MỞ ĐẦU Vi nấm phát triển trong môi trường khắc nghiệt được quan tâm đặc biệt về mặt công nghệ vì có thể cung cấp nguồn enzyme với đặc tính khác biệt, đáp ứng các yêu cầu công nghệ đặc thù. Enzyme hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH cũng có thể được ứng dụng trong sản xuất nhằm hạn chế nguy cơ tạp nhiễm. Là một nước nông nghiệp, hàng năm công nghiệp chế biến ở Việt Nam tạo ra một nguồn phế phụ phẩm rất lớn và nếu không được sử dụng hợp lý sẽ dẫn tới các vấn đề ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, phần lớn nguồn nguyên liệu này có thể được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bằng công nghệ vi sinh, enzyme.
Nghiên cứu này đề cập tới enzyme sinh ra từ các vi nấm có khả năng phát triển trong điều kiện môi trường axit mạnh (1% H 2SO4) nhằm tìm kiếm các enzyme có khả năng hoạt động ở pH thấp vốn thường gặp trong quá trình xử lý nguyên liệu bằng axit. Ngoài ra, enzyme hoạt động ở pH thấp cũng có thể được ứng dụng trong chăn nuôi do khả năng chống chịu điều kiện axit của dịch dạ dày động vật. Nhằm mục đích nghiên cứu xác định đặc tính hệ enzyme thủy phân lignocellulose được tổng hợp từ các chủng vi nấm chịu axit mạnh trong tự nhiên, nên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose của một số chủng vi nấm chịu axit mạnh phân lập tại Việt Nam”. Đề tài nghiên cứu bao gồm các mục tiêu sau: - Chọn được chủng vi nấm chịu axit mạnh có khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose.
- Xác định hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose. - Xác định hoạt tính enzyme ở các điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau Nguyễn Thị Hòa 8 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi nấm chịu axit và khả năng sinh enzyme của vi nấm chịu axit Các sinh vật nhân chuẩn có khả năng thích nghi cao, có mặt trong nhiều dạng môi trường khắc nghiệt khác nhau và môi trường axit không phải là ngoại lệ. Môi trường axit mạnh thường đi kèm với với các thái cực khắc nghiệt khác như mức dinh dưỡng thấp, nồng độ kim loại độc hại cao và / hoặc nhiệt độ khắc nghiệt.
Môi trường axit có hai nguồn gốc chính, một là liên quan tới hoạt động của núi lửa và một liên quan đến việc khai thác than và kim loại [1]. Trong trường hợp đầu tiên, quá trình oxy hóa sinh học nguyên tố lưu huỳnh từ hoạt động núi lửa tạo ra axit sulfuric bởi vi sinh vật [14] (Hình 1. Trong trường hợp thứ hai, hoạt động khai thác than và khai thác kim loại làm cho khoáng chất chứa lưu huỳnh, dưới sự kết hợp của nước và oxy, tạo điều kiện cho sự tấn công của vi sinh vật [15]. Những địa điểm có chứa khoáng chất pyrit được quan tâm đặc biệt trong bối cảnh này (Hình 1.
Ở môi trường pH thấp, chất oxy hóa chính của khoáng chất này là sắt. FeS2 + 6 Fe3+ → 7 Fe2+ + S2O32 + 6 H+ Fe2+ + 0,25 O2 + H3O+ → Fe3+ + 1,5 H2O Cả hai môi trường sống khác nhau rất nhiều về các đặc điểm hóa lý và hệ sinh thái vi sinh vật của chúng. Các sinh vật ưa axit, đặc biệt là Acidithiobacillus ferrooxidans và Leptospirillum spp., đẩy nhanh tốc độ oxi hóa pyrit đồng thời pH thấp tạo điều kiện cho kim loại hòa tan, vì thế nước có tính axit có xu hướng có nồng độ kim loại nặng cao. Bất chấp những điều kiện môi trường khắc nghiệt này, hầu hết các môi trường axit cho thấy mức độ đa dạng sinh vật nhân chuẩn cao không ngờ, chẳng hạn như Chlamydomonas, Chlorella và Dunaliella thường được tìm thấy trong axit môi trường, cũng như sinh vật nguyên sinh quang hợp Euglena mutabilis [2][3].
