CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Hệ gen của vi khuẩn 1. Định nghĩa hệ gen của vi khuẩn Hệ gen (genome) được định nghĩa là toàn bộ vật liệu di truyền của của một sinh vật, bao gồm tất cả các gen cùng với các trình tự ADN (Acid deoxyribonucleic) không mã hoá [71]. Mỗi hệ gen chứa tất cả những thông tin cần thiết để tạo nên, duy trì sự sống của một sinh vật và di truyền sang thế hệ sau.
Vi khuẩn là một sinh vật nhân sơ với cấu tạo nhân đơn giản và chưa có màng nhân. Vi khuẩn thường có một nhiễm sắc thể, được cấu tạo bởi một phân tử ADN xoắn kép dạng vòng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có ADN ngoài nhiễm sắc thể như plasmid và transposon. Nhiễm sắc thể và ADN ngoài nhiễm sắc thể tạo nên hệ gen của vi khuẩn [71].
Đặc điểm hệ gen vi khuẩn Kích thước hệ gen vi khuẩn thường nằm trong khoảng 1-8 Mbp (triệu cặp base) [55]. Các gen trên chuỗi ADN của vi khuẩn được sắp xếp chặt chẽ, mật độ gen cao, nên có mối tương quan giữa kích thước hệ gen và số lượng gen trong đó [25]. Vi khuẩn thường có 1500 – 7500 gen trong một hệ gen [71]. Hệ gen vi khuẩn chứa gen mã hoá protein, gen mã hóa ARN (Acid ribonucleic) và một số trình tự điều hoà không phiên mã như promoter [71].
Các gen mã hoá protein chiếm tới 80-90% trình tự ADN của vi khuẩn [25]. Các gen này có độ dài trung bình khoảng 1000 bp (cặp base) và không bị gián đoạn bởi các đoạn intron [71]. Sự đa dạng trong hệ gen vi khuẩn Các chủng vi khuẩn thuộc cùng một loài có thể khác nhau về thành phần các gen trong hệ gen [45]. Rasko và cộng sự (2008) đã tiến hành phân tích hệ gen của 17 chủng E.
Kết quả cho thấy, trung bình mỗi chủng có 5020 gen, trong đó chỉ có khoảng 2200 gen có mặt ở tất cả các chủng. Tổng cộng có tới 13000 gen xuất hiện ở 17 chủng E. coli, trong đó phần lớn là những gen chưa xác định. Số gen xuất hiện ở cả một loài có thể lớn hơn nhiều lần số gen trong một hệ gen đơn độc [11], từ đó giúp vi khuẩn tăng khả năng trao đổi chất và thích nghi với các môi trường sinh thái [59].
Nguyên nhân dẫn tới sự đa dạng trong hệ gen vi khuẩn là quá trình chuyển gen ngang (horizontal gene transfer) và quá trình lặp gen (gene duplication) [37]. 2 Một gen có thể được lặp lại ở một vị trí khác trên cùng nhiễm sắc thể. Gen được lặp lại thường sẽ giống hệt bản gốc. Nếu việc có nhiều bản sao của cùng một gen không đem lại lợi ích trong chọn lọc, những bản sao dư thừa sẽ nhanh chóng mất đi.
Trong trường hợp các bản sao được giữ lại, chúng sẽ tích luỹ đột biến và hình thành chức năng mới [1], [37], [64]. Chuyển gen ngang là quá trình truyền thông tin di truyền từ cá thể này sang cá thể khác thuộc cùng một loài, hoặc từ loài này sang loài khác. Chuyển gen ngang khác với chuyển gen theo chiều dọc từ bố mẹ cho con cái. Quá trình chuyển gen ngang bao gồm 3 cơ chế: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.
Biến nạp là quá trình tế bào tiếp nhận vật chất di truyền từ môi trường xung quanh. Tải nạp là quá trình ADN được chuyển từ tế bào này sang tế bào khác thông qua virus. Tiếp hợp là quá trình hai tế bào liên kết với nhau tạm thời và ADN được chuyển trực tiếp từ tế bào này sang tế bào khác [12]. Chuyển gen ngang xảy ra phổ biến ở vi khuẩn, và quá trình này làm thay đổi hệ gen của chúng [24].
