Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư là nhóm bệnh lý đặc trưng bởi sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào bất thường, có khả năng xâm lấn và di căn đến các cơ quan khác. Báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2020 ghi nhận khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong do ung thư trên toàn cầu. Các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường gặp hạn chế do độc tính toàn thân và hiện tượng kháng thuốc. Trong đó, sự né tránh quá trình chết theo chương trình (apoptosis) là một trong những cơ chế kháng thuốc điển hình của tế bào ung thư.

Để khắc phục tình trạng này, liệu pháp nhắm trúng đích hướng tới việc kích hoạt lại chu trình apoptosis đang được tập trung nghiên cứu. Caspase-3 giữ vai trò là enzym thực thi trung tâm trong quá trình apoptosis. Do nồng độ tiền enzym procaspase-3 trong tế bào ung thư thường cao hơn nhiều so với tế bào lành, việc phát triển các phân tử nhỏ có khả năng hoạt hóa trực tiếp zymogen này hứa hẹn tạo ra tác dụng tiêu diệt tế bào ác tính có chọn lọc. Sự ra đời của hợp chất PAC-1 (hoạt hóa procaspase-3 thông qua cơ chế chelat ion kẽm $\text{Zn}^{2+}$) cùng các phát hiện về hoạt tính kháng ung thư của dị vòng quinazolin và phân tử oncrasin-1 (tác động chọn lọc trên tế bào đột biến gen K-Ras) đã tạo tiền đề cho chiến lược lai hóa cấu trúc nhằm nâng cao hoạt tính sinh học.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng (năm 2022, Trường Đại học Dược Hà Nội) được thực hiện với 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Tổng hợp được 6 dẫn chất (E)-N'-((1-(4-chlorobenzyl)-1H-indol-3-yl)methylen)-2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (ký hiệu từ Va đến Vf).
  2. Đánh giá độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư và khả năng hoạt hóa caspase-3 của các dẫn chất tổng hợp được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 6 dẫn chất N-acylhydrazon mới mang khung quinazolin-4(3H)-on lai hóa với oncrasin-1 (Va–Vf).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Thực nghiệm tổng hợp hóa học, kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc được thực hiện tại Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (độc tính tế bào và hoạt hóa caspase-3) được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Đề tài hoàn thành vào tháng 5 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

  • Sinh lý học apoptosis và enzym caspase: Quá trình apoptosis diễn ra theo hai con đường chính (nội sinh và ngoại sinh), trong đó caspase (cystein-aspartic protease họ C14) đóng vai trò then chốt. Các caspase khơi mào (caspase-8, -9) kích hoạt caspase thực thi (caspase-3, -6, -7) thông qua việc phân cắt chuỗi polypeptide để hình thành dimer hoạt động. Túi gắn cơ chất S1 của caspase-3 chứa các acid amin Arg-179, Arg-341 và Gln-283, đặc hiệu với gốc aspartat.
  • Cơ chế hoạt hóa procaspase-3 qua trung gian ion $\text{Zn}^{2+}$: Ion $\text{Zn}^{2+}$ nội bào ức chế sự tự hoạt hóa của procaspase-3 bằng cách tạo phức với nhóm sulfhydryl của acid amin cystein tại trung tâm hoạt động. Hợp chất PAC-1 chelat $\text{Zn}^{2+}$ với hằng số phân ly $K_d = 42\text{ nM}$, giải phóng procaspase-3 dạng tự do.
  • Dị vòng quinazolin-4(3H)-on và oncrasin-1: Khung quinazolin-4(3H)-on là cấu trúc phổ biến trong nhiều thuốc điều trị ung thư đã được FDA phê duyệt (Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib). Trong khi đó, oncrasin-1 là phân tử kháng ung thư có khả năng ức chế tương tác giữa $\text{PKC}\iota$ và phức hợp $\text{CDK-9/cyclin T1}$, gây gián đoạn tổng hợp RNA và kích hoạt apoptosis trên dòng tế bào mang đột biến gen K-Ras.
[Khung Quinazolin-4(3H)-on] — [Cầu nối N-Acylhydrazon] — [Hợp phần Oncrasin-1]

