Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới cận xích đạo và là một trong những trung tâm đa dạng sinh học lớn trên thế giới, với hơn 5.117 loài và dưới loài cây thuốc thuộc 1.823 chi và 360 họ thực vật có mạch đã được ghi nhận. Mặc dù nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, phần lớn các loài dược liệu bản địa vẫn chỉ được khai thác dựa trên kinh nghiệm dân gian hoặc lý luận y học cổ truyền mà chưa được làm sáng tỏ đầy đủ về thành phần hóa học cũng như bằng chứng dược lý học hiện đại. Xu hướng phát triển thuốc và hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn gốc tự nhiên đặt ra yêu cầu cấp thiết phải nghiên cứu chuyên sâu về mặt hóa thực vật đối với các loài tiềm năng.

Cây Thành ngạnh nam có tên khoa học là Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume, thuộc họ Ban (Hypericaceae). Loài này phân bố tại nhiều tỉnh thành ở Việt Nam như Sơn La, Quảng Ninh, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Bắc Giang, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Ninh Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Kon Tum, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Dương và Đồng Nai. Trong y học dân gian, bộ phận trên mặt đất và vỏ rễ của cây thường được sử dụng nhằm chữa bí tiểu, bệnh lậu, viêm ruột, tiêu chảy, đau dạ dày, hoa mắt, chóng mặt, dùng làm thuốc bổ máu và trợ tiêu hóa cho phụ nữ sau sinh. Các công bố quốc tế ghi nhận chi Cratoxylum chứa nguồn dẫn chất xanthon phong phú với nhiều hoạt tính sinh học giá trị như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư và hạ đường huyết. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình khảo sát chuyên sâu về thành phần hóa học của loài Cratoxylum cochinchinense còn rất hạn chế.

Nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa thực vật của cây thuốc này tại Việt Nam, đề tài đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Định tính được các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học từ bộ phận trên mặt đất (thân, cành, lá) của cây Thành ngạnh nam.
  2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ bộ phận trên mặt đất (thân, cành, lá) của cây Thành ngạnh nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Bộ phận trên mặt đất (bao gồm thân, cành, lá) của cây Thành ngạnh nam (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume, họ Hypericaceae).
  • Phạm vi không gian: Dược liệu được thu hái tự nhiên tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước vào tháng 07 năm 2023. Mẫu được giám định tên khoa học bởi Trung tâm Tài nguyên Dược liệu thuộc Viện Dược liệu, mã số tiêu bản lưu trữ là DV - N14.
  • Phạm vi thời gian và thực nghiệm: Khóa luận hoàn thành vào tháng 05 năm 2024; các nội dung chiết tách, sắc ký và đo phổ được triển khai tại Bộ môn Dược liệu (Trường Đại học Dược Hà Nội), Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn (Viện Dược liệu) và Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại thực vật

Hệ thống phân loại thực vật áp dụng trong khóa luận dựa trên hai cơ sở chính:

  • Hệ thống phân loại Armen Takhtajan (2009): Chi Cratoxylum Blume thuộc ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), phân lớp Sổ (Dilleniidae), bộ Hypericales, họ Ban (Hypericaceae), tông Cratoxyleae.
  • Hệ thống phân loại phân tử APG IV (2016): Chi Cratoxylum Blume thuộc nhánh Angiosperm, nhánh Eudicots, nhánh Rosids, bộ Sơ ri (Malpighiales), họ Ban (Hypericaceae).

Theo cơ sở dữ liệu Plants of the World Online (tính đến tháng 12/2023), chi Cratoxylum gồm 7 loài được công nhận: C. arborescens, C. cochinchinense, C. formosum, C. glaucum, C. maingayi, C. neriifolium, và C. sumatranum. Về mặt hóa học thực vật, các loài thuộc chi này đặc trưng bởi nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp xanthon (chiếm hơn 200 cấu trúc trong tổng số trên 270 hợp chất đã công bố), cùng với anthraquinon, flavonoid, benzophenon, triterpenoid và tinh dầu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng chuỗi phương pháp thực nghiệm hóa thực vật kinh điển kết hợp các kỹ thuật phổ hiện đại:

  • Phương pháp định tính hóa học ống nghiệm: Phân tích sơ bộ 14 nhóm hoạt chất thường gặp bằng các thuốc thử đặc trưng (thuốc thử Diazo, phản ứng Cyanidin, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 10%, phản ứng tạo bọt, phản ứng Salkowski, phản ứng Borntraeger, thuốc thử Fehling, thuốc thử Lugol, thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Baljet, Legal) theo quy chuẩn Dược điển Việt Nam V và tài liệu chuyên ngành.
  • Phương pháp chiết xuất: Sử dụng kỹ thuật ngâm nóng với dung môi ethanol 70% ở tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/8 (kg/L), chiết hồi lưu 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Dịch chiết gộp được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên hệ thống cô quay chân không Buchi để thu cao tổng.
  • Phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng: Phân tán cao tổng trong nước nóng, sau đó chiết phân đoạn lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan và ethyl acetat (tỷ lệ 1:1 v/v, lặp lại 3 lần) nhằm phân chia nhóm chất theo độ phân cực.
  • Phương pháp sắc ký:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng silica gel pha thuận F254 và pha đảo RP-18 F254 S (Merck) để khảo sát hệ dung môi, theo dõi quá trình rửa giải và gộp phân đoạn; phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm và thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol gia nhiệt.
    • Sắc ký cột cổ điển (CC): Tách phân đoạn cao ethyl acetat qua cột silica gel pha thuận (cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck) và tinh chế tiếp bằng cột silica gel pha đảo RP-C18 (cỡ hạt 75 μm, YMC) với các hệ dung môi rửa giải gradient.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Dựa trên các đặc tính cảm quan, độ tan, nhiệt độ nóng chảy và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D bao gồm phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC trên thiết bị Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (đo tại tần số 500 MHz hoặc 600 MHz đối với 1H, 125 MHz hoặc 150 MHz đối với 13C, sử dụng dung môi deuteri hóa CD3OD). Dữ liệu phổ thực nghiệm được đối chiếu trực tiếp với các tài liệu khoa học quốc tế đã công bố.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến chi Cratoxylum Blume nói chung và loài Thành ngạnh nam (Cratoxylum cochinchinense) nói riêng:

  • Đặc điểm thực vật và sinh thái: Tên chi xuất phát từ tiếng Hy Lạp (kratos: sức mạnh, xylon: gỗ). Cây Thành ngạnh nam là cây gỗ cao 10 - 15 m, có gai, vỏ nâu vàng hoặc xám trắng; hoa màu đỏ điều, cánh hoa hẹp dài 9 mm; quả nang hình trứng dài 12 mm, chứa nhiều hạt có cánh dài 8 mm. Cây ưa sáng, mọc rải rác ở đồi hoang, nương rẫy cũ, ra hoa vào tháng 5 - 7.
  • Thành phần hóa học của cây Thành ngạnh nam: Hơn 190 hợp chất đã được phân lập từ loài này, trong đó nhóm xanthon chiếm ưu thế tuyệt đối (>150 dẫn chất). Tinh dầu từ lá và cành gồm 67 hợp chất được định danh qua GC/MS, trong đó hydrocarbon sesquiterpen chiếm 60,2% (nổi bật là bicyclogermacren 18,4%, $\beta$-caryophyllen 16,0%) và hydrocarbon monoterpen chiếm 20,2% (gồm $\beta$-myrcen 7,1%, sabinen 2,5%, (E)-$\beta$-ocimen 2,4%).
  • Dược lý sinh học của chi và loài: Các công bố quốc tế ghi nhận cao chiết và các hợp chất tinh khiết có hoạt tính gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư (HeLa, MCF-7, NCI-H187, HepG2, HT-29, KB, A549), kháng các chủng vi khuẩn gram dương và trực khuẩn kháng thuốc (MRSA, VRE, P. aeruginosa), ức chế nấm Candida albicans, kháng viêm thông qua cơ chế ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 và yếu tố phiên mã NF-$\kappa$B, ức chế enzyme PTP1B và $\alpha$-glucosidase liên quan đến bệnh đái tháo đường, cũng như ức chế enzyme phiên mã ngược HIV-1 RT.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguyên vật liệu, hóa chất, trang thiết bị và quy trình thao tác chuẩn:

