Khóa luận Dược sĩ Hoàng Kim Ngọc: Tổng hợp Dẫn chất Acid Hydroxamic Ức chế HDAC

Khóa luận dược sĩ tổng hợp, đánh giá tác dụng sinh học của dẫn chất acid hydroxamic mới mang khung 2-mercaptoquinazolin, tiềm năng ức chế enzym HDAC.

• Tác giả: Hoàng Kim Ngọc
• Người hướng dẫn: Ts. Dương Tiến Anh
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic mới mang khung 2-mercaptoquinazolin hướng ức chế enzym HDAC
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Enzym HDAC và Tầm Quan Trọng của Ức Chế

Enzym HDAC (Histon Deacetylase) đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh biểu hiện gen thông qua việc loại bỏ các nhóm acetyl từ protein histone. Hoạt động này có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của các bệnh ung thư và các bệnh lý liên quan. Trong những năm gần đây, ức chế HDAC đã trở thành một chiến lược trị liệu hứa hẹn trong oncology. Các chất ức chế HDAC có khả năng tái kích hoạt các gen bị im lặng và gây chết tế bào ung thư. Việc phát triển các dẫn chất mới với hiệu quả cao hơn và độc tính thấp hơn là mục tiêu chính của nghiên cứu dược học hiện đại. Khóa luận của Hoàng Kim Ngọc từ Trường Đại học Dược Hà Nội tập trung vào việc tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mới nhằm cải thiện khả năng ức chế enzym HDAC một cách hiệu quả.

1.1. Cơ chế hoạt động của Enzym HDAC

HDAC là một nhóm enzym có khả năng khử acetyl hóa các lysine trên histone, làm cho chromatin trở nên compact hơn và giảm khả năng phiên mã. Quá trình này được gọi là quiescence của gen. Khi HDAC hoạt động quá mức, nó dẫn đến im lặng các gen ức chế종양 (tumor suppressor genes). Điều này là một trong những cơ chế chính trong ung thư. Ức chế HDAC giúp tái kích hoạt những gen này và kích thích apoptosis trong tế bào ung thư.

1.2. Phân loại và chức năng của các loại HDAC

Có bốn lớp HDAC chính (Class I, II, III, IV) với các đặc điểm và chức năng khác nhau. Class I HDAC thường có liên quan đến ung thư và được coi là mục tiêu ưu tiên cho ức chế HDAC. Các loại HDAC khác nhau có biểu hiện trong các mô và bệnh lý khác nhau, vì vậy việc phát triển các ức chế chọn lọc là rất quan trọng để giảm tác dụng phụ.

II. Khung 2 Mercaptoquinazolin và Ứng Dụng Trong Thiết Kế Dược Chất

Khung 2-mercaptoquinazolin là một cấu trúc heterocyclic đa năng được sử dụng rộng rãi trong thiết kế dược chất hiện đại. Cấu trúc này có khả năng điều chỉnh hoạt tính sinh học thông qua các thay thế hóa học khác nhau. Trong nghiên cứu của Hoàng Kim Ngọc, khung 2-mercaptoquinazolin được kết hợp với acid hydroxamic để tạo ra các dẫn chất mới có khả năng ức chế HDAC cải thiện. Acid hydroxamic là một nhóm chức năng quan trọng được biết đến như một ZBG (Zinc-Binding Group) hiệu quả trong các chất ức chế HDAC. Sự kết hợp này cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các hợp chất với cấu trúc tối ưu hóa để tương tác với ngoài của hoạt động của HDAC.

2.1. Cấu trúc hóa học của khung 2 mercaptoquinazolin

2-mercaptoquinazolin có một vòng quinazoline với nhóm thiol ở vị trí 2. Cấu trúc này cung cấp những lợi thế về tính chọn lọc và linh hoạt trong thiết kế dược chất. Nhóm thiol có thể tham gia vào các tương tác với các protein mục tiêu, trong khi vòng quinazoline cung cấp khung cứng giúp định hướng các nhóm thay thế.

