mở đầu ATG (Joshi và ctv, 1997), được phát triển bởi (Collard và Mackill, 2009). ATG là codon bắt đầu được bảo tồn cho tất cả các gen vì vậy các phản ứng PCR sử dụng primer SCoT có nguyên tắc, kỹ thuật như RAPD, ISSR, RFLP,. Tương tự với các chỉ thị phân tử RAPD, RFLP, ISSR,. SCoT là các marker quan trọng có thé sử dụng trong đánh giá da dang di truyền, lập bản đồ gen.
Các marker này có liên quan trực tiếp đến chức năng gen và có thé sử dụng trong genotyping và khám phá đa hình .Các đoạn oligonucleotide được sử dụng làm cả mỗi xuôi và mỗi ngược. Trong nghiên cứu của Collard và Mackill năm 2009 có 36 SCoT được nghiên cứu và phát triển dựa trên các kết quả có được từ các nghiên cứu (Joshi và ctv 1997). 36 chỉ thị SCoT được thực hiện PCR cùng 10 mẫu DNA lúa dé tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ và hóa chất phản ứng của phương pháp SCoT. Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ thị phân tử SCoT chiều dai tối ưu là 18 nu và có nhiệt độ bắt cặp thích hợp 6 50°C.
Trong nghiên cứu này Collard và Mackill đã chứng minh rằng chỉ thị phân tử SCoT có độ nhạy cao và khả nang tạo ra các band đa hình tương tự như RAPD, RFLP, ISSR,. khả năng tao band đa hình của chỉ thị phân tử được cho rằng có thể ứng dụng hiệu quả trong đánh giá đa dạng di truyền, lập bản đồ OT Ley sss Cơ sở kỹ thuật của SCoT dựa trên nguyên tắc khuếch dai mỗi don vi trong phan ứng PCR SCoT được sử dụng như mồi thuận và mồi nghịch, như kỹ thuật RAPD hoặc như kỹ thuật ISSR. Primer SCoT trong phản ứng PCR nhắm mục tiêu vào các vùng gen bảo tồn xung quanh codon bắt đầu ATG trên cả hai sợi DNA (Collard và Mackill, 2009) SCoT là các đoạn oligo ngắn gồm 18 nu và trong phan ứng PCR nhiệt độ bắt cặp của primer SCoT thường được sử dụng ở 50°C (Collard và Mackill, 2009). Điểm khác biệt của kỹ thuật SCoT so với các kỹ thuật khác là nó sử dụng vùng gen xung quanh bộ ba ATG có tính bảo tỒn cao trong hệ gen thực vật để khuếch đại các đoạn DNA khuôn, chính điều này khiến chỉ thị SCoT có độ nhạy cao cho việc khuếch đại gen thực vật, cũng như chúng có khả năng liên quan với các gen chức năng và tính đặc trưng của vùng gen thực vật.
Đồng thời, có thé sử dung chi thi SCoT dé xác định tính đa hình ở mức độ cá thể mà không cần thông tin bộ gen của loài. Chính điều này khiến SCoT có chi phí thấp hơn hắn các loại chỉ thị đa hình cùng loại khác, bên cạnh việc dễ dàng thực hiện thì độ chính xác cao cũng là một trong những ưu điểm nữa khiến kỹ thuật chỉ thị SCoT có ưu thé hon han khi cần xác định các allele đa hình trên thực vật. Một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SCoT Các ứng dụng của chỉ thị SCoT trong nghiên cứu đa dạng di truyền ngày càng được sử dụng nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Việc sử dụng chỉ thị phân tử SCoT đề đánh giá da dạng di truyền, lập bản đồ gen đã ngày càng trở nên phổ biến.
Vào năm 2015, Satya và ctv đã nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 155 loại gen từ năm quan thé cỏ Ramie (Boehmeria nivea L.) bằng 24 chỉ thị SCoT. Kết qua nghiên cứu cho thấy có 20/24 chỉ thị SCoT cho sản phẩm khuếch đại. 20 chỉ thị SCoT khuếch đại được 136 band dao động từ 4 đến 10 band với mỗi SCoT, trong đó có 136 (87,5%) band đa hình. Nghiên cứu đa dang di truyền, xác định tô tiên va phân tích cấu trúc quan thé của B.
Những phát hiện này sẽ hữu ích cho việc đề ra các chiến lược bảo tồn và lựa chọn một nguồn gen phù hợp dé giúp cải thiện di truyền của loài cây trồng quan trọng trong công nghiệp này. Vào năm 2021, Lê Thị Thanh Nga đã ứng dung chỉ thị SCo T đánh giá da dạng một số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam. Kết quả ghi nhận 9 chi thị SCoT có khả năng khuếch đại các band đa hình trên vú sữa với tổng số band khuếch đại được là 98 band với 96 band đa hình. Trong đó SCoT - 10 là chỉ thị cho số band và band đa hình thấp nhất và ngược lại chỉ thị SCoT - 6 ghi nhận số band/band đa hình nhiều nhất.