  • Mẫu nghiên cứu: 8 kg bộ phận trên mặt đất (thân, cành, lá) khô, độ ẩm ban đầu 5%, thu hái tại Bù Gia Mập (Bình Phước).
  • Trang thiết bị: Máy đo phổ Bruker AM500 FT-NMR, hệ thống cất quay Buchi (Rotavapor R-124, R-210, R-220 Pro 20L), máy đo độ ẩm MB 25 Ohaus, cân phân tích Precisa XT 220A (sai số 0,1 mg), đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng.
  • Quy trình chiết xuất và phân lập: Trình bày chi tiết từng bước chuẩn bị 3 dịch chiết phục vụ định tính (n-hexan, ethanol 90%, nước); quy trình ngâm nóng 8 kg dược liệu với ethanol 70% (3 lần $\times$ 64 L, 3 giờ/lần); quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng thu các cao phân đoạn; và quy trình nạp mẫu, chọn pha tĩnh, rửa giải qua sắc ký cột hở pha thuận và pha đảo.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu được từ thực nghiệm và các phân tích học thuật:

  • Kết quả định tính hóa thực vật: Thực nghiệm với 14 nhóm phản ứng hóa học cho thấy mẫu dược liệu phản ứng dương tính rõ rệt với 7 nhóm chất và âm tính với 7 nhóm chất.
STT Nhóm chất khảo sát Thuốc thử / Phản ứng thực hiện Hiện tượng quan sát Kết luận
1 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc Không có vết mờ Âm tính (-)
2 Carotenoid Tác dụng với H2SO4 đặc Không xuất hiện màu xanh ve Âm tính (-)
3 Phytosterol Phản ứng Liebermann - Burchardt Không có vòng màu tím đỏ Âm tính (-)
4 Saponin Phản ứng tạo bọt; Phản ứng Salkowski Bọt bền > 10 phút; cột bọt kiềm = acid Dương tính (++) (Saponin triterpenoid)
5 Coumarin Mở - đóng vòng lacton; vi thăng hoa; Diazo Dung dịch trong/đục theo pH; màu đỏ gạch Dương tính (++)
6 Flavonoid Cyanidin (Mg/HCl); FeCl3 5%; kiềm 10% Dung dịch đỏ tím; xanh đen; tăng màu vàng Dương tính (++)
7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 Không sủi bọt khí Âm tính (-)
8 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin Không chuyển màu tím Âm tính (-)
9 Tanin FeCl3 5%; Chì acetat 10%; Gelatin 1% Tủa xanh đen; tủa bông; tủa trắng Dương tính (++)
10 Đường khử tự do Thuốc thử Fehling A và B gia nhiệt Xuất hiện tủa đỏ gạch Cu2O Dương tính (++)
11 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol Màu đậm hơn mẫu đối chứng Dương tính (++)
12 Anthranoid Phản ứng Borntraeger Lớp kiềm KOH có màu đỏ Dương tính (+)
13 Alcaloid Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat Không xuất hiện tủa Âm tính (-)
14 Glycosid tim Liebermann - Burchardt, Baljet, Legal Không đổi màu đặc trưng Âm tính (-)

  • Kết quả chiết xuất và phân đoạn:

    • Từ 8 kg dược liệu ban đầu, quá trình ngâm nóng bằng ethanol 70% thu được 525 g cao tổng khô (hiệu suất chiết đạt 5,56%, độ ẩm của cao là 15,6%).
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng từ 525 g cao tổng thu được: 10 g cao phân đoạn n-hexan, 124 g cao phân đoạn ethyl acetat (EtOAc) và 300 g cắn nước.
    • Phân đoạn ethyl acetat được chọn để phân lập vì cho sắc ký đồ TLC phân tách nhiều vết chất rõ ràng và có khối lượng lớn hơn nhiều so với phân đoạn n-hexan.

  • Kết quả phân lập:

    • 124 g cao EtOAc được phân tách qua cột sắc ký silica gel pha thuận với hệ dung môi dichloromethane - methanol (tỷ lệ 20:1 đến 1:1 v/v), thu được 7 phân đoạn chính ký hiệu từ E1 đến E7.
    • Phân đoạn E3 (16 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi n-hexan - ethyl acetat (tỷ lệ 10:1 đến 1:1 v/v), thu được 8 phân đoạn nhỏ từ E3.1 đến E3.8.
    • Phân đoạn E3.6 (800 mg) được đưa lên cột sắc ký pha đảo RP-C18, rửa giải bằng methanol - nước (tỷ lệ 2:1 đến 9:1 v/v), thu được 4 phân đoạn (E3.6.1 đến E3.6.4).
    • Tinh chế phân đoạn E3.6.2 (72,7 mg) bằng cột sắc ký silica gel pha thuận với hệ dung môi n-hexan - dichloromethane (tỷ lệ 1:4 đến 1:9 v/v) đã phân lập thành công hai hợp chất tinh khiết ký hiệu là E3.1 và E3.2.

