Khóa luận Dược sỹ: Đánh giá tác dụng kháng ung thư của dẫn chất Quinazolin

Tài liệu khóa luận Dược sỹ về tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của dẫn chất quinazolin, tập trung vào cơ chế ức chế histon deacetylase.

• Tác giả: Hoàng Bảo Ngọc
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Hải Nam
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa dược
• Đề tài: Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung quinazolin-4(3H)-on hướng ức chế histon deacetylase
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và cơ chế hoạt động của Quinazolin

Dẫn chất Quinazolin là một lớp hợp chất hữu cơ thuộc nhóm các alkaloid dị vòng có cấu trúc khung lục giác kết hợp với vòng imidazol. Những dẫn chất này đã được chứng minh có tác dụng kháng ung thư đáng kể thông qua cơ chế ức chế các enzyme histone deacetylase (HDAC). Histon deacetylase (HDAC) là những enzyme quan trọng điều hòa hoạt động của các gen thông qua quá trình bỏ nhóm acetyl từ histone. Khi HDAC hoạt động bất thường, các gen ức chế khối u bị câm lặng, dẫn đến phát triển khối u không kiểm soát. Các chất ức chế HDAC giúp khôi phục chức năng bình thường của các gene này, kích hoạt apoptosis (chết tế bào lập trình) và dừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1/S, từ đó ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư.

1.1. Cấu trúc cơ bản của quinazolin 4 3H on

Khung quinazolin-4(3H)-on bao gồm hai vòng nitơ lục giác được liên kết với nhau. Cấu trúc này cung cấp nền tảng lý tưởng để kết hợp các nhóm chức năng khác nhau. Sự kết hợp N-hydroxypropenamid vào khung quinazolin tạo ra các dẫn chất mạnh mẽ có khả năng ức chế HDAC hiệu quả. Nhóm acid hydroxamic trong N-hydroxypropenamid hoạt động như một nhóm gắn kết zinc, cho phép liên kết mạnh mẽ với tâm hoạt động của enzyme.

1.2. Cơ chế tác dụng kháng ung thư

Dẫn chất quinazolin hoạt động bằng cách ức chế hoạt động của HDAC, dẫn đến sự tích tụ histone acetyl hóa. Điều này làm tăng cường biểu hiện gen ức chế khối u và gene liên quan đến apoptosis tế bào ung thư. Các tế bào ung thư bị dừng lại trong chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1/S, không thể phân chia. Đồng thời, những dẫn chất này kích hoạt đường dẫn apoptosis nội tại, dẫn đến chết tế bào có chương trình.

II. Phân loại và các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC (HDACi) được phân loại thành nhiều nhóm dựa trên cấu trúc hóa học và cơ chế tác dụng. Nhóm chứa acid hydroxamic là những chất ức chế HDAC mạnh mẽ nhất hiện nay, bao gồm các hợp chất như vorinostat, trichostatin A và các dẫn chất quinazolin hiện đại. Những chất ức chế dựa trên quinazolin kết hợp khung quinazolin với các nhóm chức năng đa dạng, tạo ra các hợp chất có tính chọn lọc cao đối với các isoform HDAC khác nhau. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung quinazolin-4(3H)-on thuộc hạng các chất ức chế HDAC thế hệ mới, với khả năng kháng ung thư in vitro vượt trội so với các hợp chất tham chiếu.

2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC được chia thành bốn nhóm chính: (1) Acid hydroxamic (vorinostat, trichostatin A); (2) Acid benzoit (entinostat, mocetinostat); (3) Cyclic peptide (romidepsin, FK-228); (4) Các ức chế đặc biệt (valproic acid). Trong đó, nhóm acid hydroxamic cho thấy tác dụng ức chế HDAC mạnh mẽ nhất. Dẫn chất quinazolin có nhóm N-hydroxypropenamid thuộc nhóm acid hydroxamic, cho phép gắn kết với zinc tại tâm hoạt động của enzyme một cách hiệu quả.

