Luận văn thạc sĩ hus đánh giá độc tính của sodium benzoate propyl gallate tartrazine amaranth monosodium glutamate và formaldehyde trên mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn

Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl gallate, tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô hình cá ngựa vằn.

• Tác giả: Vũ Anh Tiến
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Lai Thành
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl gallate, tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT
• 1.1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm
• 1.2. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu
• 1.2.1. Chất bảo quản - Sodium benzoate
• 1.2.2. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate
• 1.2.3. Chất tạo màu vàng - Tartrazine
• 1.2.4. Chất tạo màu đỏ - Amaranth
• 1.2.5. Chất điều vị - Monosodium glutamate
• 1.2.6. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng - Formaldehyde
• 1.3. Các mô hình đánh giá độc tính hóa chất
• 1.3.1. Sử dụng động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất
• 1.3.2. Mô hình thay thế động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất
• 1.3.3. Mô hình đánh giá độc tính sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro
• 1.3.4. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong đánh giá độc tính
• 1.4. Phương pháp nghiên cứu
• 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.2. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị
• 1.4.3. Quy trình thí nghiệm
• 1.4.3.1. Quy trình nuôi cá bố mẹ và thu phôi
• 1.4.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất
• 1.4.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi dựa trên hình thái và sức sống
• 1.4.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa vằn
• 1.4.3.5. Phân tích thống kê
• 2. CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Sự biến đổi hình thái và sức sống của phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với các chất phụ gia
• 2.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng
• 2.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu
• 2.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)
• 2.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123)
• 2.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản
• 2.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211)
• 2.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310)
• 2.1.4. Nhóm chất điều vị - Monosodium glutamate (E621)
• 2.1.5. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng – Formaldehyde (E240)
• 2.1.6. Sự ảnh hưởng của hóa chất đến tỷ lệ phôi nở
• 2.2. Sự ảnh hưởng của các hóa chất thử nghiệm đến nhịp tim phôi cá ngựa vằn
• 2.3. Độc tính của các chất phụ gia trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đánh giá độc tính của hóa chất thực phẩm

Đánh giá độc tính của các hóa chất thực phẩm là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng nhằm bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Các hóa chất này, bao gồm sodium benzoate, propyl gallate, tartrazine, amaranth, monosodium glutamate, và formaldehyde, thường được sử dụng trong chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng cũng tiềm ẩn nhiều rủi ro về độc tính. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc đánh giá độc tính của các hóa chất này trên mô hình phôi cá ngựa vằn.

1.1. Định nghĩa và vai trò của hóa chất thực phẩm

Hóa chất thực phẩm là các chất được thêm vào thực phẩm nhằm cải thiện hương vị, màu sắc và thời gian bảo quản. Chúng có thể được chia thành nhiều loại, trong đó có các chất bảo quản và chất tạo màu. Việc hiểu rõ về vai trò của chúng là cần thiết để đánh giá đúng mức độ an toàn.

1.2. Tại sao cần đánh giá độc tính hóa chất thực phẩm

Việc đánh giá độc tính là cần thiết để phát hiện các tác động tiêu cực có thể xảy ra đối với sức khỏe con người. Nhiều hóa chất có thể gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng nếu không được kiểm soát chặt chẽ. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số hóa chất có thể gây ra dị tật bẩm sinh hoặc các vấn đề về thần kinh.

II. Thách thức trong việc đánh giá độc tính hóa chất thực phẩm

Mặc dù có nhiều phương pháp để đánh giá độc tính, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc áp dụng chúng. Số lượng hóa chất ngày càng tăng và sự phức tạp trong tương tác giữa các hóa chất khiến cho việc đánh giá trở nên khó khăn hơn. Hơn nữa, các mô hình thử nghiệm hiện tại chưa thể phản ánh đầy đủ tác động của hóa chất lên cơ thể con người.

2.1. Sự gia tăng số lượng hóa chất

Theo thống kê, số lượng hóa chất được sử dụng trong thực phẩm ngày càng tăng, dẫn đến việc cần thiết phải có các phương pháp đánh giá độc tính hiệu quả hơn. Nhiều hóa chất mới chưa được nghiên cứu đầy đủ về độc tính.

2.2. Khó khăn trong việc dự đoán tác động

Việc dự đoán tác động của hóa chất lên sức khỏe con người gặp nhiều khó khăn do sự khác biệt về di truyền và sinh lý giữa các loài. Các mô hình thử nghiệm hiện tại chưa thể cung cấp thông tin đầy đủ về tác động của hóa chất.

