành khung quinazoline theo hai hướng đóng vòng 6-exo-trig và 6-exo-dig.
    • Tổng hợp thành công hợp chất dimer quinazoline đối xứng 145 và chuỗi các dẫn xuất phân tử lai đa thành phần: 4-aminoquinazoline-triazole (148–151), dimer quinazoline-triazole (152) và 4-aminoquinazoline-triazole-AZT (153–156) thông qua phản ứng click CuAAC.
  2. Đóng góp về dữ liệu cấu trúc và hóa dược:
    • Xác định và minh chứng đầy đủ cấu trúc hóa học của toàn bộ các chất trung gian và sản phẩm lai mới bằng các phương pháp phổ hiện đại ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC, IR, ESI-MS, HRMS).
    • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm in vitro về hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư (KB, Hep-G2, Lu-1) và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các dãy chất nghiên cứu.
    • Ứng dụng mô phỏng docking phân tử trên enzyme AChE người (PDB ID: 4EY7) và dự đoán các thông số dược động học (ADMET), làm sáng tỏ cơ chế ức chế kép tại hai vùng CAS và PAS của enzyme AChE.
  3. Đề xuất và định hướng:
    • Luận án đề xuất cấu trúc lai 4-aminoquinazoline gắn nối triazole và AZT như một khung phân tử tiềm năng cho các nghiên cứu phát triển thuốc kháng ung thư và kháng Alzheimer hướng đa đích.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Các thử nghiệm sinh học trong luận án mới dừng lại ở quy mô sàng lọc in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư (KB, Hep-G2, Lu-1) và ức chế enzyme AChE bằng phương pháp đo quang; chưa thực hiện khảo sát ức chế trực tiếp trên từng enzyme Tyrosine Kinase đích cô lập (như EGFR, HER2, VEGFR).
    • Các thông số dược động học, tính thấm hàng rào máu não và độc tính mới được đánh giá thông qua các mô hình mô phỏng tính toán in silico (Lipinski, Hughes, ESOL, PRule, admetSAR), chưa có số liệu thử nghiệm dược động học thực nghiệm và thử nghiệm in vivo trên động vật.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng thử nghiệm đánh giá hoạt tính ức chế đặc hiệu trên các enzyme đích Tyrosine Kinase phân lập.
    • Tiến hành các thử nghiệm in vivo về hoạt tính kháng u, cải thiện trí nhớ trên mô hình động vật và đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn.
    • Tối ưu hóa cấu trúc phân tử lai nhằm cải thiện hơn nữa độ tan trong nước và sinh khả dụng đường uống.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược, Hóa sinh và Dược học.
    • Các nhóm nghiên cứu tại các viện, trường đại học và doanh nghiệp dược phẩm đang phát triển các dẫn xuất dị vòng hướng đích điều trị ung thư và bệnh thoái hóa thần kinh.
  • Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
    • Quy trình thực nghiệm tổng hợp các dẫn xuất benzonitrile và formamidine từ 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde với hiệu suất cao, không sử dụng xúc tác kim loại quý đắt tiền.
    • Phương pháp luận giải chi tiết cấu trúc hóa học thông qua hệ thống phổ 1D và 2D NMR, HR-MS.
    • Quy trình tích hợp giữa tổng hợp hữu cơ, thử nghiệm sinh học in vitro với kỹ thuật mô phỏng docking phân tử (ICM-Pro) và dự đoán hồ sơ ADMET.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã sử dụng nguyên liệu ban đầu nào để xây dựng khung quinazoline và tại sao lại định hướng nhóm thế vào vị trí C-6?
Trả lời: Tác giả sử dụng nguyên liệu ban đầu là 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde (124). Vị trí C-6 được lựa chọn để gắn nhóm prop-2-yn-1-yloxy vì đây là nhóm thế nằm ở vòng B của khung 4-anilinoquinazoline, đóng vai trò quyết định đến tính chất hóa lý, độ tan và mật độ điện tử của phân tử mà không làm cản trở tương tác kỵ nước của vòng aniline (tại C-4) với hốc gắn ATP của enzyme đích.

2. Phản ứng nào được sử dụng để ghép nối hợp phần AZT và triazole vào khung quinazoline?
Trả lời: Tác giả sử dụng phản ứng cộng hợp đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyne và azide (phản ứng Click - CuAAC) có xúc tác muối đồng $\text{Cu(I)}$. Nhóm alkyne đầu mạch (propargyl) gắn sẵn tại vị trí C-6 của quinazoline hoặc trên vòng anilino sẽ phản ứng chọn lọc với nhóm azide của AZT hoặc các dẫn xuất alkyl/aryl azide để tạo thành cầu nối 1,2,3-triazole bền vững.

3. Tại sao các dẫn xuất lai 4-aminoquinazoline lại có tiềm năng ức chế kép enzyme acetylcholinesterase (AChE)?
Trả lời: Khoang hoạt động của AChE có cấu trúc hẹp và sâu gồm vị trí xúc tác ở đáy (CAS) và vị trí ngoại biên ở lối vào (PAS). Cấu trúc phân tử lai kéo dài gồm khung 4-aminoquinazoline kết hợp với dị vòng 1,2,3-triazole và các hợp phần mạch nhánh cho phép phân tử tạo các tương tác đồng thời (liên kết hydro, tương tác cation-$\pi$, $\pi\text{–}\pi$) với các amino acid tại cả hai vùng CAS (Ser200, Trp84, Phe330...) và PAS (Trp279, Tyr70...), từ đó tạo ra tác dụng ức chế kép.

4. Những dòng tế bào ung thư nào đã được sử dụng để đánh giá độc tính tế bào trong luận án?
Trả lời: Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá in vitro bằng phương pháp MTT trên 3 dòng tế bào ung thư người chuẩn ATCC gồm: dòng ung thư biểu mô KB ($\text{CCL-17}^{\text{TM}}$), dòng ung thư gan Hep-G2 ($\text{HB-8065}^{\text{TM}}$) và dòng ung thư phổi Lu-1 ($\text{HTB-57}^{\text{TM}}$).

5. Các công cụ và phần mềm nào được tác giả sử dụng cho nghiên cứu mô phỏng và dự đoán dược động học?
Trả lời: Tác giả sử dụng phần mềm ICM-Pro Molsoft 3.8 để thực hiện protein docking trên cấu trúc tinh thể AChE người (PDB ID: 4EY7); phần mềm MOE và Discovery Studio để phân tích tương tác phối tử - protein; cùng các công cụ và cơ sở dữ liệu tính toán trực tuyến gồm quy tắc Lipinski, quy tắc Hughes, phương trình ESOL Delaney, mô hình PRule (Caco-2), cây phân loại BBB và cơ sở dữ liệu admetSAR.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Nga đã xây dựng thành công quy trình tổng hợp một hệ thống đa dạng các dẫn xuất mới của 4-aminoquinazoline, hợp chất dimer quinazoline và các cấu trúc phân tử lai 4-aminoquinazoline-triazole-AZT xuất phát từ 5-hydroxy-2-nitrobenzaldehyde. Toàn bộ cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm cuối cùng đã được xác định sáng tỏ bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, HR-MS, IR). Kết quả thử nghiệm sinh học in vitro và mô phỏng docking phân tử trên AChE người (PDB ID: 4EY7) cùng các dự đoán ADMET đã chứng minh tiềm năng ức chế tế bào ung thư và ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân tử lai tổng hợp được. Công trình đóng góp các dữ liệu khoa học có giá trị cho lĩnh vực hóa dược và định hướng phát triển các tác nhân điều trị đa đích đối với ung thư và bệnh Alzheimer.