Mặc dù cả lặp gen và chuyển gen ngang đều có vai trò quan trọng, chuyển gen ngang được chứng minh là nguyên nhân chính dẫn tới sự đa dạng trong hệ gen vi khuẩn [37]. Tập hợp hệ gen của vi khuẩn 1. Các khái niệm Trình tự toàn bộ hệ gen của một chủng không phản ánh hết sự đa dạng trong thành phần hệ gen một loài [45]. Một gen xuất hiện ở chủng vi khuẩn này nhưng có thể không xuất hiện ở những chủng vi khuẩn khác.
Từ đó, người ta đặt ra khái niệm tập hợp hệ gen. Tập hợp hệ gen (pan-genome) được định nghĩa là tập hợp tất cả các gen thuộc một nhóm các sinh vật có mối quan hệ gần gũi với nhau, ví dụ: nhiều chủng, một loài, một nhóm loài… [45]. Khái niệm tập hợp hệ gen lần đầu được sử dụng bởi Tettelin (2005) để mô tả tập hợp các gen của một số chủng Streptococcus agalactiae [63]. Hiện nay, khái niệm này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền phân tử, phân loại vi khuẩn, cơ chế kháng kháng sinh, dịch tễ học phân tử, phát triển vaccin, … [54].
Tập hợp hệ gen bao gồm hệ gen cốt lõi (core genome), hệ gen phụ (accessory genome) và các gen đặc trưng cho chủng (strain-specific genes). Hệ gen cốt lõi bao gồm các gen có mặt ở tất cả các chủng được phân tích. Phần lớn các gen này có vai trò quan 3 trọng cho sự tồn tại của vi khuẩn. Tuy nhiên, một số gen trong hệ gen cốt lõi cũng liên quan tới khả năng gây bệnh hay độc lực vi khuẩn.
Hệ gen phụ bao gồm các gen xuất hiện ở hai hay nhiều chủng nhưng không phải tất cả các chủng trong cùng một loài. Gen đặc trưng cho chủng chỉ xuất hiện ở một chủng nào đó. Thông thường, hệ gen phụ và các gen đặc trưng cho chủng được hình thành nhờ quá trình chuyển gen ngang và quá trình lặp gen. Các gen này thường liên quan tới cơ chế kháng thuốc, độc lực hoặc khả năng thích nghi với môi trường [45].
Phân loại tập hợp hệ gen vi khuẩn Tập hợp hệ gen có thể được phân loại thành tập hợp hệ gen đóng hoặc tập hợp hệ gen mở dựa vào khả năng xuất hiện gen mới khi chủng mới được thêm vào phân tích. Với tập hợp hệ gen mở, số lượng gen sẽ tiếp tục tăng lên khi có thêm chủng mới. Ngược lại, với tập hợp hệ gen đóng, số lượng gen là hữu hạn [45]. Nhiều tác giả cho rằng, những vi khuẩn sống trong môi trường ổn định thường có tập hợp hệ gen đóng.
Ngược lại, những vi khuẩn sống tự do trong môi trường phức tạp thường có sự đa dạng hơn trong hệ gen để có thể thích nghi với những điều kiện sống khác nhau [45]. Phân tích tập hợp hệ gen vi khuẩn Phân tích tập hợp hệ gen là quá trình xác định tất cả các gen xuất hiện ở một nhóm các sinh vật có mối quan hệ gần gũi với nhau, xác định những gen nào xuất hiện ở tất cả các chủng, những gen nào đặc trưng cho một số chủng nhất định. Phân tích này gồm 3 bước chính: (1) chú thích hệ gen, (2) phân cụm các trình tự tương đồng và (3) các phân tích bổ sung [45]. Cụ thể, trước khi tiến hành phân tích tập hợp hệ gen, những gen có mặt trong mỗi chủng cần được xác định thông qua chú thích hệ gen [45].