III. Phương pháp nghiên cứu đánh giá độc tính hóa chất thực phẩm

Nghiên cứu này sử dụng mô hình phôi cá ngựa vằn để đánh giá độc tính của các hóa chất thực phẩm. Mô hình này cho phép quan sát sự phát triển của phôi và các tác động của hóa chất một cách trực tiếp. Các phương pháp thí nghiệm sẽ được thực hiện để đánh giá sự ảnh hưởng của các hóa chất đến hình thái và chức năng của phôi.

3.1. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong nghiên cứu

Phôi cá ngựa vằn là một mô hình lý tưởng cho nghiên cứu độc tính do sự phát triển nhanh chóng và tính trong suốt của chúng. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu quan sát được sự ảnh hưởng của hóa chất trong suốt quá trình phát triển.

3.2. Quy trình thí nghiệm đánh giá độc tính

Quy trình thí nghiệm bao gồm việc nuôi cá bố mẹ, thu phôi, và phơi nhiễm với các hóa chất. Sau đó, các chỉ số như tỷ lệ phôi nở và nhịp tim sẽ được đánh giá để xác định mức độ độc tính.

IV. Kết quả nghiên cứu về độc tính của hóa chất thực phẩm

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các hóa chất như sodium benzoate và formaldehyde có tác động tiêu cực đến sự phát triển của phôi cá ngựa vằn. Các chỉ số như tỷ lệ phôi nở và nhịp tim đều bị ảnh hưởng đáng kể khi phơi nhiễm với các hóa chất này. Những phát hiện này cung cấp thông tin quan trọng về độc tính của các hóa chất thực phẩm.

4.1. Tác động của sodium benzoate đến phôi cá ngựa vằn

Nghiên cứu cho thấy sodium benzoate có thể gây ra sự giảm tỷ lệ phôi nở và làm tăng tỷ lệ dị dạng ở phôi cá ngựa vằn. Điều này cho thấy rằng hóa chất này có thể gây độc cho sự phát triển của phôi.

4.2. Ảnh hưởng của formaldehyde đến sự phát triển phôi

Formaldehyde, một chất đã bị cấm sử dụng, cho thấy tác động nghiêm trọng đến sự phát triển của phôi cá ngựa vằn. Nghiên cứu chỉ ra rằng phơi nhiễm với formaldehyde dẫn đến tỷ lệ phôi sống thấp và nhiều dị dạng.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng việc đánh giá độc tính của các hóa chất thực phẩm là rất cần thiết. Các kết quả thu được từ mô hình phôi cá ngựa vằn không chỉ cung cấp thông tin về độc tính của các hóa chất mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu trong tương lai. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định mức độ an toàn của các hóa chất này trong thực phẩm.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu độc tính

Nghiên cứu độc tính giúp bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Việc hiểu rõ về tác động của hóa chất thực phẩm là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm.

5.2. Hướng đi cho nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp đánh giá độc tính hiệu quả hơn. Việc áp dụng các mô hình mới và công nghệ tiên tiến sẽ giúp cải thiện khả năng dự đoán tác động của hóa chất lên sức khỏe con người.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sự bùng nổ của ngành công nghiệp hóa chất toàn cầu đã ghi nhận mức tăng trưởng sản lượng từ 1 triệu tấn vào năm 1930 lên hơn 400 triệu tấn vào năm 2001. Riêng tại thị trường Liên minh Châu Âu, khoảng 143.000 hợp chất hóa học đã được đăng ký, trong đó có từ 30.000 đến 70.000 chất được sử dụng thường nhật. Trong lĩnh vực thực phẩm, hơn 2.500 loại phụ gia khác nhau đang được lưu hành thương mại, phục vụ mục đích bảo quản, tạo màu và điều vị. Theo ước tính dịch tễ học, trung bình mỗi người tiêu thụ khoảng 2,27 kg phụ gia thực phẩm nguyên chất mỗi năm (chưa tính khoảng 63 kg gia vị truyền thống như muối, đường, tiêu).

