Nghiên cứu đặc tính của các chủng vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam

Nghiên cứu xác định đặc tính vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lệ
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Trường Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Xác Định Đặc Tính Của Một Số Chủng Vi Khuẩn Thủy Phân Agar Phân Lập Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cấu trúc agar
• 1.2. Nguồn gốc agar
• 1.3. Nguồn gốc agarase
• 1.4. Ứng dụng của agarase
• 1.4.1. Trong công nghệ gen nhằm thu hồi DNA từ gel agarose
• 1.4.2. Tách chiết hợp chất sinh học từ tảo biển và tạo tế bào trần từ tảo biển
• 1.4.3. Sản xuất oligosaccharide
• 1.4.4. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ
• 2.4. Môi trường
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.5.2. Xác định hoạt tính phân giải agar trên đĩa thạch
• 2.5.3. Nuôi cấy tách chiết enzyme
• 2.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính phân giải agar
• 2.5.5. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE
• 2.5.6. Phương pháp điện di Zymogram
• 2.5.7. Phương pháp xác định hoạt tính bằng DNS
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.1.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc
• 3.1.2. Quan sát hình thái tế bào
• 3.2. Đánh giá định tính khả năng phân giải agar
• 3.3. Nuôi thu enzyme phân giải agar
• 3.4. Đánh giá định tính hoạt tính enzyme phân giải agar
• 3.5. Đánh giá hệ protein và hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di
• 3.5.1. Đánh giá hệ protein bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE
• 3.5.2. Đánh giá hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di Zymogram
• 3.6. Xác định hoạt tính enzyme phân giải agar bằng phương pháp DNS
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đặc tính vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam

Vi khuẩn thủy phân agar là một chủ đề nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn này đang ngày càng được chú trọng. Agar, một polysaccharide tự nhiên, có khả năng tạo gel và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và công nghệ sinh học. Đặc tính của vi khuẩn thủy phân agar không chỉ giúp hiểu rõ hơn về quá trình phân giải agar mà còn mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong sản xuất oligosaccharides và enzyme.

1.1. Đặc điểm cấu trúc của agar và vai trò của vi khuẩn

Agar là một polysaccharide phức tạp, bao gồm agarose và agaropectin. Vi khuẩn thủy phân agar có khả năng phân giải cấu trúc này, tạo ra các sản phẩm có giá trị sinh học. Việc hiểu rõ cấu trúc của agar giúp xác định các phương pháp tối ưu để khai thác tiềm năng của vi khuẩn trong ứng dụng thực tiễn.

1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam

Mặc dù nghiên cứu về vi khuẩn thủy phân agar đã được thực hiện ở nhiều quốc gia, nhưng tại Việt Nam, lĩnh vực này vẫn còn nhiều hạn chế. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào việc xác định hoạt tính của enzyme và đặc tính của các chủng vi khuẩn địa phương.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar

Nghiên cứu về vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là thiếu hụt tài liệu và nguồn lực nghiên cứu. Ngoài ra, việc phân lập và xác định các chủng vi khuẩn mới cũng gặp khó khăn do điều kiện môi trường và kỹ thuật chưa được phát triển đầy đủ.

2.1. Thiếu hụt tài liệu và nguồn lực nghiên cứu

Việc thiếu hụt tài liệu nghiên cứu về vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam đã hạn chế khả năng phát triển và ứng dụng của lĩnh vực này. Các nhà nghiên cứu cần có thêm thông tin và dữ liệu để tiến hành các thí nghiệm và phân tích chính xác.

2.2. Khó khăn trong việc phân lập chủng vi khuẩn mới

Phân lập các chủng vi khuẩn mới từ môi trường tự nhiên là một thách thức lớn. Điều này đòi hỏi kỹ thuật và thiết bị hiện đại, cũng như sự hiểu biết sâu sắc về môi trường sống của các vi khuẩn này.

III. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar hiệu quả

Để nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn thủy phân agar, các phương pháp hiện đại như điện di protein, nuôi cấy tách chiết enzyme và xác định hoạt tính enzyme được áp dụng. Những phương pháp này giúp đánh giá chính xác khả năng phân giải agar của các chủng vi khuẩn.

3.1. Phương pháp điện di protein SDS PAGE

Phương pháp điện di protein SDS-PAGE được sử dụng để phân tích hệ protein của vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép xác định kích thước và số lượng protein trong mẫu, từ đó đánh giá khả năng sản xuất enzyme phân giải agar.