Phương pháp nghiên cứu

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Quy trình gồm 4 giai đoạn nối tiếp:
    1. Ngưng tụ đóng vòng quinazolin-4(3H)-on: Phản ứng Niementowski giữa acid 2-aminobenzoic (được thay thế các nhóm thế $\text{R} = \text{H}, 6\text{-CH}_3, 7\text{-CH}_3, 7\text{-OCH}_3, 6\text{-F}, 7\text{-F}$) với formamid ở $120^\circ\text{C}$.
    2. Phản ứng N-alkyl hóa: Tác dụng của quinazolin-4(3H)-on với ethyl cloroacetat sử dụng xúc tác $\text{K}_2\text{CO}_3$ và $\text{KI}$ (theo nguyên lý Finkelstein) trong dung môi aceton ở $60\text{--}80^\circ\text{C}$.
    3. Phản ứng tạo acylhydrazid: Phản ứng giữa ester trung gian và hydrazin monohydrat dư (5 đương lượng) trong ethanol ở nhiệt độ phòng.
    4. Phản ứng ngưng tụ aldol: Tạo liên kết N-acylhydrazon giữa acylhydrazid và oncrasin-1 (xúc tác acid acetic băng, dung môi ethanol hồi lưu).
  • Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silicagel $60\text{ F}_{254}$, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$.
    • Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy Gallenkamp Melting Point Apparatus.
    • Phổ hồng ngoại (FTIR): Ghi trên máy Shimadzu FTIR Affinity-1S (kỹ thuật ép viên $\text{KBr}$, vùng quét $4000\text{--}400\text{ cm}^{-1}$).
    • Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS): Đo trên máy LTQ Orbitrap $\text{XL}^\text{TM}$ với kỹ thuật ion hóa phun mù điện tử ($\text{ESI}^+$).
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ tần số $500\text{ MHz}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ tần số $125\text{ MHz}$): Ghi trên máy Bruker AV-500, dung môi $\text{DMSO-}d_6$, chất chuẩn nội TMS.
  • Phương pháp thử hoạt tính sinh học:
    • Thử độc tính tế bào (in vitro): Phương pháp nhuộm màu Sulforhodamin B (SRB) trên 3 dòng tế bào ung thư người: SW620 (ung thư đại tràng), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt), NCI-H23 (ung thư phổi không tế bào nhỏ). Xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm GraphPad Prism 5 qua 3 lần đo độc lập, đối chứng dương với PAC-1, 5-Fluorouracil (5-FU) và Oncrasin-1.
    • Đánh giá khả năng hoạt hóa caspase-3: Thử nghiệm trên tế bào ung thư hạch bạch huyết người (U937) bằng bộ kit so màu Abcam. Đo mật độ quang của sản phẩm phân cắt $p$-nitroanilin ($p\text{-NA}$) từ cơ chất Ac-DEVD-$p\text{NA}$ ở bước sóng $405\text{ nm}$ theo thời gian (từ 30 đến 300 phút), đối chứng với PAC-1.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về chu trình tế bào, sự khác biệt hình thái giữa hoại tử và apoptosis, cấu trúc không gian của họ enzym caspase và cơ chế ức chế dị lập thể của ion $\text{Zn}^{2+}$ đối với procaspase-3. Tác giả phân tích lịch sử phát triển các chất hoạt hóa caspase từ phân tử đầu tiên PAC-1 ($\text{EC}_{50} = 0,22\ \mu\text{M}$), các dẫn chất cải tiến (S-PAC-1 giảm độc tính thần kinh, WF-210, WF-208) đến các nghiên cứu hóa dược về khung dị vòng quinazolinon và phân tử oncrasin-1. Từ đó, xác lập cơ sở khoa học cho chiến lược lai hóa cấu trúc để tìm kiếm các phân tử kháng ung thư mới.

Chương 2: Nguyên vật liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR) gồm 6 loại acid 2-aminobenzoic có nhóm thế, oncrasin-1, formamid, ethyl cloroacetat, hydrazin monohydrat và hệ dung môi hữu cơ. Mô tả thông số kỹ thuật của hệ thống thiết bị phân tích cấu trúc tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội và quy trình thực nghiệm sinh học in vitro tại Đại học Chungbuk (Hàn Quốc). Thiết kế sơ đồ 4 bước tổng hợp hóa học và chuẩn hóa các phép thử kiểm tra độ tinh khiết (TLC, điểm nóng chảy), khẳng định cấu trúc (IR, HRMS, NMR) và quy trình định lượng hoạt tính sinh học (SRB, kit caspase-3).