Tuy nhiên, việc kiểm soát an toàn độc học đối với các hợp chất này đang đối mặt với những thách thức nghiêm trọng. Nhiều phụ gia được cấp phép lịch sử chưa trải qua các quy trình sàng lọc độc tính phát triển toàn diện, tiềm ẩn nguy cơ gây độc thần kinh, rối loạn chuyển hóa hoặc dị tật bẩm sinh. Mô hình thử nghiệm trên động vật có vú truyền thống gặp rào cản lớn về chi phí và đạo đức sinh học theo Chỉ thị 2010/63/EU, trong khi thử nghiệm tế bào in vitro lại thiếu tính tương tác toàn diện của một cơ thể sống.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm của tác giả Vũ Anh Tuấn, thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, tập trung giải quyết bài toán cấp thiết này. Đề tài hướng đến mục tiêu đánh giá toàn diện độc tính cấp tính, khả năng gây quái thai và biến đổi chức năng tim của 5 loại phụ gia thực phẩm phổ biến (Sodium benzoate - E211, Propyl gallate - E310, Tartrazine - E102, Amaranth - E123, Monosodium glutamate - E621) cùng 1 chất cấm độc hại (Formaldehyde - E240). Nghiên cứu sử dụng mô hình phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) nhằm xác lập hệ thống chỉ số định lượng độc học (LC50, EC50, TI, NOEC, LOEC), đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ công tác quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai khung lý thuyết và quy chuẩn thực nghiệm quốc tế nền tảng:

• Nguyên lý Độc học Phát triển trên Phôi cá ngựa vằn (Zebrafish Embryo Toxicity - FET): Tuân thủ Hướng dẫn OECD 236 (năm 2013) và Tiêu chuẩn ISO 15088:2007. Phôi cá ngựa vằn giai đoạn 4 đến 5 ngày tuổi sở hữu trên 70% gen tương đồng với con người và hơn 12.000 gen hoạt động tương đương, cho phép dự đoán chính xác tới 80% độc tính lâu dài trên động vật có xương sống bậc cao mà không vi phạm quy định pháp lý về động vật thí nghiệm.
• Khung phân tích Độc chất học Định lượng và Động học Phơi nhiễm: Ứng dụng mô hình toán học đường cong đáp ứng liều lượng phi tuyến tính để xác định các chỉ số ngưỡng độc học:
  • LC50 (Median Lethal Concentration): Nồng độ gây chết 50% phôi thí nghiệm.
  • EC50 (Median Effective Concentration): Nồng độ gây dị dạng 50% số phôi sống sót.
  • Chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic Index): Tỷ lệ LC50/EC50. Một chất được xác định có khả năng gây quái thai đặc hiệu khi TI > 1 và gây chết phôi chiếm ưu thế khi TI < 1.
  • Hiệu ứng liều thấp (Low-dose effect): Hiện tượng đáp ứng sinh học phi đơn điệu, trong đó nồng độ thử nghiệm thấp có thể kích hoạt các tổn thương mô học nghiêm trọng hơn nồng độ cao do tương tác thụ thể đặc thù.