3.2. Nuôi cấy tách chiết enzyme

Nuôi cấy tách chiết enzyme là một bước quan trọng trong nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar. Phương pháp này giúp thu nhận enzyme với hoạt tính cao, phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn thủy phân agar

Vi khuẩn thủy phân agar có nhiều ứng dụng thực tiễn trong công nghệ thực phẩm, y học và dược phẩm. Các sản phẩm từ quá trình thủy phân agar có thể được sử dụng để sản xuất oligosaccharides, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học khác.

4.1. Sản xuất oligosaccharides từ agar

Oligosaccharides được sản xuất từ quá trình thủy phân agar có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng như một loại chất bổ sung dinh dưỡng và có tác dụng sinh học tích cực.

4.2. Ứng dụng trong công nghệ gen

Agarase được sử dụng để thu hồi DNA từ gel agarose, giúp cải thiện hiệu quả trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Việc ứng dụng này đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển công nghệ gen.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar

Nghiên cứu về vi khuẩn thủy phân agar tại Việt Nam đang trên đà phát triển. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng ứng dụng của lĩnh vực này là rất lớn. Các nhà khoa học cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển để khai thác tối đa giá trị của vi khuẩn thủy phân agar.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar

Nghiên cứu vi khuẩn thủy phân agar không chỉ giúp hiểu rõ hơn về quá trình phân giải agar mà còn mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong sản xuất thực phẩm và dược phẩm.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Trong tương lai, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về đặc tính của vi khuẩn thủy phân agar. Việc phát triển công nghệ và kỹ thuật mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Agar là polysaccharide dị thể bao gồm agarose chiếm khoảng 70%, còn lại là agaropectin. Agarose có cấu trúc mạch thẳng được sắp xếp xen kẽ hai phân tử β-D- galactose và 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 tạo thành 1 đơn vị neoagarobiose hoặc liên kết α-1,3 tạo thành 1 đơn vị agarobiose. Trong khi agaropectin là hỗn hợp dị thể có cấu trúc mạch ngắn, thành phần phân tử tương tự agarose được gắn thêm các liên kết với các gốc –OSO3-, –OCH3, glucuronate, hoặc pyruvate. Agarose có thể thủy phân thành các agarooligosaccharides (AOS) hoặc neoagarooligosaccharides (NAOS) dưới tác dụng của enzyme agarase.

Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thủy phân agar tạo các oligosaccharides có hoạt tính sinh học có một số công dụng hữu ích trong công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm, và mỹ phẩm; thu hồi DNA từ gel agarose; chuẩn bị tế bào trần từ tảo biển đây là vật liệu hữu ích trong các nghiên cứu sinh lý học và tế bào học. Agarase được chia thành hai nhóm: α-agarase (E.158) phân cắt liên kết α-1,3 tạo thành agarooligosaccharide với đơn phân là agarobiose, trong khi β-agarase (E.81) phân cắt liên kết β-1,4 tạo thành neoagarooligosaccharides với đơn phân là neoagarobiose. Cho tới nay agarase được tìm thấy từ rất nhiều nguồn khác nhau bao gồm: nước biển, trầm tích dưới biển, tảo biển, động vật thân mềm dưới biển, nước ngọt và đất. Mặc dù agarase đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nhưng các nghiên cứu trong nước về enzyme này vẫn còn nhiều hạn chế.

Việc nghiên cứu đặc tính agarase nhằm đáp ứng các yêu cầu trong ứng dụng chế biến agar vẫn còn đang mở rộng và đầy hứa hẹn cho các nhà khoa học trên thế giới. Tuy nhiên, hướng nghiên cứu này tại Việt Nam vẫn còn khá mới mẻ, chưa được tập trung khai thác nghiên cứu. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định đặc tính của một số chủng vi khuẩn thủy phân Agar phân lập tại Việt Nam” được lựa chọn tiến hành. Nguyễn Thị Lệ 9 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Mục tiêu của luận văn này là xác định hoạt tính của các enzyme phân giải agar bằng các phương pháp định tính, định lượng, đồng thời khảo sát một số đặc tính cơ bản của vi sinh vật sinh enzyme cụ thể là : - Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào - Đánh giá định tính khả năng phân giải agar - Đánh giá hệ protein và hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di - Xác định hoạt tính enzyme phân giải agar bằng phương pháp DNS Nguyễn Thị Lệ 10 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Cấu trúc agar Agar là loại polysaccharide dị thể có thành phần chính là agarose chiếm khoảng 70%, còn lại là agaropectin. Agarose có cấu trúc mạch thẳng được sắp xếp xen kẽ hai phân tử β- D-galactose và 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 tạo thành 1 đơn vị neoagarobiose hoặc liên kết α-1,3 tạo thành 1 đơn vị agarobiose (Hình 1. Trong khi agaropectin là hỗn hợp dị thể có cấu trúc mạch ngắn, thành phần phân tử tương tự agarose và có thêm các liên kết với các gốc –OSO3-, – OCH3, glucuronate, hoặc pyruvate ở vị trí C2 hoặc C6 của phân tử 3,6-anhydro-α-L- galactose. Đặc tính hóa lý kèm theo là các ứng dụng tương ứng của agar phụ thuộc rất lớn vào tỷ lệ của agarose và agaropectin cũng như thành phần của các nhóm liên kết.

