CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1. Khái niệm tinh trùng. Tinh trùng là tế bào đảm nhận chức năng sinh sản ở nam giới, mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội, 23 nhiễm sắc thể. Mỗi tinh trùng có kích thước 65 - 70 µm.
Tinh trùng gồm ba phần: đầu, cổ và đuôi. Tinh trùng được biệt hóa cao độ để thực hiện chức năng sinh sản là di chuyển trong đường sinh dục nữ, nhận biết trứng và thụ tinh cho trứng [8]. Bình thường tinh trùng được sinh ra từ các ống sinh tinh trong tinh hoàn, và trải qua nhiều giai đoạn để có thể trưởng thành, hoàn thiện về cấu trúc và các chức năng để có thể thụ tinh [9]. Cấu tạo tinh trùng.
Tinh trùng trưởng thành dài khoảng 50 - 60 μm, có 3 phần: đầu, cổ và đuôi [8]. Phần đầu tinh trùng: Phần đầu của tinh trùng có hình dạng như giọt nước dẹt, bên trong chứa nhân mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội (1n), 23 nhiễm sắc thể trong đó có 1 nhiễm sắc thể giới tính (X hoặc Y). Mỗi tinh trùng có một bộ gen riêng biệt. Phía trên nhân có túi cực hình đầu mũ, chứa các enzyme có tác dụng tiêu hủy các chướng ngại vật xung quanh trứng và lớp màng ngoài của trứng, giúp tinh trùng xâm nhập vào bên trong để thụ tinh với trứng [10].
Phần cổ tinh trùng: Đây là phần nằm giữa đầu và đuôi. Cổ tinh trùng rất mềm mại, làm cho đầu tinh trùng dễ dàng quay từ bên này sang bên kia như động tác bơi [11]. Phần đuôi tinh trùng: Đuôi tinh trùng được chia thành 3 đoạn là đoạn giữa, đoạn chính và đoạn cuối. Đoạn giữa là phần to nhất của đuôi chứa các ty thể, chúng sử dụng glucose và fructose để tạo thành năng lượng cho tinh trùng di chuyển.
Ở đoạn cuối, những sợi đặc và bao đuôi mỏng dần, chỉ còn là một lớp tế bào mỏng bao bọc phần cuối của đuôi. Đuôi mỏng và thon dần giúp tinh trùng có thể quẫy đuôi và bơi một cách thuận lợi [8, 9]. Cấu tạo tinh trùng [12] 1. Quá trình hình thành tinh trùng.
Tinh trùng được sản xuất ở tinh hoàn, trong các ống nhỏ cuộn chặt gọi là ống sinh tinh. Tổng chiều dài của các ống này lên tới 250m. Nằm giữa các ống sinh tinh là tế bào Leydig có chức năng sản xuất hormone sinh dục nam testosterone [13]. Quá trình sinh tinh bắt đầu từ các tế bào gốc, gọi là tinh nguyên bào.
Khi nam giới bước vào tuổi dậy thì, các tinh nguyên bào sẽ bắt đầu phân chia nhiều lần và biệt hóa để tạo ra các tinh bào [11]. Tinh trùng được sinh ra từ các tinh bào trong ống sinh tinh, sau đó di chuyển vào mào tinh để trải qua giai đoạn trưởng thành trước khi xuất tinh [14]. Khi người đàn ông bị kích thích tình dục, quá trình xuất tinh sẽ bắt đầu. Từ mào tinh hoàn, tinh trùng phóng theo ống dẫn tinh, sau đó được trộn lẫn với dịch tiết của tuyến tiền liệt (chiếm 30%), túi tinh (chiếm 60%), các tuyến hành niệu đạo (chiếm 10%), và cuối cùng được tống xuất ra ngoài theo đường niệu đạo.
Nếu xuất tinh không xảy ra, tinh trùng sẽ chết và được hấp thụ bởi biểu mô của mào tinh. 4 Quá trình sinh tinh bắt đầu từ khi dậy thì và tiếp diễn liên tục cho tới khi chết. Đây là một quá trình rất hiệu quả với vài chục đến vài trăm triệu tinh trùng được sinh ra ở mỗi tinh hoàn. Tuy nhiên thụ tinh lại là quá trình không hiệu quả, khi hàng chục, hàng trăm tinh trùng được phóng vào đường sinh dục nữ nhưng cuối cùng chỉ có 1 tinh trùng là thụ tinh thực sự với trứng.