  • Kết quả xác định cấu trúc hóa học:

    • Hợp chất E3.1: Thu được dưới dạng chất rắn màu vàng nhạt. Phổ 13C-NMR hiển thị 14 tín hiệu carbon, gồm 1 carbon carbonyl tại $\delta_{\text{C}}$ 183,8 (C-9); 1 nhóm methoxy tại $\delta_{\text{C}}$ 62,2; 5 carbon thơm gắn oxy tại $\delta_{\text{C}}$ 146,6 (C-1), 148,3 (C-2), 151,9 (C-4a), 157,3 (C-5a), 163,1 (C-8); cùng 7 carbon thơm khác. Phổ 1H-NMR xác nhận hệ 2 proton thơm ghép ortho tại $\delta_{\text{H}}$ 7,41 (d, J = 9,6 Hz, H-3) và 7,24 (dd, J = 9,0; 0,6 Hz, H-4); hệ 3 proton của vòng benzen thế 1,2,3 tại $\delta_{\text{H}}$ 6,91 (d, J = 8,4 Hz, H-5), 7,62 (t, J = 8,4 Hz, H-6), 6,74 (d, J = 8,4 Hz, H-7); và 1 mũi đơn 3 proton methoxy tại $\delta_{\text{H}}$ 3,95. Tương tác HMBC giữa proton nhóm methoxy ($\delta_{\text{H}}$ 3,95) với C-1 ($\delta_{\text{C}}$ 146,6) và C-2 ($\delta_{\text{C}}$ 148,3) khẳng định nhóm -OCH3 gắn tại C-1. Cấu trúc được xác định là 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon (IUPAC: 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthen-9-on).
    • Hợp chất E3.2: Thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng. Phổ 13C-NMR hiển thị 13 tín hiệu carbon, gồm 1 nhóm carbonyl tại $\delta_{\text{C}}$ 183,5 (C-9); 4 carbon thơm gắn oxy tại $\delta_{\text{C}}$ 162,9 (C-1), 157,9 (C-4a), 151,6 (C-5a), 155,5 (C-7); và 8 carbon thơm không gắn oxy. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 3 proton thuộc vòng benzen thế 1,2,3 tại $\delta_{\text{H}}$ 6,73 (d, J = 8,0 Hz, H-2), 7,60 (t, J = 8,5 Hz, H-3), 6,93 (d, J = 8,5 Hz, H-4); cùng 3 proton thuộc vòng benzen thế 1,3,4 tại $\delta_{\text{H}}$ 7,40 (d, J = 9,0 Hz, H-5), 7,31 (dd, J = 9,0; 3,0 Hz, H-6) và 7,53 (d, J = 2,5 Hz, H-8). Cấu trúc được xác định là 1,7-dihydroxyxanthon (tên thông thường: euxanthon; IUPAC: 1,7-dihydroxyxanthen-9-on).
Vị trí carbon Hợp chất E3.1 (2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon) Hợp chất E3.2 (Euxanthon)
$\delta_{\text{C}}$ (ppm, CD3OD) $\delta_{\text{H}}$ (ppm, J in Hz, CD3OD) $\delta_{\text{C}}$ (ppm, CD3OD) $\delta_{\text{H}}$ (ppm, J in Hz, CD3OD)
1 146,6 - 162,9 -
2 148,3 - 110,7 6,73 (1H, d, J = 8,0)
3 126,1 7,41 (1H, d, J = 9,6) 137,8 7,60 (1H, t, J = 8,5)
4 114,9 7,24 (1H, dd, J = 9,0; 0,6) 108,1 6,93 (1H, d, J = 8,5)
4a 151,9 - 157,9 -
5a 157,3 - 151,6 -
5 107,6 6,91 (1H, d, J = 8,4) 120,1 7,40 (1H, d, J = 9,0)
6 137,8 7,62 (1H, t, J = 8,4) 126,3 7,31 (1H, dd, J = 9,0; 3,0)
7 110,9 6,74 (1H, d, J = 8,4) 155,5 -
8 163,1 - 109,5 7,53 (1H, d, J = 2,5)
8a 110,0 - 122,3 -
9 183,8 - 183,5 -
9a 116,4 - 109,5 -
1-OCH3 62,2 3,95 (3H, s) - -
  • Phần bàn luận của tác giả:
    • Về kết quả định tính: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam thực hiện khảo sát định tính có hệ thống các nhóm chất bằng phản ứng hóa học trên loài C. cochinchinense. Tác giả ghi nhận mẫu thử âm tính với phytosterol dù nghiên cứu trước đó của Yulin Ren (2011) từng phân lập được daucosterol từ thân cây thu hái tại Việt Nam; điều này được giải thích do sự khác biệt về bộ phận thu hái, thời điểm sinh trưởng hoặc điều kiện sinh thái thổ nhưỡng.
    • Về dung môi và phương pháp chiết: Ethanol 70% được phân tích là dung môi phân cực đa năng, tạo liên kết hydro tốt, hòa tan chọn lọc hoạt chất, dễ cô hồi lưu ở nhiệt độ thấp hơn nước và có tính kháng khuẩn tự nhiên trong quá trình ngâm chiết so với nước.
    • Về tiềm năng dược lý của hợp chất phân lập: Hợp chất 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon có dữ liệu thực nghiệm ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 (IC50 = 32,8 $\mu$g/mL) và phù hợp với kết quả của Hà Việt Sơn (2008) khi cao EtOAc lá Thành ngạnh nam ức chế NF-$\kappa$B (IC50 = 12,79 $\mu$g/mL). Hợp chất euxanthon được chứng minh có hoạt tính ức chế HIV-1 RT (IC50 = 50,1 $\mu$g/mL), ức chế dòng ung thư HL-60 (IC50 = 15,56 $\mu$g/mL) và có khả năng gây apoptosis trên tế bào u nguyên bào tủy người theo Chengyan Xu (2023).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