2.2. Cấu trúc và đặc tính của các chất ức chế dựa trên quinazolin

Các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on được thiết kế gồm ba thành phần: (1) Nhóm gắn kết zinc (N-hydroxypropenamid); (2) Cầu nối (linker) kết nối nhóm acetyl dạng nhóm với khung quinazolin; (3) Nhóm nhận diện bề mặt (CAP) giúp tăng tính chọn lọc và hiệu quả. Sự kết hợp này tạo ra chất ức chế HDAC có hoạt tính sinh học cao, với khả năng kháng ung thư vượt trội và độ độc tính thấp hơn so với các chất hiện có.

III. Hoạt tính kháng ung thư in vitro

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng dẫn chất quinazolin mang nhóm N-hydroxypropenamid thể hiện tác dụng kháng ung thư đáng kể đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Thử nghiệm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) cho thấy những dẫn chất này có giá trị IC50 thấp, tức là chỉ cần nồng độ nhỏ để ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư. Các tế bào ung thư miệng CAL 27, ung thư ruột kết HT29 và bệnh bạch cầu HL60 đều nhạy cảm đối với những dẫn chất này. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng ung thư của một số dẫn chất vượt trội hơn so với các chất điều trị tiêu chuẩn như doxorubicin.

3.1. Ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào

Dẫn chất quinazolin gây dừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1/S, ngăn chặn sự chuyển đổi từ G1 sang S. Phân tích bằng flow cytometry cho thấy sự tích tụ tế bào ở giai đoạn G1 tăng đáng kể sau xử lý với những dẫn chất này. Điều này liên quan đến sự giảm mRNA cyclin D và sự tăng mRNA p21, những protein chính điều khiển chu kỳ tế bào bình thường. Sự dừng chu kỳ tế bào này là cơ chế quan trọng trong tác dụng kháng ung thư của những dẫn chất này.

3.2. Kích hoạt apoptosis và tác dụng sinh học

Các dẫn chất quinazolin kích hoạt apoptosis (chết tế bào lập trình) thông qua đường dẫn nội tại liên quan đến mitochondria. Phân tích Annexin V-FITC/PI cho thấy tỷ lệ tế bào apoptotic tăng lên đáng kể. Enzyme caspase-3 và caspase-9 được kích hoạt, dẫn đến phân chia PARP và chết tế bào cuối cùng. Các dẫn chất này cũng thể hiện hiệu quả kháng ung thư cao với độc tính tế bào bình thường thấp, làm chúng trở thành ứng cử viên tiềm năng cho phát triển thuốc chống ung thư.

IV. Hướng phát triển và ứng dụng lâm sàng

Dẫn chất quinazolin ức chế HDAC đại diện cho hướng nghiên cứu mới đầy hứa hẹn trong lĩnh vực phát triển thuốc chống ung thư. Các nghiên cứu tiếp tục tối ưu hóa cấu trúc bằng cách thay đổi cầu nối, nhóm nhận diện bề mặt để đạt được hoạt tính cao hơn và tính chọn lọc tốt hơn. Mục tiêu là phát triển những dẫn chất có hiệu lực tương đương hoặc vượt hơn so với các chất ức chế HDAC hiện có như vorinostat, nhưng với độc tính thấp hơn và khả năng xâm nhập tế bào tốt hơn. Ứng dụng lâm sàng của những dẫn chất này có thể mở rộng để điều trị nhiều loại ung thư khác nhau, từ ung thư máu đến ung thư rắn.

4.1. Chiến lược tối ưu hóa cấu trúc dẫn chất quinazolin

Tối ưu hóa cấu trúc dẫn chất quinazolin tập trung vào ba lĩnh vực chính: (1) Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt (CAP) để tăng tính chọn lọc đối với các isoform HDAC khác nhau; (2) Cải thiện cầu nối (linker) để tăng sự linh hoạt và cải thiện hiệu quả ức chế; (3) Sửa đổi nhóm gắn kết zinc để tăng độ mạnh mẽ và tính bền vững. Những thay đổi này có thể dẫn đến dẫn chất có hoạt tính sinh học vượt trội và profil độc tính cải thiện.