Do vậy, nguy cơ vô sinh nam sẽ tăng cao nếu quá trình sinh tinh bị suy giảm kéo theo sự suy giảm về chất và lượng của tinh trùng [4]. Toàn bộ quá trình phát triển từ tinh nguyên bào thành tinh trùng là khoảng 70 ngày. Sau đó, tinh trùng phải trải qua thêm 12-21 ngày ở mào tinh hoàn để trưởng thành về mặt chức năng. Như vậy, tổng thời gian cho một quá trình sinh tinh hoàn thiện là từ 10-12 tuần [14].
Mỗi ngày có tới vài trăm triệu tinh trùng được sinh ra từ mỗi tinh hoàn. Khi bị đẩy ra khỏi dương vật qua niệu đạo (xuất tinh), con số tinh trùng trong tinh dịch có thể lên tới 500 triệu [15]. Quá trình hình thành tinh trùng [12]. Phân mảnh ADN tinh trùng.
Định nghĩa phân mảnh ADN tinh trùng. Phân mảnh ADN tinh trùng là tình trạng tổn thương cấu trúc di truyền của tinh trùng, cụ thể là sự phân mảnh bên trong ADN [16]. Sự phân mảnh có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới cũng như kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm. ADN tinh trùng có thể bị phân mảnh trong suốt quá trình sản sinh tinh trùng, khi tiếp xúc với môi trường độc hại hoặc thực hiện xạ trị hay hoá trị liệu.
Có khoảng 30% nam giới vô sinh có các chỉ số tinh dịch bình thường nhưng chỉ số phân mảnh ADN tinh trùng vượt ngưỡng [4]. Lịch sử nghiên cứu phân mảnh ADN tinh trùng. Năm 1946, Pollister và Mirsky đã phát hiện ra phần lớn các protein bao quanh ADN trong tinh trùng không phải histones mà là các protamine. Sau đó các nhà khoa học ước tính chỉ có 5 - 15% protein của chất nhiễm sắc trong tinh trùng là histones, còn lại là các protamine [17].
Năm 1953, Leuchtenberger đã phát hiện ra rằng chất lượng của một mẫu tinh trùng không chỉ là vấn đề về số lượng và khả năng vận động của tinh trùng, và có sự khác biệt giữa chất lượng ADN tinh trùng của nam giới vô sinh và nam giới bình thường về khả năng sinh sản [18]. Sự quan tâm ngày càng tăng về mối liên hệ có thể có giữa phơi nhiễm các tác nhân gây tổn hại ADN và giảm khả năng sinh sản. Năm 1970, Ringertz và cộng sự đã thực hiện một xét nghiệm trong đó tinh trùng bò bị đốt nóng và sự tổn thương ADN tinh trùng sau đó được phát hiện khi nhuộm màu cam acridine. Ringertz cũng nhận ra rằng các tinh trùng có sự ổn định về ADN tăng dần trong quá trình trưởng thành [19].
Năm 1980, Evenson và cộng sự với sự sử dụng công nghệ sinh học phân tử đã phát triển một xét nghiệm tế bào học dòng chảy để phát hiện sự phân mảnh ADN trong tinh trùng, gọi là phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng (Sperm Chromatin Structure Assay - SCSA) [20]. Sau đó, trong nhiều thập kỷ, hàng loạt các phương pháp giúp phát hiện sự phân mảnh ADN tinh trùng ra đời như COMET (1980), TUNEL (1990), DBD - FISH (2000) hay SCD (2003) chứng tỏ tầm quan trọng cũng như sự quan tâm của giới khoa học cho vấn đề phân mảnh ADN tinh trùng nói chung và sức khỏe sinh sản nói riêng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp mới xác định phân mảnh ADN tinh trùng vẫn đang được nghiên cứu và phát triển [21]. 6 Song song với việc xây dựng các phương pháp xác định phân mảnh ADN tinh trùng, các nghiên cứu về nguyên nhân phân mảnh ADN tinh trùng, mối liên hệ giữa phân mảnh ADN tinh trùng và sức khỏe sinh sản, lựa chọn các phương pháp hỗ trợ sinh sản phù hợp với cặp vợ chồng khi người chồng có tỷ lệ phân mảnh ADN tinh trùng cao cũng được tiến hành và cho nhiều kết quả khả quan [21].