Cấu trúc của agarose. Về khối lượng, agarose có khối lượng phân tử cao trên 100 kDa. Trong khi đó, agaropectin có khối lượng phân tử nhỏ hơn dưới 20 kDa, trong thành phần cấu tạo có chứa sulfate từ 5 đến 8% nên thường không được ứng dụng trong thực phẩm. Tuy nhiên agaropectin là polysaccharide để tạo thành agarose khi thực hiện loại bỏ bớt hàm lượng sulfate trong cấu tạo của agaropectin.

Nồng độ agaropectin cao có ở trong tảo đỏ Gracilaria, Porphyra. Nguồn gốc agar Agar chủ yếu được chiết xuất từ thành tế bào của tảo đỏ Gelidium và Gracilaria. Gelidium là nguồn thu agar tốt nhưng việc nuôi trồng canh tác loại Nguyễn Thị Lệ 11 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học tảo này rất khó khăn, chỉ được trồng ở một số quốc gia và vùng lãnh thổ. Trong khi đó, Gracilaria là nhóm tảo có khả năng nuôi trồng, canh tác dễ dàng và được trồng phổ biến trên thế giới.

Do vậy, Gracilaria trở thành nguồn sản xuất agar quan trọng trên thế giới. Các loại tảo đỏ sản xuất agar. Tính chất hóa lý Agar là một hỗn hợp của agarose và agaropectin với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu ban đầu và quá trình sản xuất. Do vậy tính chất của từng loại agar khác nhau cũng khác nhau; tuy nhiên tất cả các loại agar có một số tính chất lý hóa.

Nguyễn Thị Lệ 12 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học - Tính tan: Agar không tan trong nước lạnh, tan nhẹ trong ethanolamine và tan tốt trong formamide. Ở trạng thái ẩm có thể tan tốt trong nước ở 25ºC, ở trạng thái sấy khô agar chỉ tan trong nước nóng. Agar sẽ đông lại ở 40-50ºC và nóng chảy ở 80- 85ºC. - Khả năng tạo gel: Agar tạo thành gel sau khi được đun nóng và làm lạnh mà không cần bổ sung thêm các tác nhân tạo gel, trong khi carrageenan cần kali hay protein để tạo gel, alginate cần canxi hay các cation hóa trị hai và pectin cần nồng độ đường cao hoặc môi trường axit để tạo gel.

Các phân tử agarose trong agar có sự biến đổi từ cấu trúc cuộn sang cấu trúc xoắn và sau đó các chuỗi xoắn tạo thành một mạng lưới không gian ba chiều nhốt các chất khô bên trong nhờ lượng liên kết hydro rất lớn trong agarose. Khả năng tạo gel và độ bền gel phụ thuộc vào nồng độ agar và phân tử lượng trung bình (phân tử lượng trung bình càng lớn thì gel tạo thành càng bền). Dung dịch có chứa 1,5% agar sẽ tạo gel ở nhiệt độ 32-43ºC và không tan chảy dưới 85ºC. Đây là đặc tính quan trọng của agar so với các tác nhân tạo gel khác.

- Tính chịu nhiệt: Agar có khả năng chịu nhiệt rất tốt, tính chất tạo gel không thay đổi ở nhiệt độ cao hơn 100oC, cho phép khử trùng tốt. - Độ nhớt của agar phụ thuộc vào hàm lượng agaropectin của nguồn nguyên liệu. Nói chung độ nhớt của agar tương đối ổn định ở pH 4,5-9,0. Agar có thể sử dụng tốt trong khoảng pH 5-8.

