ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là một nhóm lớn các bệnh đặc trưng bởi sự phát triển nhanh chóng của các tế bào bất thường, có thể xâm lấn và di căn đến những cơ quan khác trong cơ thể. Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay ung thư vẫn là một trong số những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu với khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần 10 triệu ca tử vong trên toàn cầu trong năm 2020 [56]. Cùng với phòng ngừa và sàng lọc sớm thì việc tìm kiếm những tiến bộ trong điều trị được coi là chìa khóa giúp giảm bớt gánh nặng ung thư. Nếu được phát hiện kịp thời và áp dụng phương pháp điều trị hợp lí, một số bệnh ung thư có thể được chữa khỏi.
Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến hiện nay là phẫu thuật, xạ trị, hóa trị. Đặc biệt, dựa trên những nghiên cứu về biến đổi đặc biệt xảy ra trên tế bào ung thư, các nhà khoa học đã phát triển phương pháp điều trị đích với nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. Điều trị đích hướng đến những gen và protein chuyên biệt liên quan đến quá trình tăng sinh và di căn của các tế bào ung thư [5]. Phương pháp này tác động chọn lọc lên tế bào ung thư, hạn chế tác dụng không mong muốn và nâng cao hiệu quả điều trị so với hóa trị liệu [30].
Điều trị đích phát huy tác dụng thông qua nhiều cơ chế, bao gồm ức chế tăng sinh, cảm ứng quá trình chết theo chương trình apoptosis, ức chế di căn và điều chỉnh chức năng miễn dịch [28]. Né tránh quá trình apoptosis là cơ chế kháng thuốc đã được quan sát thấy ở một số bệnh lý ung thư [19, 27], do đó nhiều đích liên quan đến quá trình này đã được nghiên cứu như p53 [61], Bcl-2 [64], TRAIL [66]. Sự ra đời của hợp chất PAC-1 đã mở ra hướng tiếp cận mới về cách khởi động quá trình apoptosis, thông qua việc hoạt hóa enzym thực thi của quá trình apoptosis là caspase-3 [47]. Dựa trên những nghiên cứu về cấu trúc và tiềm năng của PAC-1 [43, 44], nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố một số dẫn chất N-acylhydrazon tiềm năng mang khung quinazolin-4(3H)-on hướng hoạt hóa enzym caspase-3 [24-26].
Tiếp cận theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thay đổi hợp phần phenolic trong cấu trúc PAC-1 bằng oncrasin-1 - dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư [16] và tiến hành đề tài “Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-acylhydrazon mới lai hóa oncrasin-1 hướng hoạt hóa enzym caspase” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp được 6 dẫn chất (E)-N'-((1-(4-chlorobenzyl)-1H-indol-3- yl)methylen)-2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid. Đánh giá độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư và khả năng hoạt hóa caspase-3 của các dẫn chất tổng hợp được. Giới thiệu về enzym caspase Sự chết tế bào là quá trình cơ bản để duy trì cân bằng nội môi của các mô trong cơ thể thông qua việc loại bỏ các tế bào không cần thiết hoặc bị hư hỏng và tái sử dụng các thành phần nội bào cho quá trình hình thành tế bào mới [51].
Dựa vào sự khác nhau về hình thái, sự chết tế bào thường xảy ra theo hai con đường chính là hoại tử hoặc apoptosis. Hoại tử xảy ra do các tác nhân từ môi trường bên ngoài như độc tố, nhiễm trùng, tổn thương tế bào. Quá trình hoại tử đặc trưng bởi hiện tượng trương phồng của bào tương và sau đó là nứt vỡ màng tế bào làm giải phóng các thành phần nội bào ra môi trường xung quanh. Các chất này đóng vai trò như tín hiệu hóa học, thu hút các tế bào viêm đến thực bào và do đó gây ra phản ứng viêm.