2.2. Hoạt tính sinh học của các dẫn chất khung 2 mercaptoquinazolin

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng dẫn chất khung 2-mercaptoquinazolin có hoạt tính kháng ung thư tốt, đặc biệt là chống lại ung thư buồng trứng (A2780) và ung thư phổi (A549). Điều này làm cho khung này trở thành lựa chọn lý tưởng cho việc phát triển các ức chế HDAC mới.

III. Acid Hydroxamic và Vai Trò Như Nhóm Ràng Buộc Kẽm ZBG

Acid hydroxamic là một nhóm chức năng chứa cấu trúc R-CO-NH-OH, đã được chứng minh là một ZBG (Zinc-Binding Group) cực kỳ hiệu quả trong các chất ức chế HDAC. Kẽm (Zn²⁺) là một ion kim loại quan trọng nằm trong ngoài của HDAC, và acid hydroxamic có khả năng tương tác mạnh mẽ với ion này thông qua các cặp electron của nguyên tử nitrogen và oxygen. Sự tương tác này giữ hợp chất ở vị trí hoạt động của enzym, cho phép nó ức chế hoạt tính HDAC. Các dẫn chất acid hydroxamic mới trong nghiên cứu được thiết kế để có khả năng ức chế HDAC cao hơn so với các dẫn chất hiện có, với độc tính tế bào thấp hơn. Những hợp chất này được tổng hợp thông qua các phản ứng hóa học tiên tiến và được đánh giá bằng các phương pháp thử sinh học hiện đại.

3.1. Cơ chế ràng buộc của acid hydroxamic với HDAC

Acid hydroxamic liên kết trực tiếp với ion kẽm ở tâm hoạt động của HDAC thông qua cấu trúc N-O. Liên kết này là reversible nhưng mạnh, cho phép hợp chất ức chế enzym mà không gây hại vĩnh viễn. Ngoài tương tác với kẽm, acid hydroxamic cũng có thể tạo ra các liên kết hydrogen với các amino acid xung quanh, tăng cường tính chọn lọc.

3.2. N hydroxycinnamamid và các dẫn chất liên quan

N-hydroxycinnamamid là một lớp dẫn chất acid hydroxamic được nghiên cứu rộng rãi với hoạt tính sinh học tốt. Các dẫn chất này có khả năng ức chế HDAC đồng thời hiển thị độc tính tế bào thấp hơn so với các ức chế HDAC truyền thống như vorinostat. Việc thay thế ở vòng cinnamamid cho phép điều chỉnh tính chọn lọc và hiệu quả của chất.

IV. Phương Pháp Thử Hoạt Tính Sinh Học và Kết Quả Nghiên Cứu

Để đánh giá hoạt tính sinh học của các dẫn chất acid hydroxamic mới, các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp thử khác nhau. Thử ức chế HDAC được thực hiện bằng cách sử dụng các đoạn peptide histone được đánh dấu, và hoạt tính của enzym được đo bằng quang phổ huỳnh quang. Thử độc tính tế bào được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như A2780 (ung thư buồng trứng) và A549 (ung thư phổi) bằng cách sử dụng phương pháp MTT assay. Các kết quả từ khóa luận của Hoàng Kim Ngọc cho thấy nhiều dẫn chất mới có khả năng ức chế HDAC hiệu quả với IC50 (nồng độ ức chế 50%) thấp hơn các dẫn chất tham chiếu. Những hợp chất này cũng cho thấy hoạt tính kháng ung thư tốt trên các dòng tế bào được thử nghiệm.

4.1. Phương pháp thử ức chế HDAC in vitro

Các thử hoạt tính ức chế HDAC được thực hiện bằng cách sử dụng các bộ kit thương mại hoặc các phương pháp tùy chỉnh. Thường sử dụng HDAC từ ngoài lúa hoặc HDAC tái tổ hợp. Sau khi ủ với các dẫn chất thử, mức độ acetylation của histone được đo bằng HPLC hoặc quang phổ huỳnh quang. Các giá trị IC50 được tính toán để xác định hiệu quả ức chế.