Kết quả này được cho là phù hợp với các đặc điểm hình thái và là cơ sở cho việc xác định từng cá thể vú sữa nhờ đặc tính đặc trung cho từng cá thé của chi thị SCoT. Chi thị phan tử SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) Kỹ thuật chi thị phân tử SCAR là các vùng đặc trưng nhân ban chuỗi được mô tả (Sequence Characterized Amplified Regions - SCAR). Dé có thé sử dụng các chỉ thị xác định được bằng các mồi ngẫu nhiên (như RAPD, AFLP,.) và khắc phục nhược điểm man cảm với điều kiện phản ứng của các phan ứng với mỗi ngẫu nhiên, kỹ thuật chi thị SCAR được phát triển và sử dụng. Kỹ thuật SCAR là kỹ thuật chỉ thị dựa vào PCR tạo ra các phân đoạn DNA tại các locus xác định bằng sử dụng các môi nucleotide đặc thù.
SCAR được tiến hành bằng cách tách dong sản phẩm PCR với các môi ngẫu nhiên sau đó đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng. Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mỗi với độ dài 15 bp đến 30 bp để nhân band đơn với kích thước tương tự như phân đoạn được nhân dòng. Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự suất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyên chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội. Kỹ thuật SCAR được dùng dé phân tích thư viện genome, xác định các locus đặc thù, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Nguyễn Đức Thành, 2014).
Một số nghiên cứu phát triển chỉ thị SCAR Vào năm 2015, Fujunjiang và ctv đã phát triển chỉ thị RAPD - SCAR để xác thực các loài nắm linh chi khác nhau. Trong nghiên cứu này họ đã thu thập DNA từ 10 loài nam linh chi và khuếch đại DNA bang kỹ thuật RAPD cải tiến. Sau đó, các đoạn khuếch dai được sao chép vào T - vector và các dòng vô tính dương được sang lọc, xác định va giải trình tự để phát triển các dấu hiệu SCAR. Sau khi thiết kế mỗi PCR và tối ưu hóa các điều kiện PCR, 4 chỉ thị SCAR có tên là LZ1-4, LZ2-2, LZ8-2 và LZ9-15 đã được phát triển, đặc hiệu cho Ganoderma gibbosum (LZ1-4 và LZ8-2), Ganoderma sinense (LZ2-2 và LZ8-2), Ganoderma tropicum (LZ8-2), va Ganoderma lucidum HG (LZ9-15).
Vào năm 2021, Hoang Tan Quang và ctv, đã sử dung 20 mỗi ngẫu nhiên cho phan ứng PCR - RAPD dé phát hiện đa hình DNA giữa các loài Vibrio. Trong đó, chỉ thị OPA-09 tạo ra một sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho loài V.vulnificus với chiều dài 1356 bp. Trình tự này được thiết kế môi đặc hiệu và chuyên thành chỉ thị SCAR với chiều dai 938 bp (A9 - 938). Cặp môi đặc hiệu (Vvul - 1F/Vvul - 938R) khuếch đại một băng duy nhất ở tat cả các chủng V.
vulnificus nhưng không xuất hiện ở các loài Vibrio khác. Đây là chỉ thị có độ đặc hiệu cao và có thể sử dụng để nhận điện V. vulnificus trong các mau hải sản. Các kỹ thuật tách chiết DNA thực vật 2.
Phương pháp tách chiết DNA DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật. Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và đủ tinh sạch dé tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage. Một quy trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bước cơ bản: Bước 1: phá vỡ màng tế bào.
Thông thường tế bào hoặc mô được nghiên trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết. Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết DNA. Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là các protein. Có thể sử dụng dung dịch CTAB (CTAB:cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chung.
Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform-isoamy alcolhol (24:1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hòa tan nucleic acid. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau. Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bot trong suốt quá trình ly trích.
Protein bị biến tinh sẽ không hòa tan trong nước có chứa nucleic acid. Sau khi ly tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại. Bước 3: tủa DNA.
Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác dé có thé hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Tua trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol/L thé tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc kết tủa. Hầu như các loại nucleic acid đều tủa trong các điều kiện trên. Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là không cần sự hiện diện của muối (1 thể tích isopropanol/L thé tích mẫu).
Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thé loại bỏ chúng trong isopropanl. Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% đề loại bỏ các muối và dấu vết isopropanol còn sót lại. Các phương pháp định tính và định lượng DNA DNA thu thập được phân tích định tính và định lượng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang học, đo quang phô. Định lượng bằng máy đo quang phổ: phương pháp này cho phép ước tính nồng độ tương đối của acid nucleic có trong mẫu sau khi chiết.
Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa trên mối tương quan: 1 đơn vi OD 260 nm tương ứng với nồng độ 0 ng/ul đối với dung dịch chứa DNA sợi kép và 50 ng/ul cho dung dịch chứa DNA va RNA sợi đơn. Dé kiểm tra độ tinh khiết của dung dich, giá trị bổ sung của OD 280 nm đã được đo.