ĐẶT VẤN ĐỀ. Giới thiệu về enzym caspase. Cấu trúc chung của các caspase. Cơ chế hoạt hóa enzym caspase trong quả trình apoptosis.
Enzym caspase-3 và sinh lý bệnh ung thư. Các chất hoạt hóa enzym caspase-3. Chất hoạt hóa procaspase-3 đầu tiên - PAC-Ỉ. Các dẫn chắt khác.
Quinazolin và ứng dụng trong điều trị ung thu. Quinazolin và dẫn chất. Các phương pháp tông hợp khung quỉnazoỉin-4(3H)-on. Oncrasin-1 và hoạt tính kháng ung thu.
13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên vật liệu, thiết bị. Thiết bị, dụng cụ. Nội dung nghiên cứu.
Tổng hợp hóa học. Đảnh giả tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được. Phương pháp nghiên cứu. Đảnh giá hoạt tính sinh học.
THỤC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Tổng họp hóa học. Kiểm tra độ tinh khiết. Khẳng định cấu trúc.
Hoạt tính sinh học. Đảnh giả độc tính trên tê bào ung thư. Đảnh giá khả năng hoạt hóa caspase-3. Tồng hợp hóa học.
Khắng định cấu trúc. Hoạt tỉnh sinh học.41 KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ‘H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 5-FU 5-fluorouracil Ac-DEVD-/?NA Acetyl Asp-Glu-Val-Asp /7-nitroanilid Bcl-2 B-cell lymphoma 2 CARD Vùng tưong tác tập hợp caspase (Caspase recruitment domain) d Vạch đôi (doublet) DCM Diclomethan DED Vùng tương tác gây chết (Death effector domain) DMF VjV-d i methyl formam id DMSO Dimethyl sulfoxid EC50 Nồng độ hiệu quả 50% (The half maximal effective concentration) ESI Ion hóa phun mù điện tử (Electrospray ionization) EtOH Ethanol FAM-DEVD-fmk Chất phát huỳnh quang ức chế caspase-3 FasL Phối tử gây chết Fas (Fas ligand) FDA Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U. Food and Drug Aministratrion) h Giờ IC50 Nồng độ ức chế tối đa 50% (The half maximal inhibitory concentration) ICE Enzym chuyên hóa interleukin-1 p (Interleukin-1 p-converting enzyme) IPA Chất ức chế protein apoptosis (Inhibitors of protein apoptosis) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) J Hằng số tương tác KRIBB Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) m Đa vạch (multiplet) MCF-7 Te bào ung thư vú ở người MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NCI-H23 Ung thư phổi không tế bào nhở ở người NMDA 7V-methyl-Z)-aspartat receptor p53 Protein ức chế khối u PAC-1 Chất hoạt hóa procaspase-3 đầu tiên (Procaspase-activating compound 1) PARP Poly(ADP-ribose) polymerase PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate-buffered saline) PC3 Ưng thư biểu mô tuyến tiền liệt ở người PKCt Protein kinase C-I R/ Hệ số lưu giữ s Vạch đơn (Singlet) SRB Sulforhodamin B SW620 Ưng thư đại tràng ở người Tnc Nhiệt độ nóng chảy T29 Tế bào biểu mô buồng trứng người đã được bất tử T29Htl Tể bào T29 đột biến gen H-Ras T29Ktl Tế bào T29 đột biến gen K-Ras TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS Tetramethylsilan TNF Yeu tố hoại tử khối u (Tumor necrosis factor) TRAIL Phối tử kích hoạt apoptosis liên quan đến TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand) U937 Te bào ung thư hạch bạch huyết người V Dao động hóa trị Ô Độ dịch chuyển hóa học (ppm) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.
Hiệu suất toàn phần quả trình tổng họp các dẫn chất Va-f. Giả trị R/và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chắt Va-f. Kết quả phổ IR của các dẫn chất Va-f. Kết quả phổ MS của các dẫn chất Va-f.