4.2. Triển vọng ứng dụng lâm sàng và phát triển thuốc

Dẫn chất quinazolin ức chế HDAC có tiềm năng to lớn trong phát triển thuốc chống ung thư thế hệ mới. Các thử nghiệm tiền lâm sàng đã chứng minh hiệu quả kháng ung thư cao với độc tính chọn lọc. Bước tiếp theo là đánh giá in vivo trên mô hình động vật để xác minh an toàn và liều lượng hiệu quả. Nếu thành công, những dẫn chất này có thể tiến vào thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I để điều trị bệnh nhân ung thư, mở ra triển vọng mới trong chiến đấu chống ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Khái niệm enzym histone deacetylase (HDAC) Nhiễm sắc thể (NST) là vật chất di truyền có ở cả sinh vật nhân thực và sinh vật nhân sơ. Đơn vị cấu tạo cơ bản của nhiễm sắc thể là các nucleosom, gồm: một chuỗi ADN chứa 146 nucleotid quấn quanh một lõi protein gồm 8 histon (lõi octamer) nhờ lực liên kết tĩnh điện, tạo ra nhờ điện tích dương của histon và phần phosphat mang điện tích âm của ADN [12]. Trong cơ thể, nhiễm sắc thể tồn tại ở hai trạng thái: đóng xoắn (trạng thái không hoạt động) và mở xoắn (trạng thái hoạt động).

Việc điều hòa hai trạng thái này thông qua cặp enzym histon deacetylase (HDAC) và histone acetyltranferase (HAT). Cụ thể, dưới tác dụng của enzym histon deacetylase (HDAC), gốc acetyl sẽ được tách khỏi ε- N-acetyl lysin amino acid ở phần đuôi protein histon và chuyển tới coenzym A, làm tăng điện tích dương trên histon. Từ đó, lực liên kết giữa lõi protein và sợi ADN tăng, khiến nhiễm sắc thể duy trì trạng thái đóng xoắn. Trong khi đó enzym histon acetyltranferase (HAT) có tác dụng ngược lại, giúp nhiễm sắc thể mở xoắn [12].

Cấu trúc của nhiễm sắc thể và hoạt động của enzym HDAC, HAT 1. Phân loại các HDAC Năm 1996, HDAC1 ở người đã trở thành histon deacetylase đầu tiên được xác định thông qua việc sử dụng chất ức chế HDAC trapoxin. Nghiên cứu cũng cho thấy sự tương đồng về trình tự cũng như chức năng của HDAC1 và Rpd3p - enzym histon deacetylase ở nấm men [12]. Từ sự tương đồng này, người ta phân chia 18 loại HDAC ở người thành 4 nhóm [11]: Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 2 Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, HDAC6, HDAC10 Nhóm III: Sirtuin 1-7 Nhóm IV: HDAC11 Hình 1.

Phân loại enzym HDAC Bốn nhóm enzym được chia làm 2 “họ”, khác nhau về cơ chế xúc tác của chúng. Họ đầu tiên là các HDAC “cổ điển” thuộc nhóm I, II, IV. Đây là các enzym xúc tác phụ thuộc vào ion Zn2+ ở đáy túi, có thể bị ức chế khi coenzym này bị tạo phức chelat bởi các tác nhân hóa học như acid hydroxamic. Trong khi đó, quá trình xúc tác của các HDAC nhóm III sẽ phụ thuộc vào NAD+ [37].

Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC phụ thuộc Zn2+ Cấu trúc tinh thể của trung tâm hoạt động các enzym HDAC được xác định nhờ phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X. Nhìn chung, trung tâm hoạt động các HDAC có các phần cơ bản sau: - Coenzym Zn2+: nằm ở đáy của kênh enzym, có vai trò tạo liên kết phối trí mạnh với phần đuôi histon thông qua liên kết phối trí: 4 liên kết với nguyên tử oxy, nitơ của các acid amin, 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của phân tử acetyl- lysin ở phần đầu N của histon, từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Việc tạo phức 3 chelatvới coenzym Zn2+ bằng các tác nhân hóa học như acid hydroxamic, thiol. sẽ gây ức chế enzym HDAC này [5].

- Kênh enzym: dạng túi hẹp hình ống, có vai trò chứa cơ chất và tạo liên kết Van der Walls cố định cơ chất. Cấu trúc túi gồm các acid amin thân dầu: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Đáy túi chứa một số phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm nhóm acetyl trong quá trình deacetyl hóa, tạo liên kết hydro khi không có mặt nhóm -OH của Tyrosin. Miệng túi có một một số vòng xoắn protein (có thể tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của chất ức chế HDAC).