Phương pháp nghiên cứu

• Cỡ mẫu và quy trình chọn mẫu: Cá ngựa vằn bố mẹ (Danio rerio, kích thước 3-5 cm) được thuần hóa qua 2 đến 3 thế hệ tại phòng thí nghiệm dưới chu kỳ sáng/tối 14/10 giờ và nhiệt độ ổn định 26 ± 1 °C. Phôi thu thập từ ít nhất 3 cặp ghép độc lập, chỉ các mẻ phôi đạt tỷ lệ thụ tinh trên 90% mới được đưa vào thử nghiệm. Ở giai đoạn phân cắt 4 đến 32 tế bào (dưới 3 giờ sau thụ tinh - hpf), các phôi khỏe mạnh, đối xứng và màng nguyên vẹn được chọn lọc ngẫu nhiên.
• Bố trí thí nghiệm phơi nhiễm: Thực hiện trên đĩa nuôi cấy 24 giếng. Mỗi nồng độ hóa chất được tra vào 20 giếng độc lập (1 phôi/giếng chứa 1 ml dung dịch), kèm theo 4 giếng đối chứng nội chứa môi trường nuôi E3 tiêu chuẩn. Dải nồng độ gồm 6 đến 8 mức được thiết lập qua thử nghiệm giới hạn (limit test). Thao tác thay mới 700 µl dung dịch mỗi giếng được tiến hành định kỳ sau mỗi 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại độc lập 3 lần (tổng số hơn 720 phôi cho mỗi chất thử).
• Phương pháp quan sát và phân tích: Đánh giá hình thái, sức sống và tỷ lệ dị dạng tại 4 mốc thời gian: 24, 48, 72 và 96 hpf dưới kính hiển vi soi nổi quang học theo thang phân loại Kimmel và Nagel. Hoạt động chức năng tim được ghi hình video 1 phút trên đĩa 6 giếng (10 phôi/giếng) và đếm nhịp tim tự động. Dữ liệu số học được xử lý hồi quy phi tuyến tính dạng 4 tham số Sigmoidal, kiểm định sai khác bằng Mann-Whitney test và Dunnett's test với độ tin cậy 95% trên phần mềm GraphPad Prism 6.07.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Nhóm phẩm màu azo nhân tạo (Tartrazine E102 và Amaranth E123): Do tính chất ưa mỡ (lipophilicity), cả hai chất thấm qua màng phôi cực nhanh. Tartrazine ở nồng độ từ 8 g/l trở lên gây tan rã đĩa phôi chỉ sau 2 giờ phơi nhiễm; tại mốc 24 hpf, nồng độ 8 g/l gây chết 10% và 16 g/l gây chết 90% phôi. Đáng chú ý, Tartrazine biểu hiện rõ hiệu ứng liều thấp tại 96 hpf: nồng độ 1-2 g/l gây dị dạng nặng nề (phù noãn hoàng, hoại tử, cong vẹo trục thân) với tỷ lệ dị tật đạt tới 93%, cao hơn đáng kể so với mức 72% ở nồng độ 12 g/l. Amaranth thể hiện độc tính cao hơn ở nồng độ thấp: nồng độ 4 g/l làm chết 55% phôi tại 24 hpf và tăng lên 93% tại 96 hpf; nồng độ 0,5 g/l và 1 g/l làm chết lần lượt 31,7% và 60,1% ấu thể ở 96 hpf.
• Nhóm chất bảo quản (Sodium benzoate E211 và Formaldehyde E240): Sodium benzoate trong dải thử nghiệm 25 đến 650 mg/l không gây chết phôi ở 24-48 hpf, nhưng kích hoạt hoại tử noãn hoàng từ nồng độ 45 mg/l trên 16,7% cá thể tại 96 hpf. Nồng độ 350 mg/l làm chết 10% cá thể ở 72 hpf, và nồng độ 650 mg/l tiêu diệt 77% cá thể (tỷ lệ sống chỉ còn 23%). Ngược lại, Formaldehyde (chất bảo quản bị cấm) thể hiện độc tính cấp tính cực mạnh ở dải nồng độ phần triệu (140 đến 420 ppm), gây đông tụ phôi hàng loạt và ngừng tim hoàn toàn.
• Nhóm chất chống oxy hóa (Propyl gallate E310) và điều vị (Monosodium glutamate E621): Propyl gallate gây độc cấp tính cho ấu thể thủy sinh ở dải nồng độ thấp 15 đến 75 mg/l, gây biến dạng màng bao tim và ức chế nhịp đập. Monosodium glutamate an toàn hơn ở dải nồng độ thấp nhưng bắt đầu gây chậm phát triển và rối loạn nhịp tim khi vượt ngưỡng 15-25 g/l.
• Tác động bệnh lý mạch máu và chức năng tim: Dị tật tụ máu (hemorrhage) xuất hiện phổ biến nhất ở nhóm phôi phơi nhiễm Tartrazine và Sodium benzoate, tập trung quanh túi noãn hoàng, gốc vây và khoang sọ, kèm theo hiện tượng nhịp tim giảm từ 15% đến 40% so với lô đối chứng (p < 0,05).

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu độc học trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua các đường cong chuẩn độ đáp ứng liều lượng dạng chữ S (Sigmoidal S-curves), biểu diễn mối tương quan giữa logarit nồng độ hóa chất và tỷ lệ phôi sống/dị dạng. Biểu đồ phân bố bệnh lý chỉ ra rằng hiện tượng phù túi noãn hoàng và phù màng bao tim chiếm trên 60% tổng số ca biến dị hình thái.

Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng tụ máu lan tỏa khi phơi nhiễm Tartrazine được giải thích do sự can thiệp của hợp chất azo vào quá trình biểu hiện các gen điều hòa đông máu và ức chế sinh mạch nội mô trong giai đoạn phôi sớm. Hiệu ứng liều thấp của E102 tại nồng độ 1-2 g/l phản ánh cơ chế tương tác thụ thể màng tương tự hormone sinh trưởng, khiến tế bào phôi kích hoạt chu trình chết theo chương trình (apoptosis) cục bộ.

So sánh với các công bố quốc tế của các nhóm nghiên cứu độc học thủy sinh tại Châu Âu, giá trị LC50 và NOEC thu được trên mô hình phôi cá ngựa vằn có sự tương thích cao với dữ liệu thử nghiệm trên cá trưởng thành theo chuẩn OECD 203. Kết quả này chứng minh rằng màng phôi cá ngựa vằn tuy đóng vai trò như một hàng rào bảo vệ sinh học nhưng không thể ngăn chặn sự xâm nhập của các phân tử phụ gia tổng hợp có tính phân cực hoặc ưa béo cao.