Kết quả phổ dỉ-NMR của các dẫn chất Va-f. Kết quả phô l3C-NMR của các dẫn chắt Va-f. Kêt quả đảnh giá độc tính trên một sô dòng tê bào ung thư. Kêt quả đảnh giá khả năng hoạt hóa caspase-3 của dân chât Vc 33 DANH MỤC HINH VE Hình 1.
Quả trình apoptosis và hoại tử tế bào. Phân loại các caspase. Cấu trúc chung của caspase. Hai con đường hoạt hóa quảtrình apoptosis.
Sự phân cắt và tải sắp xếp các chuỗi protein trong quả trình hoạt hóa enzym caspase. cấu trúc của PAC-1. Cơ chế hoạt hóa procaspase-3 của PAC-1. Cấu trúc của S-PAC-1.
Cấu trúc của WF-210 và WF-208. Cấu trúc của quinazolin và các dẫn chắt quinazolinon. Một số thuốc điều trị ung thư có cấu trúc quinazolin đã được cấp phép bởi FDA. Câu trúc của oncrasin-1.
Phổ hồng ngoại của dẫn chắt Vb. Phổ khối lượng của dẫn chất Va. Các cấu dạng có thể có của dẫn chẫn Va-f. Các tương tác của cấu dạng syn-E và antỉ-E.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR của dẫn chất Va. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chắtVa. Quy trình tỏng hợp 2-ethoxy-4(3H)-quỉnazolỉnon theo Griess và cộng sự. Phản ứng Niementowski.
Quy trình tông họp dân chât quỉnazolin-4(3H)-on sử dụng tảc nhân Vilsmeỉer. Quy trình tổng họp Piriqualon. Quy trình tổng họp các dẫn chất Va-f. Phản ứng tổng họp chất trung gian lia.
Phản ứng tổng họp chất trung gian nia. Phản ứng tổng họp chất trung gian IVa. Phản ứng tổng họp dẫn chất Va. Quy trình tổng họp dẫn chất Vb.
Quy trình tổng họp dẫn chất Vc. Quy trình tổng họp dẫn chắt Vd. Quy trình tống hợp dẫn chắt Ve. Quy trình tống hợp dẫn chất Vf.
Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian Ha-f. Cơ chế đề xuất cho phản ứng tông họp chất trung gian HIa-f. Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa-f. Cơ chế đề xuất cho phản ứng tông hợp dẫn chắt Va-f.
36 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. Kết quả độc tính tế bào của các dẫn chất Va-f. Kết quả đánh giá khả năng hoạt hóa caspase-3 của dẫn chất Kí'4 3 ĐẶT VẤN ĐÈ ưng thư là một nhóm lớn các bệnh đặc trưng bởi sự phát triển nhanh chóng của các tế bào bất thường, có thể xâm lấn và di căn đến những cơ quan khác trong cơ thể. Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay ung thư vẫn là một trong số những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu với khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong trên toàn cầu trong năm 2020 [56].
Cùng với phòng ngừa và sàng lọc sớm thì việc tìm kiếm những tiến bộ trong điều trị được coi là chìa khóa giúp giảm bớt gánh nặng ung thư. Nếu được phát hiện kịp thời và áp dụng phương pháp điều trị họp lí, một số bệnh ung thư có thể được chừa khởi. Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ trị, hóa trị. Đặc biệt, dựa trên nhừng nghiên cứu về biến đổi đặc biệt xảy ra trên tế bào ung thư, các nhà khoa học đã phát triển phương pháp điều trị đích với nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống.
Điều trị đích hướng đến những gen và protein chuyên biệt liên quan đến quá trình tăng sinh và di căn của các tế bào ung thư [5]. Phương pháp này tác động chọn lọc lên tế bào ung thư, hạn chế tác dụng không mong muốn và nâng cao hiệu quả điều trị so với hóa trị liệu [30]. Điều trị đích phát huy tác dụng thông qua nhiều cơ chế, bao gồm ức chế tăng sinh, cảm ứng quá trình chết theo chương trình apoptosis, ức chế di căn và điều chỉnh chức năng miễn dịch [28]. Né tránh quá trình apoptosis là cơ chế kháng thuốc đà được quan sát thấy ở một số bệnh lý ung thư [19, 27], do đó nhiều đích liên quan đến quá trình này đà được nghiên cứu như p53 [61], Bcl-2 [64], TRAIL [66].