Ngược lại, apoptosis là quá trình chết theo chương trình đã được thiết lập sẵn cho mỗi tế bào. Trong chu trình apoptosis, tế bào co lại do sự cô đặc của tế bào chất và sự cuộn chặt của các bào quan trong khi màng tế bào vẫn còn nguyên vẹn. Sau đó, tế bào phân mảnh thành các tiểu thể apoptotic và nhanh chóng được thực bào bởi các đại thực bào. Do không giải phóng các thành nội bào ra môi trường xung quanh, quá trình apoptosis không gây ra viêm [11, 48].
Quá trình apoptosis và hoại tử tế bào Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc mất điều hòa quá trình apoptosis đóng vai trò trung tâm trong việc hình thành và phát triển một số bệnh lý như ung thư, thiếu máu cục bộ, Alzheimer, Parkinson, AIDS. Ung thư là ví dụ điển hình trong đó ức chế quá trình apoptosis làm tế bào tăng sinh một cách mất kiểm soát dẫn đến sự hình thành và di căn của khối u [29, 33]. Nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình apoptosis cho 2 thấy caspase - một họ enzym protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis theo cả con đường nội sinh và ngoại sinh [8, 15, 49, 51]. Caspase, viết tắt của cystein - aspartic protease, là một phân lớp cystein protease thuộc họ C14 trong phân loại của Barrett và Rawlings [4].
Sự phân cắt protein bởi caspase xảy ra đặc hiệu ở vị trí sau acid amin aspartic của cơ chất [58]. Năm 1993, Yuan và cộng sự phát hiện ra gen ced-3 cần thiết cho sự chết tế bào theo chương trình ở loài giun tròn C.elegans mã hóa một protein có các đặc tính tương tự với enzym chuyển hóa interleukin-1β (ICE) ở người [68]. Nghiên cứu của Miura và cộng sự sau đó cũng chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của ICE ở chuột gây ra quá trình apoptosis [37]. Các chất có vai trò tương tự sau đó lần lượt được tìm ra.
Năm 1996, các nhà khoa học đã thống nhất đặt tên các enzym này là caspase và đánh số theo thứ tự phát hiện, bắt đầu với ICE là caspase-1 [2]. Phân loại các enzym caspase Đến thời điểm hiện tại, người ta đã tìm ra 18 caspase [51]. Hầu hết các enzym caspase đều xuất hiện ở động vật có vú có rau thai (placental mammals), ngoại trừ caspase-15, 17, 18. Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng caspase-11, 13 ở chuột và bò tương đồng với caspase-4 đã được tìm thấy ở người [8, 9].
Phân loại các caspase 3 Các caspase có thể được phân loại dựa trên một số đặc tính khác nhau như chức năng, độ dài vùng tương tác, tính đặc hiệu cơ chất. Các phương pháp này đều cho kết quả phân loại khá tương đồng, điều đó cho thấy mối liên quan cấu trúc - chức năng khá chặt chẽ giữa các caspase. Dựa vào chức năng, các enzym này được chia thành 2 nhóm chính [51]: - Nhóm 1 gồm caspase-1, 4, 5, 11, 12 chủ yếu tham gia vào quá trình viêm. - Nhóm 2 gồm các enzym còn lại, chủ yếu tham gia vào quá trình apoptosis.
Các caspase nhóm 2 tiếp tục được chia thành hai nhóm nhỏ: + Caspase-2, 9, 8, 10 là các caspase khơi mào. + Caspase-3, 6, 7 là các caspase thực thi. Mặc dù thường được biết đến với vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis và quá trình viêm, một số caspase còn thể hiện vai trò khác. Caspase-14 chỉ được quan sát thấy ở lớp biểu bì của động vật có vú sống trên cạn, tham gia vào quá trình biệt hóa tế bào sừng ở giai đoạn cuối và giúp bảo vệ chuột dưới tác động của tia UVB [36].