Đề xuất và khuyến nghị

• Hoàn thiện quy chuẩn kiểm nghiệm an toàn thực phẩm: Đề nghị Bộ Y tế và Cục An toàn Thực phẩm ban hành lộ trình tích hợp quy trình thử nghiệm độc học trên phôi cá ngựa vằn (OECD TG 236) vào hệ thống Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) như một phương pháp sàng lọc bắt buộc đối với các phụ gia nhập khẩu trước năm 2027.
• Tái đánh giá ngưỡng tiêu thụ hàng ngày (ADI): Đề xuất các cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm tiến hành hạ mức giới hạn tiếp xúc tối đa đối với Sodium benzoate (duy trì nghiêm ngặt dưới 5 mg/kg thể trọng/ngày) và cân nhắc dán nhãn cảnh báo nguy cơ đối với sản phẩm chứa phẩm màu Tartrazine (E102) và Amaranth (E123) dành cho trẻ em trong vòng 12 đến 18 tháng tới.
• Kiểm soát và chuyển đổi công nghệ sản xuất thực phẩm: Khuyến khích các doanh nghiệp chế biến thực phẩm cắt giảm ít nhất 30% đến 50% hàm lượng chất bảo quản hóa học tổng hợp, đẩy mạnh ứng dụng chất chống oxy hóa và màu tự nhiên chiết xuất từ thực vật trước năm 2028.
• Siết chặt thanh tra và loại trừ hóa chất cấm: Tăng cường 100% các đợt kiểm tra liên ngành định kỳ tại các cơ sở chế biến bún, bánh phở và hải sản tươi sống nhằm loại bỏ hoàn toàn việc lạm dụng Formaldehyde (E240), xử lý nghiêm các trường hợp vi phạm theo khung pháp luật hiện hành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu và học viên chuyên ngành Sinh học, Dược học, Độc chất học: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chi tiết chuẩn hóa theo OECD 236, phương pháp nuôi dưỡng và kỹ thuật đánh giá chỉ số quái thai TI trên mô hình cá ngựa vằn.
• Chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp thực phẩm và đồ uống: Nắm bắt ngưỡng nồng độ an toàn, độc tính tế bào và cơ chế tác động của các phụ gia E211, E310, E102, E123 để tối ưu hóa công thức sản phẩm.
• Cán bộ quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm và kiểm nghiệm viên: Sử dụng các dữ liệu về NOEC, LOEC và LC50 làm tài liệu tham khảo kỹ thuật trong xây dựng tiêu chuẩn và thanh tra chất lượng.
• Các phòng thí nghiệm kiểm định độc học môi trường: Ứng dụng quy trình thử nghiệm chi phí thấp, thời gian ngắn (96 giờ) để thay thế mô hình động vật có vú trong sàng lọc độc tính nước thải và hóa chất công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

• Mô hình phôi cá ngựa vằn có ưu điểm gì vượt trội so với động vật thí nghiệm truyền thống? Phôi cá ngựa vằn phát triển nhanh ngoài cơ thể mẹ, hoàn thiện hầu hết cơ quan chỉ sau 72 giờ và hoàn toàn trong suốt. Bộ gen có hơn 70% tương đồng với người. Thử nghiệm kéo dài dưới 96 giờ không bị ràng buộc bởi các quy định khắt khe về bảo vệ động vật theo Chỉ thị 2010/63/EU, giúp giảm 80% chi phí và thời gian thực hiện.

• Hiệu ứng liều thấp của phẩm màu Tartrazine (E102) được hiểu như thế nào? Tại nồng độ thấp 1-2 g/l, Tartrazine gây tỷ lệ dị dạng lên tới 93% với các tổn thương phù noãn hoàng và vẹo cột sống nghiêm trọng, trong khi ở nồng độ cao 12 g/l tỷ lệ dị dạng sống sót chỉ là 72%. Hiện tượng này xảy ra do tương tác đặc hiệu của chất ở nồng độ thấp với các thụ thể màng tế bào.

• Chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic Index) có ý nghĩa như thế nào trong nghiên cứu? Chỉ số TI được tính bằng công thức LC50 chia cho EC50. Khi TI > 1, chất thử nghiệm có xu hướng gây biến dạng hình thái và quái thai trước khi gây chết cơ thể sinh vật. Ngược lại, khi TI < 1, tác động gây chết phôi chiếm ưu thế hơn tác động gây dị tật.

• Sodium benzoate (E211) gây ra những tổn thương điển hình nào trên phôi? Ở nồng độ từ 45 mg/l, Sodium benzoate bắt đầu gây hoại tử khối noãn hoàng trên 16,7% ấu thể ở mốc 96 hpf. Khi nồng độ tăng lên 650 mg/l, hóa chất gây phù bao tim, ứ trệ tuần hoàn máu và làm chết 77% cá thể thử nghiệm.