Nguyễn Thị Hòa 9 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 1. Các môi trường có tính axit (a)Khu vực địa nhiệt có tính axit Seltun, SW Iceland, (b)Lưu huỳnh nguyên tố hình thành từ khí thoát ra từ núi lửa Soufriere Hills trên Montserrat, Tây Ấn, (c)Ruộng bậc thang hình thành bởi kết tủa sắt ở Río Tinto, Tây Ban Nha, (d)Río Tinto, Tây Ban Nha. Đặc điểm nhóm vi nấm chịu axit Dựa vào đặc tính thích nghi của các chủng nấm trên các môi trường sống khác nhau mà các nhà khoa học đã chọn lọc và đưa ra những tên gọi tương ứng với từng nhóm, đó là nấm chịu axit và nấm ưa axit. Không có sự phân chia rõ ràng giữa nhóm ưa axit và nhóm chịu axit, nhưng người ta thường cho rằng nấm ưa axit là những loại nấm có thể phát triển ở pH 1 và tăng trưởng tối ưu ở pH 3 (hoặc thấp hơn) còn các loài chịu axit là những loài có thể phát triển trong môi trường axit nhưng tối ưu ở pH 3 trở lên [4].
Hầu hết các loại nấm sống trong môi trường có axit nên được coi là chịu axit hơn là ưa axit nghiêm ngặt vì chúng cũng có thể phát triển dưới pH trung tính hoặc thậm chí kiềm [5]. Nhìn chung vi nấm có thể tồn tại ở dải pH rộng (pH từ 1.0) và đã được tìm thấy ở những môi trường axit như suối núi lửa, dòng thải mỏ axit hoặc nước thải công nghiệp có tính axit [5]. Nhiều loài trong số chúng chủ yếu chịu axit, nhưng những loài thực sự ưa axit cũng đã được tìm thấy. Từ một dòng suối chứa nước thải của mỏ axit, 189 loài nấm bao gồm cả nấm men cũng như nấm sợi đã được phân lập [6].
Hai nhóm nấm là Dothideomycetes và Eurotiomycetes đã được phân lập từ nước thải mỏ axit có nồng độ pH 0,8 và nồng độ kim loại cao từ núi Richmond Iron, California [7]. Sự hiện diện của Nguyễn Thị Hòa 10 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Geotrichum sp. và Aspergillus sp. ở mỏ đồng Sar Cheshmeh cũng đã được báo cáo.
Thêm vào đó, gần 100 chủng nấm men đã được phân lập tại lòng chảo Río Tinto, một trong những hệ sinh thái axit lớn nhất được báo cáo cho đến nay. Trong đó có 52% chủng có thể phát triển trên môi trường pH 2,3, chúng thuộc 5 chi thuộc lớp Basidiomycetes (Rhodotorula, Cryptococcus, Tremella, Holtermannia và Mrakia) và 2 chi thuộc lớp Ascomycetes (Candida và Williopsis). Ngoài ra hơn 100 chủng thuộc lớp Hyphomycetes đã được phân lập từ hệ sinh thái Tinto và phần lớn chúng đặc trưng về mặt hình thái. Khoảng 50% chủng nấm sợi được phân lập có thể phát triển trong điều kiện cực kì axit.