Kích thước của kênh dạng túi này khá linh động, có thể thay đổi để phù hợp với chiều dài cơ chất [5]. Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC 1. Mô hình xúc tác của enzym HDAC phụ thuộc Zn2+ Hình 1. Mô hình xúc tác của các HDAC phụ thuộc Zn2+ Ghi chú: Nét đứt màu xanh biểu diễn liên kết hydro.

4 Theo nghiên cứu năm 2014 của E. Seto và cộng sự, có hai mô hình cho cơ chế xúc tác của các HDAC phụ thuộc Zn2+ được đề xuất [29]:  Mô hình A: Đây là mô hình được đề xuất từ cấu trúc HDLP (histone deacetylase like protein), một chất đồng được phân lập từ vi khuẩn Aquiflex aeolicus. HDLP có vùng acid amin tương đồng 30% với HDAC1. Trung tâm hoạt động của HDLP bao gồm túi hình ống, vị trí liên kết kẽm, và các phần dị vòng hoạt động (in đậm) của một phân tử tyrosin (Y297) và hai phân tử histidin (H131 và H132), tạo liên kết hydro với hai acid aspartic (D166 và D173).

H131 và H132 có chức năng hình thành hệ thống chuyển tiếp D173 - H132 và D166 - H131. Trong đó, H131 (màu đỏ) xúc tác cho sự tấn công ái nhân vào nhóm carbonyl của cơ chất bằng cách hoạt hóa phân tử nước tạo liên kết phối trí với ion kẽm. Trung tâm hoạt động ion kẽm được gắn bởi: hai acid aspartic và một histidin.  Mô hình B: Đây là mô hình được đề xuất từ cấu trúc HDAC8.

H143 (màu đỏ) giữ vai trò thiết yếu trong việc chuyển điện tử, là một chất xúc tác base. Trong khi đó, vai trò của H142 có thể là một chất xúc tác tĩnh điện chung, giúp ổn định điện tích âm của chất trung gian tứ diện. HDAC và bệnh lý ung thư Nhờ một loạt các hiệu ứng phân tử thông qua quá trình acetyl hóa quá mức chất nền histon và không phải histon, HDAC có thể suy giảm biểu hiện gen ức chế khối u hoặc điều chỉnh con đường truyền tín hiệu tế bào gây ung thư thông qua thay đổi một số mắt xích chính. Enzym này cũng liên quan đến nhiều giai đoạn của bệnh lý ung thư (Hình 1.

Theo các nghiên cứu gần đây, biểu hiện bất thường của các loại HDAC cổ điển (nhóm I, II, IV) được tìm thấy ở nhiều loại khối u ác tính, bao gồm khối u rắn và ung thư máu. Trong hầu hết các trường hợp, sự biểu hiện quá mức của HDAC có liên quan với tiến triển bệnh và hiệu quả điều trị thấp ở bệnh nhân. Ví dụ, biểu hiện cao của HDAC1, 2 và 3 có liên quan đến tình trạng xấu đi trong ung thư dạ dày và ung thư buồng trứng. Sự quá mức của HDAC8 có tương quan với bệnh ở giai đoạn nặng và tỷ lệ sống thấp ở u nguyên bào thần kinh.

HDAC cũng được quan sát phổ biến trong bệnh đa u tủy (MM) [19]. Sự biểu hiện quá mức của HDAC ảnh hưởng đến sinh lý tế bào tương đối đa dạng giữa các loại cụ thể. Ví dụ, các HDAC nhóm I thường gây tăng sinh tế bào. Thêm vào 5 đó, cả HDAC1 và HDAC2 đều ức chế quá trình apoptosis của tế bào ung thư.

Trong khi đó, các HDAC khác như HDAC3, 4, 5 và 8 có xu hướng ức chế sự biệt hóa và HDAC4, 6, 9,10 có liên quan chặt chẽ với sự hình thành mạch. Hai enzym HDAC thuộc nhóm IIb là HDAC6 và 10 có khả năng kích thích khả năng tự di động của tế bào, dẫn đến di căn [40]. HDAC và bệnh lý ung thư 1. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC Thuật ngữ “chất ức chế HDAC” (HDACi) thường được sử dụng cho các dẫn chất ức chế có enzym HDAC “cổ điển”: nhóm I, II, IV [37].