• Điều kiện kỹ thuật bắt buộc để một mẻ thử nghiệm độc tính phôi cá đạt chuẩn OECD 236 là gì? Phôi phải được thu nhận và phơi nhiễm trước 3 giờ sau thụ tinh (giai đoạn 4-32 tế bào), mẻ trứng ghép phải đạt tỷ lệ thụ tinh tối thiểu 90%, và tỷ lệ sống sót của lô đối chứng trong môi trường E3 phải đạt trên 90% tại thời điểm kết thúc 96 giờ.

Kết luận

• Luận văn đã thiết lập thành công quy trình đánh giá độc học phát triển hoàn chỉnh trên mô hình phôi cá ngựa vằn (Danio rerio) theo tiêu chuẩn quốc tế OECD TG 236 và ISO 15088:2007.
• Xác định chính xác các chỉ số độc tính định lượng (LC50, EC50, NOEC, LOEC) và phân loại nguy cơ gây quái thai của 6 hợp chất phụ gia thực phẩm phổ biến.
• Phát hiện hiện tượng đáp ứng liều thấp bất thường của phẩm màu Tartrazine (E102) và nguy cơ hoại tử mô của chất bảo quản Sodium benzoate (E211) ở nồng độ vượt ngưỡng.
• Khẳng định giá trị thực tiễn của mô hình phôi cá ngựa vằn trong việc thay thế động vật có vú, mở ra hướng ứng dụng sàng lọc độc chất học quy mô lớn trong vòng 12 đến 24 tháng tới.
• Cung cấp luận cứ khoa học tin cậy giúp các cơ quan chức năng hoàn thiện chính sách kiểm soát an toàn thực phẩm, hướng đến mục tiêu loại bỏ 100% phụ gia độc hại khỏi chuỗi cung ứng tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT Cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật và nhu cầu ngày càng cao của xã hội, việc sản xuất hóa chất đặc biệt là các hóa chất mới hàng năm đang tăng lên một cách đáng kể. Theo thống kê của Nordbeck và cộng sự, từ năm 1930 đến 2001, lượng hóa chất toàn cầu đã tăng từ 1 triệu tấn lên hơn 400 triệu tấn và riêng trên thị trường liên minh châu Âu EU có khoảng 143 nghìn hợp chất đã được đăng ký, trong số đó có 30 đến 70 nghìn chất được dùng hàng ngày [59]. Trước khi có quy định mới trong EU – REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals), tất cả các hóa chất trên thị trường trước năm 1981 đều được sử dụng mà không có bất kì thử nghiệm nào theo quy định của luật để chứng minh sự an toàn với con người [7].

Mặc dù những hóa chất được sản xuất với khối lượng lớn trên 1000 tấn một năm đã được kiểm tra, đánh giá kỹ lưỡng hơn nhưng khoảng 21% trong số này không có bất kì dữ liệu an toàn nào và 65% có rất ít thông tin [59]. Theo cùng với những lợi ích đối với sự phát triển kinh tế, nhiều hóa chất còn có thể trở thành mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe con người và môi trường. Việc sử dụng các chất mà chưa được nghiên cứu đầy đủ mức độ độc tính có thể gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng. Hai trường hợp được biết đến nhiều là sử dụng thalidomide như một chất điều hòa miễn dịch, thuốc an thần dẫn đến hàng ngàn trường hợp thai nhi chết non hoặc khuyết tật bẩm sinh [6, 45] và việc sử dụng dichloro diphenyl trichlorothane (DDT) đã đe dọa đến sức khỏe của rất nhiều động vật hoang dã và cả con người [87, 89].

Điều đáng nhắc đến ở đây là có rất nhiều loại hóa chất mà độc tính của chúng còn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ vẫn đang được sử dụng trong cuộc sống hàng ngày của con người, chưa kể đến tác động đồng thời khi chúng kết hợp lại với nhau. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. PHỤ GIA THỰC PHẨM 1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm Phụ gia thực phẩm là nhóm chất được sử dụng hàng ngày, hàng giờ trong cuộc sống của con người.