Sự ra đời của họp chất PAC-1 đã mở ra hướng tiếp cận mới về cách khởi động quá trình apoptosis, thông qua việc hoạt hóa enzym thực thi của quá trình apoptosis là caspase-3 [47]. Dựa trên những nghiên cứu về cấu trúc và tiềm năng của PAC-1 [43, 44], nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế, tổng họp, thử hoạt tính và công bố một số dẫn chất A-acylhydrazon tiềm năng mang khung quinazolin-4(3/7)-on hướng hoạt hóa enzym caspase-3 [24-26]. Tiếp cận theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thay đối họp phần phenolic trong cấu trúc pAC-1 bằng oncrasin-1 - dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư [16] và tiến hành đề tài “Tổng họp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất ÝV-acylhydrazon mói lai hóa oncrasin-1 hướng hoạt hóa enzym caspase” với hai mục tiêu: 1. Tổng họp được 6 dẫn chất (E)-N'-((l-(4-chlorobenzyl)-l//-indol-3- yl)methylen)-2-(4-oxoquinazolin-3(4/ộ-yl)acetohydrazid.
Đánh giá độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư và khả năng hoạt hóa caspase-3 của các dẫn chất tổng hợp được. Giới thiệu về enzym caspase Sự chết tế bào là quá trình cơ bản để duy trì cân bằng nội môi của các mô trong cơ thể thông qua việc loại bó các tế bào không cần thiết hoặc bị hu hỏng và tái sử dụng các thành phần nội bào cho quá trình hình thành tế bào mới [51]. Dựa vào sự khác nhau về hình thái, sự chết tế bào thường xảy ra theo hai con đường chính là hoại tử hoặc apoptosis. Hoại tử xảy ra do các tác nhân từ môi trường bên ngoài như độc tố, nhiễm trùng, tổn thương tế bào.
Quá trình hoại tử đặc trưng bởi hiện tượng trương phồng của bào tương và sau đó là nứt vỡ màng tế bào làm giải phóng các thành phần nội bào ra môi trường xung quanh. Các chất này đóng vai trò như tín hiệu hóa học, thu hút các tế bào viêm đến thực bào và do đó gây ra phản ứng viêm. Ngược lại, apoptosis là quá trình chết theo chương trình đã được thiết lập sẵn cho mồi tế bào. Trong chu trình apoptosis, tế bào co lại do sự cô đặc của tế bào chất và sự cuộn chặt của các bào quan trong khi màng tế bào vẫn còn nguyên vẹn.
Sau đó, tế bào phân mảnh thành các tiểu thể apoptotic và nhanh chóng được thực bào bởi các đại thực bào. Do không giải phóng các thành nội bào ra môi trường xung quanh, quá trình apoptosis không gây ra viêm [11, 48]. Hình thành Co ngót tế bào các tiểu thể apoptotic Trương phồng té bào Ph±9 các thành phân nội bào Hình 1. Quá trình apoptosis và hoại tử tế bào Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc mất điều hòa quá trình apoptosis đóng vai trò trung tâm trong việc hình thành và phát triển một số bệnh lý như ung thư, thiếu máu cục bộ, Alzheimer, Parkinson, AIDS.
Ung thư là ví dụ điên hình trong đó ức chế quá trình apoptosis làm tế bào tăng sinh một cách mất kiểm soát dẫn đến sự hình thành và di căn của khối u [29, 33]. Nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình apoptosis cho 2 thấy caspase - một họ enzym protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis theo cả con đường nội sinh và ngoại sinh [8, 15, 49, 51]. Caspase, viết tắt của cystein - aspartic protease, là một phân lóp cystein protease thuộc họ C14 trong phân loại của Barrett và Rawlings [4]. Sự phân cắt protein bởi caspase xảy ra đặc hiệu ở vị trí sau acid amin aspartic của cơ chất [58].