Đột biến mất gen mã hóa caspase-14 ở chuột làm ức chế quá trình phân giải filaggrin - protein cung cấp các yếu tố giữ ẩm tự nhiên cho da [21]. Cấu trúc chung của các caspase Các caspase ban đầu được tạo ra ở dạng tiền enzym (zymogen) gồm một vùng tương tác, tiểu đơn vị lớn 17-20 kDa và tiểu đơn vị nhỏ 10-12 kDa [8, 57]. Vùng tương tác ở các caspase khơi mào hoặc caspase tham gia quá trình viêm là một chuỗi dài chứa vùng tương tác protein - protein CARD (caspase recruitment domain) hoặc DED (death effector domain). Ở các caspase thực thi, vùng tương tác chỉ là một chuỗi ngắn.
Cấu trúc chung của caspase Chú thích: A: Phân bố của các vòng lặp (L1-L4) trong cấu trúc của enzym caspase. Các vòng lặp được biểu thị bằng màu xanh lam. Dấu hoa thị màu đỏ đánh dấu vị trí của Cys. B: Tương tác giữa vị trí S1 với acid amin Asp trên cơ chất.
Ở trạng thái hoạt động, enzym caspase tồn tại ở dạng dimer với monomer gồm một tiểu đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ [46]. Mỗi enzym có hai trung tâm hoạt động nằm trên hai monomer ở hai phía đối diện nhau, riêng caspase-9 chỉ có một trung tâm 4 hoạt động [8]. Trung tâm hoạt động của caspase có bốn vị trí liên kết S1, S2, S3, S4 được tạo thành từ các vòng lặp L1, L2, L3, L4 [8]. L1 và một phần của L2 thuộc tiểu đơn vị lớn (hình 1.2), chứa acid amin Cys đóng vai trò như một tác nhân ái nhân trong quá trình thủy phân liên kết peptid [58].
Nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến ở acid amin này làm mất hoạt tính của caspase-3 [43]. S1 được tạo thành từ các vòng lặp L1, L2, L3 chứa các acid amin Arg-179, Arg-341 và Gln-283 (đánh số theo caspase-1) tạo thành một túi hẹp, sâu. Hình dạng này chính là yếu tố quyết định, tạo nên tính đặc hiệu của enzym caspase bởi vì nó chỉ phù hợp với acid amin Asp ở vị trí P1 trên cơ chất. Cơ chế hoạt hóa enzym caspase trong quá trình apoptosis Mặc dù đều tham gia vào quá trình apoptosis nhưng các caspase nhóm 2 được hoạt hóa theo các cơ chế khác nhau.
Các caspase khơi mào được hoạt hóa thông qua quá trình dimer hóa. Khi xuất hiện các tín hiệu chết nội bào (stress, gốc tự do oxy hóa.) hoặc tín hiệu chết ngoại bào (TNF, TRAIL, FasL) thông qua receptor tương ứng, quá trình apoptosis sẽ được khởi động theo con đường bên trong hoặc con đường bên ngoài như mô tả trong hình 1. Hai con đường hoạt hóa quá trình apoptosis Caspase khơi mào phổ biến ở người là caspase-8 (con đường ngoại sinh) và caspase-9 (con đường nội sinh). Tín hiệu apoptotic gây ra quá trình tập hợp các caspase thông qua vùng tương tác DED ở caspase-8 và CARD ở caspase-9 [11, 46].
Sự gia tăng cục bộ nồng độ caspase làm thu hẹp khoảng cách giữa các enzym, cảm ứng quá trình dimer hóa (proximity - induced dimarization) và hoạt hóa các enzym này [11, 46]. Sau 5 khi được hoạt hóa, các caspase khơi mào sẽ hoạt hóa các caspase thực thi bằng cách phân cắt chúng thành các tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ, tạo thuận lợi cho việc sắp xếp lại các chuỗi protein để hình thành trung tâm hoạt động (hình 1.