Cấu trúc ADN tinh trùng. Tinh trùng người là một đơn vị có tổ chức cao, NST tinh trùng được đóng gói rất chặt chẽ, kích thước nhỏ chỉ bằng 1/6 kích thước NST ở tế bào sinh dưỡng và trơ về mặt hóa học để bảo toàn cấu trúc cũng như chức năng trong suốt quá trình tạo tinh trùng trưởng thành và di chuyển trong cơ quan sinh dục nam và nữ. NST của tinh trùng được cấu tạo bởi 3 vùng cấu trúc: (1) phần lớn ADN tinh trùng xoắn cuộn và liên kết với protamine tạo thành cấu trúc toroid, mỗi toroid chứa khoảng 50kb ADN; (2) một phần nhỏ ADN liên kết với histone tạo cấu trúc lỏng lẻo hơn, (3) phần ADN còn lại liên kết với chất nền nhân tinh trùng [22]. Liên kết giữa protamine với ADN – cấu trúc toroid Điểm khác biệt lớn giữa đóng gói cấu trúc NST nhân tế bào sinh dưỡng và tinh trùng chính là các phân tử protamine chỉ hiện diện trong nhân tế bào tinh trùng.
Giai đoạn chuyển đổi từ các histone thành protamine đóng vai trò quan trọng trong quá trình trưởng thành của tinh trùng, ở nhân tế bào tinh trùng có khoảng 85% histone chuyển thành protamine. Trong suốt quá trình trưởng thành của tinh trùng, hầu hết protein histone liên kết với ADN được thay thế bởi protamine. Protamine chứa gốc arginine mang điện tích dương sẽ trung hòa điện tích âm của gốc phosphate trên ADN. Liên kết ion sẽ làm giảm lực đẩy khung ADN, tăng cường lực liên kết giữa ADN và protamine, cho phép NST tinh trùng tăng gấp đôi sự gấp cuộn, xoắn cực đến cực đại, hình thành cấu trúc toroid, giúp ADN tinh trùng thoát khỏi tác động của enzyme nuclease.
Tất cả sự sắp xếp này sẽ tạo ra một phức hợp trung tính, không bị hòa tan, và không dễ bị tổn thương [23]. Sự xoắn cuộn ADN được xem như một cơ chế kiểm soát sự biểu hiện của gene. Quá trình xoắn cuộn sẽ ngăn sự phiên mã, làm cho các gene không biểu hiện suốt quá trình sinh tinh. Chỉ khi tinh trùng xâm nhập vào noãn, protamine được thay thế hoàn toàn bởi cấu trúc protamine toroid sẽ giúp bảo vệ ADN của tinh trùng khi di chuyển trong đường sinh dục nữ để thụ tinh thành công mà không đóng vai trò trong sự phát triển của phôi [21].
Liên kết giữa histone với ADN 7 Dạng cấu trúc ADN phổ biến thứ hai là ADN gắn với histone. Khoảng 4% ADN trong tinh trùng trưởng thành liên kết với histone. Các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng các trình tự ADN liên kết với histone còn lại trong nhân tinh trùng trưởng thành bảo gồm các vùng gene khởi động phiên mã, trình tự ADN vùng talomere, gene mã hóa cho chuỗi epsilon và gamma globin, các chùm gene phiên mã micro RNA và đặc biệt các gene điều hòa biểu hiện dịch mã cho các protein quan trọng trong giai đoạn phát triển sớm của phôi [24]. Toàn bộ các vùng gene đặc trưng cho quá trình sinh tinh và thụ tinh cũng được xác định là liên kết với histone trong NST của tinh trùng; những vùng gene này dễ bị ảnh hưởng bởi hoạt động của của enzyme nuclease [25].