4.2. Đánh giá độc tính tế bào và hoạt tính kháng ung thư

Thử hoạt tính sinh học trên tế bào ung thư được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp MTT assay hoặc các phương pháp tương tự khác. Các tế bào được ủ với nồng độ khác nhau của dẫn chất, và sự sống sót của tế bào được xác định. Các dẫn chất có độc tính tế bào cao (giá trị IC50 thấp) được coi là tiềm năng hơn cho phát triển dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về histon deactylase Các biến đổi biểu sinh (epigenetic modifications) là những thay đổi hóa học xảy ra trên ADN hoặc protein histon, làm thay đổi biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự nucleotide của ADN. Các thay đổi này có thể đảo ngược, được duy trì qua các lần phân chia tế bào và giữ vai trò thiết yếu trong việc duy trì đặc tính tế bào cũng như điều hòa các quá trình sinh học quan trọng. Cơ chế điều hòa biểu sinh bao gồm các thay đổi trong cấu trúc chromatin, trạng thái methyl hóa ADN, các biến đổi hóa học cộng hóa trị trên protein histon (như acetyl hóa, methyl hóa, ADP-ribosyl hóa, ubiquitin hóa và phosphoryl hóa), cùng với sự điều hòa của các ARN không mã hóa (ncARN) [6].

Việc kiểm soát các sửa đổi biểu sinh này được thực hiện thông qua hoạt động của các enzym và protein liên kết với chromatin chuyên biệt [7]. Histon là protein có khả năng tương tác với ADN để hình thành nên chromatin, giúp đóng gói ADN một cách hiệu quả trong nhân tế bào. Đơn vị cơ bản của chromatin là nucleosome, bao gồm khoảng 147 cặp base của ADN quấn quanh một lõi của 8 protein histon (bao gồm hai bản sao của mỗi H2A, H2B, H3, H4) [8]. Cấu trúc nucleosome là mục tiêu điều hòa của nhiều cơ chế biểu sinh nhằm duy trì trạng thái euchromatin (nguyên sắc) hoặc heterochromatin (dị nhiễm sắc), từ đó điều chỉnh mức độ tiếp cận ADN và ảnh hưởng đến các quá trình phiên mã, sao chép, tái tổ hợp và sửa chữa AND [9].

Mỗi protein histon có hai vùng chức năng chính: đầu C nằm trong lõi nucleosome và đầu N chứa nhiều acid amin. Đầu N là vị trí xảy ra các biến đổi sau dịch mã, bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa và ubiquitin hóa, đóng vai trò thiết yếu trong điều hòa hoạt động phiên mã thông qua thay đổi cấu trúc chromatin và khả năng nhận diện của các protein điều hòa [8]. Sự acetyl hóa histon là một quá trình xảy ra tại các lysin ở đầu N của protein histon, và có liên quan đến nhiều quá trình sinh học trong cơ thể con người [10], [11]. Quá trình này được điều hòa bởi hai loại enzym chính: histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) (Hình 1.

Việc acetyl hóa lysin trên đầu N của histon được xúc tác bởi enzym HAT, làm trung hòa điện tích dương của histon, dẫn đến giảm tương tác với ADN và tạo ra cấu trúc chromatin lỏng lẻo hơn, từ đó cho phép các yếu tố phiên mã tiếp cận ADN và kích hoạt phiên mã gen. Ngược lại, HDAC xúc tác quá trình deacetyl hóa khỏi các gốc lysin, làm tăng điện tích dương của histon và thúc đẩy sự tương tác chặt chẽ hơn giữa histon và ADN. Điều này dẫn đến sự hình thành cấu trúc chromatin chặt hơn và hạn chế khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã và làm ức chế biểu hiện gen [12]. HAT và HDAC không chỉ tác động lên histon mà còn điều hòa acetyl hóa của nhiều protein không phải histon, bao gồm các yếu tố phiên mã, protein tham gia 2 vào sửa chữa ADN, truyền tín hiệu, chuyển hóa, tổ chức bộ xương tế bào, quá trình apoptosis, và gấp nếp protein.

