HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC MẪU GIỐNG ỔI (Psidium guajava L.) HÀ NỘI, 9/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC MẪU GIỐNG ỔI (Psidium guajava L.) Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIỀU TRINH Mã sinh viên : 637284 Lớp : K63CNSHC Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : TS. PHẠM THỊ DUNG HÀ NỘI, 9/2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết khóa luận tốt nghiệp “Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống ổi (Psidium guajava L.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Thị Dung. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài là hoàn toàn trung thực, khách quan.
Các phần tham khảo, trích dẫn đều đã được ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trinh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp, lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS. Phạm Thị Dung, người cô đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Đinh Trường Sơn – Bộ môn CNSH Thực vật và các thầy cô, anh (chị) trong Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ để em có điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học nói riêng và các giảng viên Học viện Nông nghiệp Việt Nam nói chung đã tận tình giảng dạy, trang bị cho em những kiến thức quý giá trong suốt quãng thời gian học tập tại Học viện. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân đã luôn bên cạnh, ủng hộ, khích lệ tinh thần giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Dẫu đã cố gắng hoàn thiện nhưng chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trinh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.
v DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ. vii DANH MỤC HÌNH. Lý do chọn đề tài.
Mục tiêu và yêu cầu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu về cây ổi. Giới thiệu chung.
Đặc điểm thực vật học của cây ổi. Giá trị của cây ổi. Chỉ thị phân tử và ứng dụng của một số chỉ thị phân tử trong phân tích đa dạng di truyền thực vật. Khái niệm chỉ thị phân tử.
Chỉ thị ISSR (InterSimple Sequence Repeat-ISSR). Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Chỉ thị RAPD. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền ổi trong nước và quốc tế.
15 iii PHẦN III. VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.
Dụng cụ, thiết bị và hóa chất. Dụng cụ và thiết bị. Danh sách mồi chỉ thị RAPD. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. 19 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân tích đa dạng các kiểu gen ổi.
Đa dạng hình thái lá. Hàm lượng Vitamin C quả ổi. Kết quả DNA tổng số. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD.
35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 42 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction. PVP Polyvinylpyrrolidone RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris-acetate EDTA v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.
Thành phần dinh dưỡng trong quả ổi. Danh sách kí hiệu các mẫu giống ổi. Danh sách 4 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần phản ứng của mỗi phản ứng PCR.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. Hình dáng và màu sắc lá các giống ổi. Một số đặc điểm của lá ổi. Một số đặc điểm của quả ổi.
Tỉ lệ các giống ra hoa, quả và phân loại quả ổi theo độ chín. Kết quả chỉ số OD260/280 và nồng độ của các mẫu nghiên cứu. Đa hình của 10 mẫu giống ổi dựa trên chỉ thị RAPD. Hệ số tương đồng của 10 mẫu giống ổi dựa trên chỉ thị RAPD.
36 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4. Tỉ lệ thịt quả/ khoang chứa (%). Sự biến đổi hàm lượng vitamin C trong quá trình chín. 33 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.
Một số thực phẩm làm từ ổi. Búp, lá ổi non giã nát dùng làm thuốc. Hình ảnh minh họa kỹ thuật chỉ thị RAPD. Cấu tạo của lá ổi.
Mặt trên và mặt dưới của 10 giống lá ổi được thu thập được tháng 6 tại các địa điểm khác nhau tại Hà Nội. Ảnh cắt ngang quả ổi. Minh họa 10 mẫu giống quả ổi. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 10 mẫu giống ổi.
37 viii TÓM TẮT Cây ổi (Psidium guajava), cây ăn quả nhiệt đới, giàu chất kháng oxi hóa và có chứa hàm lượng cao ascorbic acid (vitamin C). Để tiếp tục cải tiến giống ổi thông qua việc lai tạo để vượt qua các mối đe dọa từ dịch bệnh, côn trùng hoặc các ảnh hưởng sinh học và để phát triển các giống phù hợp với sở thích của người tiêu dùng, một nguồn gen đa dạng là điều cần thiết. Với những tiến độ về công nghệ, các chỉ thị phân tử đã trở thành tiêu điểm không chỉ nhanh chóng mà còn có độ chính xác cao so với các kỹ thuật trước đó. Nghiên cứu này sử dụng 4 chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá sự đa dạng của 10 mẫu giống ổi phổ biến được thu thập tại các huyện khác nhau ở Hà Nội.