Cấu trúc của các chất ức chế HDAC Cấu trúc của một chất ức chế HDAC gồm 3 phần chính: nhóm nhận diện bề mặt (CAP group), vùng cầu nối (linker) và nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG) [7].6 Cấu trúc cơ bản của các dẫn chất ức chế HDAC - Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc Binding Group, ZBG): tương tác với coenzym Zn2+, quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDACi; có thể là acid hydroxamic, thiol, nhóm ortho-aminoanilin của benzamid, α-cetoester, ceton thân dầu. 6 - Vùng cầu nối sơ nước: thường là mạch hydrocarbon thân dầu nằm trong kênh enzym, có thể tạo nhiều liên kết Van der Waals với kênh. - Nhóm nhận diện bề mặt: thường là các aryl hoặc 1 số vòng khác, nằm trên bề mặt enzym.2 Phân loại các chất ức chế HDAC Năm 2006, chất ức chế HDAC đầu tiên là suberoylanilid hydroxamic acid (SAHA, Zoinza®) đã được FDA phê duyệt để điều trị u lympho T ở da. Theo sau đó, nhiều chất ức chế HDAC khác đã được phê duyệt: belinostat (PXD101), romidepsin (Istodax®), panobinostat (LBH-589, Farydak®) và chidamid (Epidaza®).

cùng với hàng loạt các chất ức chế khác đang trong các pha thử nghiệm lâm sàng khác nhau với một số dòng tế bào ung thư khác nhau [35]. Dựa vào cấu trúc, các HDACi được chia làm 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton. Phân loại các chất ức chế HDAC Ghi chú: MM: u đa tủy; PTCL: u lympho tế bào T ngoại biên; CTCL: u lympho tế bào T ở da 1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 7 Chất ức chế HDAC là trung gian cho quá trình chết của tế bào ung thư thông qua một số con đường, bao gồm: ngăn chặn sự phát triển của tế bào, tác động lên quá trình sửa chữa và nguyên phân ADN, kích hoạt quá trình apoptosis, tác dụng chống tạo mạch… 1.

Ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào Một số chất ức chế HDAC gây ra bắt giữ chu kỳ tế bào tại G1 thông qua cảm ứng chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin p21WAF/CIP1. Ngoài ra, các HDACi này còn điều hòa giảm cyclin và hậu quả là giảm hoạt động kinase phụ thuộc cyclin, gây ra sự khử phosphoryl hóa Rb và các tác động lên yếu tố phiên mã E2F. Các HDACi cũng gây ra sự bắt giữ G2 / M ở tế bào bình thường và tế bào đã biến đổi. Tuy nhiên, các tế bào biến đổi sẽ không qua được điểm kiểm tra ở G2 và thường trải qua chu trình apoptosis.

Hiệu ứng này không xuất hiện ở các tế bào bình thường, từ đó giải thích cho việc ức chế chọn lọc khối u của các HDACi [16]. Ảnh hưởng đến cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN Theo nhiều nghiên cứu, các chất ức chế HDAC có thể hiệp đồng với bức xạ ion hóa và các tác nhân gây đột biến ADN nhằm kìm hãm sự phát triển của khối u. Người ta cho rằng chất ức chế HDAC thúc đẩy quá trình đứt gãy sợi kép của ADN (DSB: double-strand break - sự đứt gãy sợi kép). Thật vậy, do các HDACi ức chế enzym HDAC, tăng cường quá trình acetyl hóa dẫn đến cấu trúc NST và ADN thay đổi.

Điều này có thể khiến ADN dễ bị tổn thương khi tiếp xúc với các tác nhân gây hại như bức xạ, thuốc độc tế bào và các phản ứng oxy hóa hoặc tia cực tím. Bên cạnh đó, HDACi cũng có thể bất hoạt một số thành phần trong bộ máy sửa chữa ADN nhờ tăng cường acetyl hóa [16].