Theo Ủy ban Bảo vệ Thực phẩm Hoa Kỳ (Food Protection Committee – FPC), phụ gia thực phẩm là một chất hoặc một hỗn hợp các chất tuy không phải thành phần cơ bản của thực phẩm nhưng chúng được thêm vào trong thực phẩm một cách có chủ đích trong các công đoạn của quá trình sản xuất thực phẩm như chế biến, bảo quản và đóng gói sản phẩm [4]. Ước tính trên thị trường có hơn 2.500 chất phụ gia khác nhau đang được sử dụng trong thực phẩm [4]. Tại Châu Âu và một số nước trên thế giới, tất cả các loại phụ gia thực phẩm được quản lý theo hệ thống E, theo đó, mỗi chất được phê duyệt sẽ được kí hiệu là “E cộng số”, ví dụ Propyl gallate là E310, sodium benzoate là E211, Tartrazine là E102… Chúng có thể được chia thành sáu nhóm chính là chất bảo quản, chất phụ gia bổ sung dinh dưỡng, chất tạo màu, chất điều vị, các chất hỗ trợ chế biến và nhóm các chất khác (Bảng Error! No text of specified style in document. Bảng Error! No text of specified style in document.

Phân loại phụ gia thực phẩm [4, 30] Phân loại Chức năng Ví dụ Chất chống oxy Ngăn chặn quá trình oxy hóa Butylated hydroxy hóa lipid và vitamin hydroxyanisole (E320) Chất kháng sinh Tránh sự ảnh hưởng của vi Sodium acetate Chất bảo sinh vật và nấm (E262), sodium quản benzoate (E211) Chất chống các Chống lại sự hình thành màu Sodium sulfite phản ứng hóa nâu, đen, xám, đỏ không mong (E221), Sodium nâu muốn bisulfite (E222) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chất bổ Bổ sung vitamin, các amino Vitamin B12; sung axit, các axit béo và các Glutamic acid dinh khoáng chất Manganese sulfate dưỡng Chất tạo Cải thiện màu sắc, tăng độ hấp Tartrazine (E102) màu dẫn cho món ăn Amaranth (E123) Bổ sung vị ngọt, vị chua, và Monosodium Chất điều làm cho món ăn ngon miệng glutamate (E621) vị hơn Saccharin (E954) Chất nhũ hóa Giúp các thành phần phân tán Polyoxyethene đều trong thực phẩm (40) stearate Các chất (E431) hỗ trợ Chất ổn định Tạo kết cấu mong muốn, giữ Oat gum (E411) chế biến hương vị lâu hơn Chất giữ ẩm Sodium silicoaluminate Các enzyme, Amylase (E1100) Các loại chất tạo phức, Proteases (E1101) khác tạo bọt Theo Cansın Güngörmüş và cộng sự, trung bình mỗi năm, tính cả các loại đường, muối, tiêu, mật ong … một người tiêu thụ khoảng 139 lbs (khoảng 63kg); nếu không tính những chất phổ biến đó thì khoảng 2,27 kg phụ gia được sử dụng [24]. Mặc dù các chất phụ gia thực phẩm đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ qua do các ưu điểm trong việc cải thiện màu sắc, mùi vị thực phẩm, giúp bảo quản, giảm thiểu sự hư hỏng thực phẩm do tác động của vi khuẩn và nấm nhưng về cơ bản, chúng cũng như tất cả các loại hóa chất khác đều tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức khỏe con người đặc biệt là khi sử dụng với liều lượng lớn. Ảnh hưởng này có thể ngay lập tức hoặc tác động về lâu dài nếu sử dụng liên tục trong thời gian dài. Các tác dụng ngay lập tức có thể bao gồm đau đầu, giảm sự tập trung, thay đổi hành vi 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] hoặc các phản ứng miễn dịch.

Ảnh hưởng về lâu dài có thể làm tăng nguy cơ ung thư, các bệnh tim mạch… [4, 22]. Nghiên cứu của McCann và cộng sự trên 297 trẻ em cho thấy việc sử dụng hỗn hợp các chất phụ gia gồm hai nhóm là E102/E110/E122/E124/E211 và E104/E110/E122/E129/E211 có liên quan đến chứng tăng động ở những đứa trẻ này [49]. Sự tương tác của một số chất khi chúng kết hợp với nhau cũng đã được Lau Karen và cộng sự nghiên cứu. Cụ thể, hai hỗn hợp là E104/E951 và E133/L-glutamic axit được cho là ức chế sự biệt hóa dòng nguyên bào thần kinh chuột NB2a thành các sợi thần kinh và làm tăng tỷ lệ tế bào chết của dòng tế bào nuôi cấy [44].