Và đánh giá được các đặc điểm nông sinh, xác định được hàm lượng vitamin C của các mẫu giống ổi. Phân tích đa dạng di truyền cho thấy 10 mẫu giống có mức độ đa dạng di truyền khá cao. Các mẫu giống có đa dạng về hình thái về hình thái lá, màu sắc, hoa và hình dáng quả nổi bật là giống ổi tím Malaisia. Hàm lượng vitamin C đạt giá trị lớn nhất ở độ chín 3.
Kết quả này có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác bảo tồn, chọn và tạo giống để đem lại những giống ổi có chất lượng tốt hơn. Lý do chọn đề tài Ổi (Psidium guajava) là một loại cây ăn quả nhiệt đới trọng thuộc họ Myrtaceae. Đây là loại trái cây cứng nhất trong số các loại trái cây nhiệt đới và vượt trội hơn hầu hết các loại cây ăn trái khác về năng suất và khả năng thích ứng. Ổi có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, hiện được trồng ở nhiều nơi.
Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava) được nhập vào trồng từ lúc nào không rõ và nó được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống, nổi tiếng với ổi Thanh Hà thuộc tỉnh Hải Dương. Năm 2019, Sở NN-PTNT tỉnh Hải Dương đánh giá, bên cạnh vải, ổi trái vụ Thanh Hà vẫn là cây trồng mang lại giá trị cao cho người dân. Toàn tỉnh trồng khoảng 1.840 ha ổi, sản lượng 45,2 nghìn tấn/năm. Do giá cả ổn định, giá trị kinh tế do ổi trái vụ đem lại trung bình khoảng 250 triệu đồng/ha.
Đây là một loại quả bình dân, giàu Vitamin C. Ổi chủ yếu dùng để ăn tươi và gần đây là làm mứt, sấy khô, đóng hộp, chế biến trà ổi. Tuy nhiên ngoài vấn đề giá cả và thời tiết không ổn định thì vấn đề bệnh hại cây trồng cũng là một nguyên nhân quan trọng gây nên nhiều khó khăn cho người trồng ổi. Theo tài liệu Cây ăn trái đồng bằng sông Cửu Long (Sở KHCNMT An Giang) thì cây ổi thường có các loại sâu bệnh sau đây: Bệnh thán thư, Rầy mềm, Rệp dính, rệp sáp, rệp phấn trắng, Ruồi đục trái, Sâu đục trái, Bọ xít hại trái, Bệnh đốm lá.
Đây là những loại bệnh phá hoại nghiêm trọng ở ổi. Để tăng sự đậu quả thì người nông dân đã sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu, bệnh hại. Việc sử dụng thuốc hóa học không phù hợp có thể để có thể để lại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quá giới hạn trên nông sản gây độc cho sản phẩm, 1 làm giảm uy tín và giá trị sản phẩm cũng như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn định và bền vững của hệ sinh thái. Để tiếp tục cải tiến giống ổi thông qua việc lai tạo để vượt qua các mối đe dọa từ dịch bệnh, côn trùng hoặc các ảnh hưởng sinh học và để phát triển các giống phù hợp với sở thích của người tiêu dùng, một nguồn gen đa dạng là điều cần thiết.
Việc xác định và ước tính sự đa dạng của cây trồng bằng cách sử dụng các dấu hiệu kiểu hình, mặc dù thường được sử dụng từ thời xa xưa, nhưng vẫn có một số hạn chế đặc biệt là ở cây lâu năm. Với những tiến độ về công nghệ, các chỉ thị phân tử đã trở thành tiêu điểm không chỉ nhanh chóng mà còn có độ chính xác cao so với các kỹ thuật trước đó. Bây giờ có thể chỉ ra những khác biệt ở cấp độ phân tử mà còn chân thực hơn và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Trong số các loại chỉ thị phân tử khác nhau, DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) rất hữu ích cho việc đánh giá về đa dạng di truyền do tính đơn giản, tốc độ và chi phí tương đối thấp.
Các điểm đánh dấu RAPD hiệu quả trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền. Chúng đã được sư dụng trong phát sinh loài và hệ thống học, lập bản đồ liên kết gen và gắn thẻ gen. Dấu hiệu RAPD đã được sử dụng để ước tính sự đa dạng phân tử của các kiểu gen ổi trước đó. Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống ổi ( Psidium guajava L.
Mục tiêu và yêu cầu 1.