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

1. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

Quy trình 4 bước đã tổng hợp thành công 6 dẫn chất mục tiêu (Va–Vf) với hiệu suất từng phản ứng thành phần đều đạt trên $86%$. Sản phẩm trung gian và sản phẩm đích được tinh chế, kiểm tra TLC cho thấy 1 vết đơn gọn, khoảng nóng chảy hẹp ($1\text{--}2^\circ\text{C}$).

Dẫn chất Nhóm thế (R) Điểm nóng chảy ($^\circ\text{C}$) Giá trị $R_f$ (DCM : MeOH = 14:1) Hiệu suất toàn phần (%)
Va $\text{H}$ 193,7 – 195,1 0,65 67,0
Vb $6\text{-CH}_3$ 203,8 – 204,9 0,67 68,5
Vc $7\text{-CH}_3$ 203,1 – 203,9 0,67 66,4
Vd $7\text{-OCH}_3$ 209,3 – 210,2 0,59 59,3
Ve $6\text{-F}$ 200,2 – 201,4 0,62 61,7
Vf $7\text{-F}$ 201,8 – 202,5 0,62 62,2

2. Biện giải và khẳng định cấu trúc

  • Phổ IR: Cả 6 dẫn chất đều xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng của nhóm $\text{N-H}$ amid ($3169\text{--}3179\text{ cm}^{-1}$), $\text{C=O}$ amid ($1682\text{--}1688\text{ cm}^{-1}$), $\text{C=N}$ imin ($1649\text{--}1663\text{ cm}^{-1}$) và liên kết $\text{C}_{sp3}\text{-H}$ của cầu methylen ($2881\text{--}2953\text{ cm}^{-1}$).
  • Phổ HRMS: Xuất hiện đầy đủ pic ion phân tử $[\text{M+H}]^+$ của hai đồng vị $^{35}\text{Cl}$ và $^{37}\text{Cl}$ với tỷ lệ cường độ xấp xỉ $3:1$, phù hợp với công thức phân tử dự kiến.
  • Phổ NMR và phân tích cấu dạng:
    • Chứng minh phản ứng N-alkyl hóa: Phổ $^1\text{H-NMR}$ cho tín hiệu pic đơn của 2 proton nhóm $-\text{NCH}_2\text{CO}-$ ở vùng $\delta\ 4,8\text{--}5,3\text{ ppm}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ xuất hiện pic carbon tương ứng ở $\delta \approx 47\text{ ppm}$ (loại trừ sản phẩm O-alkyl hóa vốn xuất hiện ở $\delta \approx 5,6\text{--}5,7\text{ ppm}$ trên $^1\text{H}$ và $\delta \approx 77\text{ ppm}$ trên $^{13}\text{C}$).
    • Đồng phân lập thể: Sự vắng mặt của tín hiệu proton $\text{NH}$ ở vùng trường rất thấp ($\delta \approx 14\text{ ppm}$) chứng minh liên kết imin tồn tại chọn lọc ở cấu dạng (E). Tín hiệu tách đôi ở một số proton khẳng định sự tồn tại đồng thời của hai cấu dạng quay syn/anti của liên kết amid trong dung dịch $\text{DMSO-}d_6$.