- Agar có khoảng lưu giữ và tăng cường mùi vị của sản phẩm khi trộn lẫn, có vai trò cố định mùi vị của thực phẩm. - Agar tạo gel không có hương vị và có màu trong suốt nên có thể dễ dàng bổ sung thêm đường, glucose, glycerine,. làm cho thực phẩm có độ sánh hấp dẫn. - Agar có khả năng đảo ngược quá trình tạo gel hóa và tan chảy ở nhiệt độ cao mà không làm thay đổi thuộc tính ban đầu.

Nguyễn Thị Lệ 13 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Nhờ các đặc tính trên, agar thường được sử dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm như: thay thế cho một số đồ ngọt, phô mai chế biến. hoặc làm phụ gia cho các món nướng, bánh kẹo, sản phẩm từ thịt và các sản phẩm sữa. Agar là loại polysaccharide không tiêu hóa được đối với phần lớn các vi sinh vật nên được sử dụng để làm giá thể nuôi cấy vi sinh vật. Ngoài ra, agar đã được thử nghiệm để sản xuất màng sinh học agar- protein đậu nành để tăng cường tính chất hóa lý.

Nó cho thấy khả năng tương thích tốt với protein đậu nành và làm giảm độ hòa tan của màng, cho phép lớp màng này lưu giữ các hoạt chất sinh học. Agar còn được ứng dụng trong ngành dệt, thực phẩm chức năng và một số ứng dụng khác. Nhờ những đặc tính hữu ích trong việc phát triển vật liệu thông minh cho vật liệu composite và ứng dụng hấp phụ, agar được cho là vật liệu đầy hứa hẹn sẽ được khám phá hơn nữa trong tương lai. Nguồn gốc agarase Agarase là enzyme thuộc nhóm glycoside hydrolase có khả năng thủy phân agar tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp.

Agarase được chia làm hai loại enzyme là α-agarase (EC 3.158) phân cắt liên kết α-1,3- glycoside và β-agarase (EC 3.81) phân cắt liên kết β-1,4-glycoside trong nội phân tử agar tạo các oligosaccharide. β-Agarase được tìm thấy phổ biến hơn α-agarase trên cơ sở dữ liệu CaZy. Nguyễn Thị Lệ 14 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 1. Sơ đồ vị trí phân cắt của agarse.

Rất nhiều agarase từ nguồn vi sinh vật biển được phân lập từ nước biển, trầm tích biển, tảo biển và động vật thân mềm dưới biển đã được tinh chế và nghiên cứu đặc tính. Khối lượng phân tử của chúng có sự chênh lệch lớn từ 20 đến 360 kDa. Enzyme nhỏ nhất được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Vibrio sp. AP- 2 từ tảo biển với khối lượng 20 kDa, trong khi enzyme lớn nhất được phát hiện ở Alteromonas agarlyticus GJ1B từ nước biển với khối lượng đạt 360 kDa.

Ở môi trường nước ngọt và trên đất liền, khối lượng phân từ của agarase từ vi khuẩn nước ngọt Cytophaga flevensis đạt khoảng 26 kDa, trong khi các enzyme từ đất có khối lượng lớn hơn nhiều: 100 kDa ở Acinetobacter sp. AGLSL- 1,113 kDa ở Bacillus sp. MK03 và 180 kDa ở Alteromonas sp. Trong đó agarase từ Acinetobacter sp.

AGLSL-1 có hoạt tính đặc hiệu đạt 397 U/mg, cao nhất trong tất cả các enzyme đã công bố trước năm 2010. Cả bốn enzyme này đều thuộc nhóm β-agarase. Tất cả các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp agarase được phân lập chủ yếu là các vi khuẩn gram âm. Hầu như chưa có nghiên cứu báo cáo nào về agarase được sinh tổng hợp từ nấm sợi, nấm men.

Các agarase được phân lập chủ yếu là enzyme ngoại bào; rất ít agarase được phân lập là enzyme nội bào. Nguyễn Thị Lệ 15 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 1. α-agarase α-agarase phân cắt liên kết α-1,3 để tạo các mạch agarooligosaccharide ngắn chứa 3,6-anhydro-L-galactose ở đầu khử và sản phẩm cuối cùng là agarobiose. Hiện nay mới phân lập được hơn 10 enzyme α-agarase từ nước biển và trầm tích dưới biển, các enzyme này đều thuộc họ GH 96 phân cắt agarose tạo sản phẩm cuối là agarotetraose.

Trong đó mới chỉ có 5 α-agarase được nghiên cứu đặc tính, có nguồn gốc từ: (1) Alteromonas agarlyticus GJ1B; (2) Thalassomonas sp. JAMB-A33; (3) Thalassomonas sp. LD5; (4) Catenovulum agarivorans; (5) Catenovulum sediminis WS1-A.