Trong số này có đến 19% chủng là thuộc chi Penicillium và phần còn lại được định danh thuộc chi Scytalidium, Bahusakala, Phoma và Heteroconium hoặc nấm sợi không sinh bào tử sẫm màu (có thể là dematiaceous hyphomycetes). Ngoài ra một số được phân lập đã được định danh là những chủng thuộc lớp Ascomycete (Lecythophora, Acremonium) và Zygomycete (Mortierella) [8]. Nguyễn Thị Hòa 11 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Bảng 1. Một số chủng vi nấm chịu axit mạnh đã được công bố STT Loài pH Nguồn gốc phân lập 1 Acidiella bohemica 2.5 Mỏ đá cao lanh với lớp than nâu giàu lưu huỳnh và axit humic 2 Acidiella uranophila <3 Nước có tính axit cao từ mỏ uranium Nước sông và trầm tích có tính axit cao 3 Acidomyces acidophilus 1.0 Đầm lầy than bùn, đầm lầy mỏ khoáng sản, đầm lầy ven biển, và những nơi có tính axit cao 4 Acidomyces 2.5 Khu vực địa nhiệt Krýsúvik, Cộng hòa acidothermus Séc 5 Acidea extrema <3 Đất có tính axit cao 6 Acidothrix acidophila 1.5 Mỏ cao lãnh với lớp than nâu giàu lưu huỳnh lộ ra ngoài, Cộng Hòa Séc 7 Soosiella minima 1.5 Đất có tính axit cao, mỏ cao lãnh/đất sét có lớp than nâu giàu lưu huỳnh lộ ra ngoài 8 Purpureocillium 2.5 Nước có tính axit cao từ sông Río Tinto lilacinum 9 Penicillium dalae 2.5 Nước có tính axit cao từ sông Río Tinto 10 Penicillium 2.5 Nước có tính axit cao từ sông Río Tinto simplicissimum 11 Mucor flavus 3.5 Đất rừng 12 Aspergillus flavus 3.7 Đất, các bãi lầy 13 Aspergillus fumigatus 3.7 Đất, các bãi lầy 14 Aspergillus oryzae 1.0 Đất rừng 15 Aspergillus niger 2.7 Nước hồ có tính axit 16 Aspergillus terreus 2.0 Đất rừng, đầm lầy than bùn 17 Penicillium diversum 3.6 Đầm lầy vân sam, đất 18 Penicillium digitatum 3.0 Đầm lầy vân sam, đất 19 Penicillium verrucosum 2.0 Đầm lầy than bùn, hang động 20 Penicillium variabile 1.0 Đầm lầy tùng bách, đất Nấm chịu axit có hai ưu điểm chính đáng được quan tâm bởi giá trị mà chúng đem lại cho các ứng dụng thực tế.
Đầu tiên, nhóm nấm này có khả năng hoạt động trong môi trường axit và tương tự là các enzyme của chúng. Ưu điểm này đem lại những lợi ích trong ứng dụng công nghiệp. Đầu tiên phải kể đến ứng dụng trong chăn nuôi. Việc bổ sung các enzyme có khả năng thủy phân lignocellulose hoạt động trong môi trường axit dạ dày của động vật làm tăng giá trị dinh dưỡng đối với thức ăn [9].
Tiếp đến là một ứng dụng nữa trong sản xuất ethanol từ vật liệu lignocellulose. Các vật liệu này ban đầu phải trải qua bước tiền xử lý bằng axit trước khi bước vào giai đoạn thủy phân, việc sử dụng Nguyễn Thị Hòa 12 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học các loại enzyme có khả năng hoạt động trong điều kiện axit thấp sẽ làm giảm thiểu chi phí trung hòa. Ưu điểm thứ hai của nấm chịu axit bởi nó có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện axit mạnh làm giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm. Vấn đề thường gặp trong nhiều quy trình công nghệ sinh học như lên men khối hoặc chuyển hóa chất thải thành protein đơn bào là sự xâm nhiễm của các vi sinh vật ngoại lai [10].
Ứng dụng nấm chịu axit cho phép thực hiện các quy trình này ở pH < 3 khi hầu hết các vi sinh vật tạp nhiễm không thể phát triển. Khả năng sinh enzyme của vi nấm chịu axit mạnh Vi nấm chịu axit mạnh rất có tiềm năng về mặt công nghệ sinh học vì có thể sản sinh các hệ enzyme hoạt động bền vững ở các điều kiện khắc nghiệt, các chất chuyển hóa đặc biệt hoặc khai khác trong các quy trình xử lý sinh học tương ứng. Nhìn chung enzyme chịu được các điều kiện khắc nghiệt thu hút sự chú ý lớn bởi tiền năng ứng dụng của nó. Các chủng Acidomyces acidophilus đã được tiến hành kiểm tra khả năng sinh các enzyme amylase, lipase và kết quả cho thấy đa số các chủng có khả năng sinh enzyme thậm chí ở môi trường có pH 3.
Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng chủng Acidomyces sp.