3. Hoạt tính sinh học

  • Độc tính tế bào in vitro: Cả 6 dẫn chất đều thể hiện độc tính tế bào cao trên 3 dòng ung thư khảo sát, vượt trội hơn so với chất đối chứng 5-FU và có hoạt tính tương đương hoặc mạnh hơn PAC-1 cũng như Oncrasin-1.
Dẫn chất / Chất chuẩn Nhóm thế (R) $\text{IC}_{50}$ SW620 ($\mu\text{M}$) $\text{IC}_{50}$ PC3 ($\mu\text{M}$) $\text{IC}_{50}$ NCI-H23 ($\mu\text{M}$)
Va $\text{H}$ $1,01 \pm 0,045$ $1,05 \pm 0,087$ $0,63 \pm 0,002$
Vb $6\text{-CH}_3$ $3,46 \pm 0,082$ $3,36 \pm 0,031$ $1,79 \pm 0,080$
Vc $7\text{-CH}_3$ $0,79 \pm 0,033$ $0,51 \pm 0,050$ $0,70 \pm 0,057$
Vd $7\text{-OCH}_3$ $3,32 \pm 0,096$ $2,76 \pm 0,091$ $1,35 \pm 0,026$
Ve $6\text{-F}$ $0,87 \pm 0,084$ $0,44 \pm 0,023$ $0,62 \pm 0,050$
Vf $7\text{-F}$ $1,21 \pm 0,062$ $1,16 \pm 0,052$ $0,92 \pm 0,048$
5-FU — $8,84 \pm 1,92$ $13,61 \pm 0,46$ $13,45 \pm 3,92$
PAC-1 — $2,63 \pm 0,016$ $2,98 \pm 0,139$ $2,60 \pm 0,012$
Oncrasin-1 — $2,69 \pm 0,031$ $2,41 \pm 0,021$ $2,15 \pm 0,019$
  • Khả năng hoạt hóa caspase-3: Dẫn chất Vc ở nồng độ $50\ \mu\text{M}$ làm tăng mật độ quang tại bước sóng $405\text{ nm}$ trên tế bào U937 từ 0,0124 (ở 30 phút) lên 0,0338 (ở 300 phút), cao hơn rõ rệt so với mẫu trắng không xử lý (Untreated: 0,00865 – 0,0404) và mẫu chứng dung môi (Vehicle: 0,0082 – 0,0388) trong giai đoạn đầu phân cắt cơ chất, chứng minh khả năng kích hoạt caspase-3 nội bào.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Tổng hợp thành công 6 dẫn chất N-acylhydrazon mới mang khung quinazolin-4(3H)-on lai hóa oncrasin-1 (Va–Vf) với hiệu suất toàn phần dao động từ $59,3%$ đến $68,5%$.
  • Dữ liệu phổ IR, HRMS, $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ xác nhận độ tinh khiết cao, cấu trúc N-alkyl hóa và cấu dạng lập thể (E) của các hợp chất.
  • Khảo sát độc tính tế bào cho thấy dẫn chất Ve ($6\text{-F}$) thể hiện hoạt tính mạnh nhất trên dòng PC3 ($\text{IC}{50} = 0,44\ \mu\text{M}$) và NCI-H23 ($\text{IC}{50} = 0,62\ \mu\text{M}$); dẫn chất Vc ($7\text{-CH}3$) thể hiện hoạt tính mạnh trên dòng SW620 ($\text{IC}{50} = 0,79\ \mu\text{M}$) và PC3 ($\text{IC}_{50} = 0,51\ \mu\text{M}$).
  • Thử nghiệm sinh hóa xác nhận dẫn chất Vc có khả năng hoạt hóa enzym caspase-3 in vitro trên dòng tế bào U937.

Đóng góp của nghiên cứu

  • Hiện thực hóa thành công định hướng thiết kế phân tử lai hóa giữa khung quinazolin-4(3H)-on và oncrasin-1 thông qua cầu nối N-acylhydrazon nhằm mục tiêu hoạt hóa caspase.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về quy trình tổng hợp, hằng số vật lý, bộ dữ liệu phổ chuẩn và hoạt tính ức chế tế bào ung thư của một dãy chất mới, làm giàu thêm cơ sở dữ liệu hóa dược phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc kháng ung thư nhắm trúng đích.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Thử nghiệm hoạt hóa caspase-3 mới chỉ tiến hành trên một dẫn chất tiêu biểu (Vc) và trên một dòng tế bào đơn lẻ (U937); đề tài chưa thực hiện đánh giá độc tính tế bào trên các dòng tế bào bình thường (tế bào lành) để xác định chỉ số chọn lọc.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Khảo sát khả năng hoạt hóa caspase-3 của các dẫn chất còn lại (đặc biệt là Ve); tiến hành nghiên cứu cơ chế tạo phức chelat với ion $\text{Zn}^{2+}$; thử nghiệm hoạt tính kháng u trên mô hình động vật (in vivo).

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Hóa dược, Dược học, Hóa học hữu cơ và Dược lý học phân tử.
  • Nội dung tham khảo trọng tâm:
    • Quy trình 4 bước tổng hợp khung quinazolin-4(3H)-on và dẫn chất N-acylhydrazon đạt hiệu suất cao.
    • Phương pháp phân tích, biện giải phổ NMR để phân biệt giữa đồng phân N-alkyl hóa và O-alkyl hóa cũng như xác định cấu dạng (E/Z, syn/anti).
    • Quy trình chuẩn hóa thử nghiệm độc tính tế bào bằng phương pháp SRB và thử nghiệm hoạt hóa caspase-3 bằng kỹ thuật so màu.