Chú thích hệ gen là quá trình xác định trình tự, vị trí, tên và sản phẩm mã hoá tương ứng của mỗi gen trên hệ gen [33]. Trong số các gen thu được từ các chủng, có những gen có cùng nguồn gốc từ một gen cổ xưa (ancestral gene). Do phát sinh từ cùng một gen, các gen này có trình tự rất giống nhau, được gọi là các trình tự tương đồng (homologous sequence) [1]. Bản chất của phân tích tập hợp hệ gen là quá trình nhóm những trình tự tương đồng về cùng một cụm [54].
Mỗi cụm sẽ tương ứng với một gen. Những gen nào xuất hiện ở tất cả các chủng sẽ thuộc hệ gen cốt lõi. Những gen xuất hiện ở hai hay nhiều chủng nhưng không phải tất cả sẽ thuộc hệ gen phụ. Còn những gen chỉ xuất hiện ở một chủng sẽ là gen đặc trưng 4 cho chủng.
Ngoài ra, kết quả của phân tích tập hợp hệ gen có thể được sử dụng trong một số phân tích bổ sung khác. Một phân tích bổ sung phổ biến là gióng hàng nhiều trình tự (multiple sequence alignment) từng cụm gen. Chú thích hệ gen vi khuẩn được thực hiện bởi các công cụ như RAST [2], Prokka [33] hay PGAP [62]. Phân cụm các trình tự tương đồng và các phân tích bổ sung được thực hiện bởi các công cụ phân tích tập hợp hệ gen như Roary [26], PIRATE [3], Panaroo [36] và PanX [47].
Ứng dụng của phân tích tập hợp hệ gen vi khuẩn Phân tích tập hợp hệ gen là bước đầu tiên trong nhiều nghiên cứu quan trọng về con đường lây truyền, cơ chế kháng kháng sinh hay phát triển vaccin. Kết quả những phân tích phía sau trong những nghiên cứu này phụ thuộc vào kết quả của phân tích tập hợp hệ gen ban đầu. Phân tích tập hợp hệ gen đặc biệt được sử dụng nhiều trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh [45]. Nội dung dưới đây sẽ trình bày một số ứng dụng của phân tích tập hợp hệ gen vi khuẩn.
Xác định con đường lây truyền và đặc điểm các dòng vi khuẩn gây bệnh Domman và cộng sự (2017) đã sử dụng phân tích tập hợp hệ gen để nghiên cứu dịch tả ở 14 nước Mỹ Latin [48]. Phân tích tập hợp hệ gen được thực hiện trên 148 mẫu Vibrio cholerae trong giai đoạn 40 năm. Từ hệ gen cốt lõi bao gồm 2105 gen, cây phát sinh loài (phylogenetics tree) được xây dựng, từ đó cho thấy con đường tiến hoá và xác định được các dòng vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu này cung cấp thông tin về cách các tác nhân gây bệnh di chuyển theo không gian và thời gian, từ đó đề ra các chiến lược để ngăn chặn các vụ dịch trong tương lai.
Phân tích tập hợp hệ gen cũng được sử dụng trong điều tra vụ dịch ở bệnh viện của các chủng Klebsiella pneumoniae đa kháng thuốc [43]. pneumoniae từ một bệnh viện ở Nepal được thu thập và giải trình tự toàn bộ hệ gen. Phân tích tập hợp hệ gen kết hợp với xây dựng cây phát sinh loài giúp xác định được 2 dòng vi khuẩn chính. Thành phần hệ gen của 2 dòng vi khuẩn này được so sánh để xác định những đặc điểm di truyền đặc trưng cho từng dòng.
Kết quả cho thấy, dòng vi khuẩn thứ nhất mang một lượng lớn các yếu tố độc lực và gen kháng kháng sinh. Đây có thể là yếu tố giúp dòng vi khuẩn này lan truyền trong bệnh viện. Việc xác định đặc điểm di truyền đặc 5 trưng cho từng dòng còn giúp tìm ra chỉ dấu để phân biệt các chủng phân lập thuộc dòng vi khuẩn trên với các chủng phân lập khác ở trong cùng bệnh viện.