Ngoài ra, HDAC còn được chứng minh làm ảnh hưởng đến nhiều chức năng sinh học như ổn định protein, điều hòa hoạt tính enzym, tương tác protein-protein, khả năng liên kết với ADN, cũng như điều chỉnh phiên mã thông qua việc deacetyl hóa các protein điều hòa biểu sinh khác như DNMT và HAT [13]. Vai trò của HAT và HDAC 1. Phân loại HDAC Tính tới hiện tại, 18 histon deacetylase (HDAC) được phát hiện ở động vật có vú được phân loại thành 4 nhóm chính (I, II, III và IV) dựa trên các phân tích mức độ tương đồng trình tự, đặc điểm miền cấu trúc [14]. Dựa vào mục tiêu của khóa luận, phần tổng quan sẽ tập trung trình bày về phân loại họ histon deacetylase có cơ chế xúc tác enzym phụ thuộc vào ion Zn2+ (Hình 1.2), bao gồm: Nhóm I, tương đồng với Rpd3 trên nấm Saccharomyces cerevisiae, bao gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8.

Các enzym này được biểu hiện rộng rãi trong nhiều mô và nhân, nơi mà chúng thể hiện hoạt tính deacetylse mạnh với histon. HDAC nhóm I thường tồn tại dưới dạng phức hợp protein ức chế phiên mã với các đồng yếu tố như Sin3, N-CoR và SMRT, qua đó deacetyl các protein không phải histon như AMP- 3 activated protein kinase (AMPK), tiểu đơn vị liên kết SMC3, và các yếu tố điều hòa phiên mã khác, từ đó kiểm soát hoạt động chức năng của chúng [15]. Nhóm II, có cấu trúc tương tự với HDAC1 ở nấm men, đặc trưng bởi đầu N chứa các miền bảo tồn liên quan đến tương tác protein-protein và được chia thành hai phân nhóm nhỏ: nhóm IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7 và HDAC9) và nhóm IIb (HDAC6 và HDAC 10). Các HDAC nhóm IIa được đặc trưng bởi phần mở rộng tại đầu N kéo dài ra ngoài miền xúc tác, đồng thời chứa các vị trí liên kết với yếu tố tăng cường tế bào cơ 2 (MEF2), một tín hiệu định vị nhân (NLS) tại đầu N và một tín hiệu xuất nhân (NES) tại đầu C [16].

HDAC nhóm IIb thể hiện phần mở rộng dài đặc trưng tại đầu C. HDAC6 chứa hai miền deacetylase và một miền liên kết ubiquitin dạng ngón tay kẽm ở đầu C, trong khi HDAC10 chỉ có một miền deacetylase và một miền lặp lại giàu leucin tại đầu C của nó [17]. Do sự đa dạng về cấu trúc và vị trí phân bố trong tế bào, HDAC nhóm II tham gia kiểm soát các quá trình phiên mã phụ thuộc MEF2, điều hòa sự tái định vị giữa nhân và bào tương, tương tác với các tín hiệu nội bào, đồng thời góp phần ổn định tế bào chất và bộ khung tế bào [18-21]. HDAC11 là thành viên duy nhất thuộc nhóm IV, có đặc điểm hoạt tính tương tự như nhóm I và II, nhưng lại có khác biệt về trình tự acid amin.

Mặc dù mới được phát hiện, HDAC11 cho thấy tiềm năng thông qua hoạt tính deacylase mạnh trên các acid béo chuỗi dài và đóng vai trò quan trọng trong nhiều con đường tín hiệu tế bào [22]. Những vai trò này được làm sáng tỏ qua các nghiên cứu gần đây về vị trí phân bố nội bào, đặc điểm sinh hóa, cũng như cơ chế điều hòa của HDAC11 thông qua microARN và các ARN không mã hóa dài [23]. Phân loại các HDAC isoform phụ thuộc vào ion kẽm 4 1. Các chất ức chế enzym histon deactylase (HDACi) 1.

Cấu trúc các chất ức chế enzym HDAC Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC đã được xác định thông qua kỹ thuật kết tinh tạo tinh thể kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X. Kết quả cho thấy hình dạng đặc trưng bao gồm hai thành phần chính: kênh enzym và ion Zn2+ nằm ở đáy trung tâm hoạt động xúc tác. Kênh enzym đóng vai trò dẫn đường cho chuỗi lysin chứa nhóm acetyl tiếp cận ion kim loại, trong khi ion Zn2+ tương tác với các gốc amino acid xúc tác ở đáy thông qua 5 liên kết phối trí, tham gia trực tiếp vào phản ứng deacetyl hóa [24]. Hiện nay, các chất ức chế histon deacetylase (HDACi) thường có chung một pharmacophore, bao gồm ba vùng chức năng riêng biệt, mỗi vùng được tối ưu hóa để tương tác với một vị trí xác định trong kênh xúc tác của enzym (Hình 1.