Câu hỏi thường gặp

1. Dẫn chất nào thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh nhất trong dãy chất tổng hợp?

Dẫn chất Ve (mang nhóm thế $6\text{-F}$) và Vc (mang nhóm thế $7\text{-CH}3$) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất. Cụ thể, Ve đạt $\text{IC}{50} = 0,44\ \mu\text{M}$ trên dòng PC3 và $0,62\ \mu\text{M}$ trên dòng NCI-H23; Vc đạt $\text{IC}_{50} = 0,51\ \mu\text{M}$ trên dòng PC3 và $0,79\ \mu\text{M}$ trên dòng SW620. Cả hai chất đều có hoạt tính mạnh hơn đáng kể so với 5-FU, PAC-1 và Oncrasin-1.

2. Dữ liệu phổ nào chứng minh phản ứng alkyl hóa xảy ra tại vị trí N-3 thay vì vị trí oxy?

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân khẳng định phản ứng xảy ra tại vị trí $\text{N-}3$: trên phổ $^1\text{H-NMR}$ xuất hiện tín hiệu pic đơn của nhóm $-\text{NCH}_2\text{CO}-$ ở vùng $\delta\ 4,8\text{--}5,3\text{ ppm}$ (nếu là O-alkyl hóa sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp $\delta\ 5,6\text{--}5,7\text{ ppm}$); trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$ xuất hiện pic carbon methylen ở $\delta \approx 47\text{ ppm}$ và không có pic ở $\delta \approx 77\text{ ppm}$ (vốn đặc trưng cho nhóm $-\text{OCH}_2\text{CO}-$).

3. Vì sao các dẫn chất tổng hợp được xác định tồn tại ở cấu dạng (E) của liên kết imin?

Trên phổ $^1\text{H-NMR}$ trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$, không quan sát thấy tín hiệu độ dịch chuyển hóa học của proton $\text{NH}$ ở vùng trường rất thấp khoảng $\delta\ 14\text{ ppm}$ (vốn đặc trưng cho cấu dạng Z do tạo liên kết hydro nội phân tử). Do đó, các dẫn chất đều tồn tại chủ yếu ở cấu dạng (E) để giảm tương tác không gian giữa proton amid và hợp phần oncrasin-1.

4. Phép thử hoạt hóa enzym caspase-3 được thực hiện trên dòng tế bào nào và dựa trên nguyên lý gì?

Thử nghiệm được tiến hành trên dòng tế bào ung thư hạch bạch huyết người (U937) bằng bộ kit so màu Abcam. Nguyên lý dựa trên sự phân cắt cơ chất đặc hiệu Ac-DEVD-$p\text{NA}$ bởi enzym caspase-3 giải phóng phân tử mang màu $p$-nitroanilin ($p\text{-NA}$), được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng $405\text{ nm}$.

5. Vai trò của KI và K2CO3 trong phản ứng N-alkyl hóa chất trung gian là gì?

$\text{K}_2\text{CO}_3$ đóng vai trò base hóa để tách proton, chuyển quinazolin-4(3H)-on thành dạng anion có tính ái nhân mạnh hơn. Một lượng nhỏ $\text{KI}$ được thêm vào để chuyển hóa ethyl cloroacetat thành ethyl iodoacetat theo phản ứng Finkelstein, tạo ra nhóm thế đi ra tốt hơn ($\text{I}^-$ thay vì $\text{Cl}^-$), giúp tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng đã xây dựng thành công quy trình tổng hợp 4 bước và thu nhận 6 dẫn chất N-acylhydrazon mới lai hóa giữa khung quinazolin-4(3H)-on và oncrasin-1 với cấu trúc được khẳng định rõ ràng qua phổ nghiệm. Phần lớn các hợp chất tổng hợp được thể hiện độc tính tế bào in vitro ở mức micromol thấp trên 3 dòng tế bào ung thư SW620, PC3 và NCI-H23, vượt trội so với các đối chứng chuẩn 5-FU, PAC-1 và Oncrasin-1. Dẫn chất tiêu biểu Vc bước đầu chứng minh được khả năng kích hoạt enzym thực thi caspase-3, khẳng định tính đúng đắn của định hướng thiết kế cấu trúc phân tử lai hóa hướng hoạt hóa apoptosis trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư.