CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 10 1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI: Cây Mai Dương (Mimosa pigra L.) còn gọi là Trinh nữ nhọn, Mắc cỡ Mỹ, Ngưu Ma Vương; thuộc chi Mimosa, họ phụ Mimosoideae, họ Fabaceae (họ Đậu), có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Tại Việt Nam, Mai Dương được báo cáo xuất hiện lần đầu tiên tại huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An vào năm 1979. Cây thân cứng cao 2 - 3m, lá khi chạm vào thì xếp lại.
Sóng lá mang một gai đứng cao 1,5cm giữa mỗi cặp thứ diệp. Hoa nhỏ có màu tím hoặc hồng. Chùm trái to, có lông hoe dày.[1] Cây Mai dương hiện nằm trong nhóm 100 cây xâm thực nguy hiểm nhất trên thế giới. Hiện nay, cây Mai dương đã và đang xâm lấn nhiều vùng miền trên đất nước ta, gây ra mối đe dọa nghiêm trọng lên các hệ sinh thái.
Cây có sức sống mạnh mẽ và khả năng lây lan phát tán dễ dàng, cộng thêm điều kiện khí hậu địa lí của đất nước ta quá thuận lợi cho sự phát triển của cây, vì thế việc ngăn chặn sự phát triển và tiêu diệt cây Mai dương là một chủ đề đang được quan tâm. Hiện nay có 4 biện pháp kiểm soát sự xâm thực của cây Mai dương: biện pháp vật lý-cơ học, biện pháp hóa học, biện pháp sinh môi và biện pháp sinh học. Trong các biện pháp trên thì cách tiêu diệt cây Mai dương hiệu quả nhất là nhổ bỏ cây con, đào gốc rễ, phơi và đốt toàn cây. Tuy nhiên, việc làm này đòi hỏi chi phí tốn kém (chi phí nhổ tay tùy thuộc vào chiều cao, độ tuổi của cây và mật độ che phủ: cây dưới hai tháng tuổi và có chiều cao thấp hơn 100 cm tốn khoảng 150 USD/ha, trong khi cây già hơn thì chi phí trên 200 USD/ha), mặt khác sinh khối thải ra hiện vẫn chưa có cách xử lí hiệu quả, gây ô nhiễm môi trường và gây lãng phí.[4] TT R1 R2 R3 R4 TT R1 R2 TT R1 R2 R3 R4 1 OH H OH OH 12 H H 15 H H OH H 2 OH H O-α-L-rhamnopyranosyl OH 16 H H OH OMe 3 H H O-α-L-rhamnopyranosyl OH α-L-rhamnopyranosyl- (1→2)-β-D-glucopyranosyl- 17 H OH OH OH 4 OH H O-β-D-glucopyranosyl OH 13 β-Z,E-4-methoxycinnamoyloxy (1→2)-β-D-glucopyranosyl- 18 Me OH OH OH 5 H H O-β-D-glucopyranosyl OH (1→4)-α-L-arabinopyranosyl- 19 Me OH Me OH 6 OH H O-α-L-rhamnopyranosyl O-α-L-rhamnopyranosyl (1→3)-β-D-xylopyranosyl 7 H H O-α-L-rhamnopyranosyl O-α-L-rhamnopyranosyl α-L-rhamnopyranosyl- 8 OH H O-β-rutinosyl OH (1→2)-β-D-glucopyranosyl- 9 OH H O-β-D-galactopyranosyl OH 14 β-E-cinnamoyloxy (1→2)-β-D-glucopyranosyl- 10 OH H H O-α-L-arabinopyranosyl (1→4)-α-L-arabinopyranosyl- 11 OH OH O-α-L-rhamnopyranosyl OH (1→3)-β-D-xylopyranosyl Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất có trong cây Mai dương Trong một số nghiên cứu gần đây của nhóm chúng tôi về thành phần hoá học[5-7] và khảo sát sơ bộ quy trình định lượng và tinh chế acid gallic và các dẫn xuất trong lá cây Mai dương,[8] chúng tôi đã cô lập được khá nhiều hợp chất có khung sườn flavonoid, lignan, neolignan và một số phenolic đơn giản, đặc biệt chúng tôi đã thu được một lượng lớn acid gallic và methyl gallate từ lá cây Mai dương (Hình 1), bên cạnh đó chúng tôi cũng đã có một số kết quả sơ bộ rất khả quan về hệ dung môi ly trích tối ưu (MeOH:H2O=70:30) và tổng hàm lượng của acid gallic và methyl gallate tự do (~2.61% khối lượng lá cây khô).
Đồng thời, chúng tôi cũng đã tiến 12 hành một số bước chiết xuất-tinh chế cơ bản, và kết quả thu được là sản phẩm acid gallic có độ tinh khiết cao, được xác định bằng sắc kí lớp mỏng.[8] Acid gallic và các dẫn xuất của nó có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc dạng kết hợp. Theo Yin-Yin Ow và Ieva Stupans (2003), các dẫn xuất alkyl gallate (như propyl gallate-E310, octyl gallate-E311, dodecyl gallate-E312) được sử dụng rộng rãi như là một phụ gia chống oxy hóa dùng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Thêm vào đó acid gallic còn là nguồn nguyên liệu chính trong sản xuất mực in, màu vẽ và màu tráng ảnh. Acid gallic và dẫn xuất của chúng có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn (đặc biệt là đối với dòng tế bào gram dương).[9] Acid gallic gây ra “hiện tượng tự chết” và ngăn chặn sự di căn của một số dòng tế bào ung thư xương (SW1353), tụy (MIA PaCa-2) và vú (MCF-7), mặt khác bảo vệ các tế bào bình thường khác trong cơ thể.[9-12] Acid gallic và các dẫn xuất của chúng còn là các nhân tố chống đột biến gen, chống ung thư.[9] Theo Jayaraman Jayamani (2014), Jason Jerome D'souza (2014) và Daglia Maria (2014), acid gallic có tiềm năng chống bệnh đái tháo đường,[13-14] cũng như bảo vệ các tế bào thần kinh.[15] Ngoài ra, acid gallic còn là một hợp chất khá thông dụng có trong nhiều loài thực vật khác nhau, nên nhu cầu định lượng acid gallic là rất nhiều vì thế acid gallic được sử dụng như là một chất chuẩn dùng trong phân tích định lượng.[20] Với những thông tin có được như trên chúng tôi thấy rằng acid gallic và các dẫn xuất của nó là các hợp chất có những hoạt tính sinh học đa dạng và là một tiền chất quan trọng trong tổng hợp hóa dược, góp phần tạo ra được những hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh vì thế nhu cầu sử dụng và tiêu thụ acid gallic trong thực tế là rất lớn.
Hiện nay, nguồn cung cấp acid gallic trên thị trường ngoài nguồn gốc từ tổng hợp vẫn có một lượng không nhỏ được lấy từ thiên nhiên. Theo một số tìm kiếm sơ bộ chúng tôi nhận thấy rằng có khá nhiều doanh nghiệp hóa chất của Trung Quốc cung cấp mặt hàng acid gallic có nguồn gốc từ thiên nhiên (đa phần là cô lập từ Gallnut hoặc Galla chinensis), về mặt giá cả của các sản phẩm này thì giao động khá nhiều trong khoảng 10-250 USD/1 kg, vì phụ thuộc vào chất lượng sản phẩm (theo tiêu chuẩn công nghiệp, thực phẩm hay dược phẩm…).[21] Ngoài ra, một số hãng hóa chất lớn và nổi tiếng trên thế giới cũng có cung cấp các sản phẩm acid gallic có độ tinh khiết cao 98-99% phục vụ cho mục đích làm tác chất trong tổng hợp hữu cơ hoặc làm chất chuẩn trong phân tích định lượng (Sigma-Aldrich, 172 USD/100 g; Merck, 43.3 USD/25 g; Fisher Scientific, 98 USD/250 g).[22-24] Hiện nay trên thế giới cũng đã có khá nhiều nghiên cứu về định lượng acid gallic trong một số loài thực vật khác nhau bằng phương pháp HPLC và HPTLC,[25- 14 27] Cũng có một số nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện cũng như phương pháp ly trích acid gallic, các nghiên cứu này đưa ra các đánh giá về thời gian, nhiệt độ, dung môi ly trích đồng thời cũng khảo sát các phương pháp ly trích khác nhau như: ly trích cổ điển bằng đun soxhlet, ly trích dưới sự hỗ trợ của siêu âm và vi sóng.[28-29] Ngoài ra, các nghiên cứu về quy trình ly trích và tinh chế acid gallic từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên thì khá ít và cũng đã có từ khá lâu, đặc biệt chưa có một nghiên cứu nào sử dụng đối tượng thực vật là cây Mai dương (M. Trong các nghiên cứu này các tác giả đã dẫn ra một số quy trình trích nóng để thủy phân tannin có trong mẫu thực vật với một số hỗn hợp của các loại dung môi hữu cơ (một số alcohol, ketone), acid vô cơ (HCl, H2SO4…), base vô cơ (NaOH, KOH…) và nước.[30-32] Ngoài ra, còn có thể sử dụng phương pháp lên men bằng enzyme tannase (từ Penicilium chrysogenum WH-3 và Aspergillus niger) để thủy phân các hợp chất tannin.[32-33] Kết hợp thêm một số bước làm sạch (lóng với dung môi hữu cơ hoặc dùng các chất đông tụ, keo tụ và than hoạt tính), và một số lần kết tinh lại sau cùng sẽ thu được acid gallic tinh.[30-32] Các quy trình định lượng thì mô hình chung không có gì đặc biệt so với các phương pháp định lượng thông thường khác, và trong đề tài này chúng tôi cũng sẽ tuân theo các bước tương tự tuy nhiên chắc chắn sẽ có một số thay đổi về mặt xử lý mẫu, hệ dung môi giải ly, tốc độ dòng, nhiệt độ cột…để phù hợp với từng mẫu thực nghiệm cụ thể. Các nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện ly trích acid gallic đã khảo sát tương đối đầy đủ các yếu tố (phương pháp, nhiệt độ, thời gian và dung môi) tuy nhiên sử dụng các đối tượng mẫu thực vật khác.
Về mặt phương pháp ly trích kết quả rút ra rằng ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng là hiệu quả nhất về thời gian cũng 15 như hiệu suất.[28] Tuy nhiên chúng ta khó có thể áp dụng vì cần các thiết bị tương đối đắt tiền và phức tạp, khó áp dụng rộng rãi được như phương pháp trích soxhlet hay đun hoàn lưu với bình cầu. Các nghiên cứu về quá trình điều chế acid gallic đã sử dụng những hóa chất như acid và base vô cơ hoặc enzyme tannase để thực hiện thủy phân tannin nhằm thu được sản phẩm acid gallic thô, phương pháp này hiệu quả hơn là phương pháp ly trích với hỗn hợp giữa các dung môi hữu cơ và nước. Bởi vì khi sử dụng acid, base hay enzyme thì hầu hết các tannin sẽ bị thủy phân để tạo ra acid gallic vì thế hiệu suất thu sản phẩm sẽ cao hơn (còn hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước chỉ ly trích được các dạng acid gallic hay methyl gallate tự do và một phần tannin; đồng thời nếu quá trình thủy phân các tannin có xảy ra trong môi trường này thì cũng không quá hiệu quả). Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme lại không đáp ứng được hiệu quả kinh tế vì giá thành khá cao.
Việc sử dụng acid hay base vô cơ ngay trong quá trình ly trích ban đầu thì thích hợp cho các quá trình công nghiệp tuy nhiên cần phải có hệ thống thiết bị khá phức tạp (môi trường ly trích trong khí trơ, thiết bị chuyên dụng); các loại hóa chất (NaOH, HCl, chất ngăn quá trình oxy hóa, chất đông tụ, keo tụ, trợ lọc, trợ lắng…) sử dụng với lượng lớn, khá độc hại, nguy hiểm, ăn mòn cao (nên cần một hệ thống phản ứng khá phức tạp) và có khả năng ô nhiễm môi trường (vì sử dụng nồng độ cao); và cần một lượng hóa chất để trung hòa kết hợp quá trình xử lý phức tạp trước khi thải ra môi trường, mặt khác các hóa chất này khó có thể thu hồi để tái sử dụng. Nếu sử dụng các hỗn hợp giữa dung môi hữu cơ và nước kết hợp đun hoàn lưu để ly trích ban đầu thì chúng ta có thể dễ dàng thu hồi dung môi này để dùng cho các lần kế tiếp bằng phương pháp cô quay. 16 Với tất cả những lí do nêu trên chúng tôi thấy rằng có thể tận dụng nguồn sinh khối của cây Mai dương để thu acid gallic.