Mô hình pharmacophore cổ điển của các HDACi Nhóm gắn kẽm (ZBG): Là vùng quan trọng quyết định hoạt tính ức chế HDAC thông qua khả năng khóa ion Zn2+ tại đáy trung tâm hoạt động, qua đó trực tiếp ức chế chức năng xúc tác của enzym. Acid hydroxamic là nhóm gắn kẽm phổ biến nhất được sử dụng trong thiết kế các chất ức chế HDAC. Các chất ức chế HDAC chứa nhóm hydroxamat có khả năng tạo thành phức bền với ion kẽm tại vị trí xúc tác, hình thành cấu trúc phức bền vững, từ đó ngăn cản hoạt động deacetyl hóa của enzym. Các dữ liệu tinh thể học cho thấy liên kết phối trí phổ biến của nhóm hydroxamat đối với ion Zn2+ là dạng hai càng (bidentate), trong đó ion kẽm tạo liên kết phối trí đồng thời với nhóm 5 carbonyl (C=O) và oxyanion (N-O-) của hydroxamat [26], [27].

Tuy nhiên, một số trường hợp cũng cho thấy liên kết phối trí dạng một càng (monodentate), đặc biệt ở các chất ức chế có chứa vùng cầu nối phenyl gắn vào nhóm hydroxamat [28]. Trong kiểu phối trí này, chỉ có nhóm N-O- tham gia phối trí trực tiếp với ion kẽm, trong khi nhóm carbonyl không tạo liên kết trực tiếp mà hình thành liên kết hydro với phân tử nước ở đáy của túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt (Cap Group): Thành phần này có khả năng tương tác với các acid amin nằm gần miệng trung tâm hoạt động hoặc trên bề mặt ngoài của enzym [29]. Nhóm nhận diện bề mặt thường được thay thế linh hoạt các dị vòng có hoạt tính tiềm năng nhằm nâng cao tính chọn lọc đối với các isoform HDAC và tối ưu hóa đặc tính dược động học.

Vùng cầu nối (Linker): Cấu trúc phần này đóng vai trò như một đoạn nối hai thành phần còn lại, trải dài dọc theo kênh xúc tác và tương tác với các acid amin kỵ nước nằm dọc hai bên thành kênh. Những tương tác này góp phần định hướng không gian và ổn định liên kết giữa chất ức chế và enzym. Chiến lược điều chỉnh cấu trúc của linker bao gồm thay đổi về độ dài và đặc tính không gian, được coi là một hướng tiếp cận quan trọng nhằm nâng cao hoạt tính ức chế cũng như cải thiện tính chọn lọc đối với các isoform HDAC. Các isozym HDAC đều có độ dài và đặc điểm vùng kị nước khác nhau do đó, linker quá dài hoặc quá ngắn so với vùng kỵ nước có thể làm giảm khả năng gắn kết hiệu quả của chất ức chế, ảnh hưởng đến cả khả năng tương tác với bề mặt enzym lẫn nhóm gắn ion Zn2+.

Các chất ức chế mang vùng cầu nối dạng vinyl (như trichostatin A) hoặc mạch alkyl bão hòa (như hexyl trong vorinostat) được chứng minh có hoạt tính ức cao enzym HDAC tổng nhưng độ chọn lọc isoform thấp [30-32]. Ngược lại, hoạt tính sinh học các chất chứa vùng cầu nối chứa vòng cồng kềnh hơn lại thể hiện ức chế chọn lọc với HDAC6 và HDAC8 - các isoform có lòng kênh kỵ nước lớn hơn và sự phân các amino acid thơm dọc theo hai thành kênh [26], [33-36]. Chiến lược thiết kế hiện nay có xu hướng tập trung vào việc biến đổi và tối ưu ba vùng chức năng nêu trên nhằm cải thiện hiệu quả ức chế cũng như tăng cường tính chọn lọc của HDACi.