Ngoài ra gần đây, một số phụ gia thực phẩm chậm phân hủy có trong chất thải ra môi trường từ hoạt động của con người đã tích tụ, gây ô nhiễm và ảnh hưởng đến môi trường nước như butylated hydroxyanisole (E320) và butylated hydroxytoluene (E321) hay propyl gallate (E310) ảnh hưởng đến hệ sinh thái trong nước [53, 93]. Vì vậy, việc kiểm tra đánh giá ảnh hưởng của các phụ gia thực phẩm lên sức khỏe con người và tìm giới hạn an toàn của chúng trong sản xuất và chế biến thực phẩm là điều rất cần thiết. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độc tính của năm loại phụ gia đang được sử dụng thuộc ba nhóm là nhóm chất bảo quản với hai đại diện là Sodium benzoate và Propyl gallate, nhóm chất tạo màu với hai đại diện là Tartrazine và Amaranth và nhóm chất điều vị với đại diện là Monosodium glutamate cùng với một phụ gia đã bị cấm sử dụng là Formaldehyde để kiểm chứng lại độc tính của một phụ gia đã được xác định là độc tới mức không được phép đưa vào trong thực phẩm. Chất bảo quản - Sodium benzoate Sodium benzoate có công thức phân tử là NaC6H5CO2, được tạo ra bằng phản ứng giữa natri hydroxit và axit benzoic.

Đây là một chất phụ gia thực phẩm được kí hiệu là E211, có tác dụng bảo quản thực phẩm tránh khỏi bị hư hỏng bằng cách kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong môi trường có tính axit. Trung bình mỗi năm, khoảng 100 nghìn tấn E211 có thể được sản xuất trên toàn thế 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Theo ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm (JECFA - Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives), liều lượng an toàn để sử dụng hàng ngày với Sodium benzoate tối đa là 5mg/kg trọng lượng [82]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Sodium benzoate có tiềm năng thấp gây ra chứng mề đay do sự hình thành axit benzoate tiếp xúc trên da [57].

E211 cũng được cho là làm thay đổi nồng độ ion kẽm trong não dẫn đến sự thay đổi hành vi ở chuột [3, 16]; ảnh hưởng đáng kể đến sợi trục tế bào thần kinh và các nút thần kinh từ đó gây độc thần kinh ở ấu thể cá ngựa vằn [8]. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate Propyl gallate (E310) là propyl este của axit 3,4,5-trihydroxybenzoic có công thức cấu tạo là C12H12O5, tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu kem, không mùi. Propyl gallate còn có tên gọi khác là gallic acid propyl ester hay Progallin P, được sử dụng với vai trò là chất chống oxy hóa trong các loại thực phẩm (chủ yếu có trong thực phẩm chứa hàm lượng chất béo cao), dược phẩm và mỹ phẩm [71]. Vai trò của Propyl gallate trong việc bảo quản nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống con người là không cần bàn cãi.

Tuy nhiên, việc sử dụng như thế nào và liều lượng là bao nhiêu thì cần phải có các nghiên cứu rất cẩn thận và chi tiết. Trong bản báo cáo khoa học đánh giá về propyl gallate của ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu năm 2014, lượng được phép sử dụng mỗi ngày trên 1 ki-lô-gam trọng lượng cơ thể (Intake Acceptable Daily - ADI) chỉ ở mức 0,5 mg/kg/ngày [15]. Cùng với đó, nhiều nghiên cứu về tác động của propyl gallate theo các cách khác nhau cũng đã được công bố. Speijers và cộng sự năm 1993, sau 13 tuần thử nghiệm trên chuột đã đưa ra nồng độ không quan sát thấy tác dụng phụ (NOAEL) của E310 là 135 mg/kg/ngày và nồng độ cao nhất trong thử nghiệm (527 mg/kg/ngày) đã gây ảnh hưởng xấu tới hệ thống tạo máu.

Khả năng gây đột biến, ung thư của phụ gia thực phẩm này cũng đã được một số nhà khoa học phát hiên thấy khi có mặt của Cu(II) và Fe(III) EDTA thông qua sản phẩm chuyển hóa là axit gallic [41]. Tuy nhiên, một số thử nghiệm khác trên động vật lại không cho thấy propyl gallate có khả năng gây 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ung thư [85]. Ngoài ra, trên lĩnh vực bảo vệ an toàn môi trường thì E310 đã được đề nghị xếp vào nhóm gây độc cho sinh vật thủy sinh [93]. Chất tạo màu vàng - Tartrazine Tartrazine có tên hóa học là 3-carboxy-5-hydroxy-1-(4'-sulphophenyl)-4-(4'- sulphophenylazo) pyrazole trisodium với công thức phân tử C16H9N4Na3O9S2 và khối lượng phân tử (mole) là 534,36 gam, được kí hiệu là E102 trong danh mục các phụ gia thực phẩm.