  • Hoàn thành định tính 14 nhóm hợp chất: Xác định sự có mặt của saponin triterpenoid, coumarin, flavonoid, tanin, đường khử tự do, polysaccharid và anthranoid; xác nhận sự vắng mặt của chất béo, carotenoid, phytosterol, acid hữu cơ, acid amin, alcaloid và glycosid tim.
  • Thiết lập quy trình chiết xuất ngâm nóng: Từ 8 kg dược liệu (độ ẩm 5%) chiết bằng ethanol 70% thu được 525 g cao tổng (hiệu suất chiết đạt 5,56%, độ ẩm 15,6%).
  • Phân đoạn lỏng - lỏng hiệu quả: Thu được 10 g cao n-hexan, 124 g cao ethyl acetat và 300 g cắn nước.
  • Tách dòng và tinh chế: Phân tách thành công hai hợp chất xanthon tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat bằng kỹ thuật sắc ký cột kết hợp pha thuận (silica gel) và pha đảo (RP-C18).
  • Định danh cấu trúc chính xác: Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của hợp chất E3.1 là 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon và hợp chất E3.2 là euxanthon (1,7-dihydroxyxanthon) dựa trên dữ liệu phổ 1D-NMR và 2D-NMR.

Đóng góp học thuật do tác giả tự nêu

  • Nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam tiến hành định tính có hệ thống các nhóm chất chuyển hóa thường gặp trong bộ phận trên mặt đất của cây Thành ngạnh nam bằng các phản ứng hóa học tiêu chuẩn.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết và phổ cộng hưởng từ hạt nhân chuẩn xác của hai dẫn chất xanthon phân lập từ mẫu thực vật thu hái tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, bổ sung vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật học của loài Cratoxylum cochinchinense tại Việt Nam.
  • Thiết lập quy trình thực nghiệm phân lập phân đoạn ethyl acetat, tạo tiền đề và định hướng cho các nghiên cứu sàng lọc hoạt tính sinh học (đặc biệt là tác dụng kháng viêm và kháng ung thư) tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi phân lập chỉ mới tập trung xử lý một lượng mẫu nhỏ (phân đoạn E3.6.2 với khối lượng 72,7 mg tách ra từ phân đoạn E3 nặng 16 g), trong khi lượng lớn cao ethyl acetat (124 g) và các phân đoạn khác chưa được khai thác triệt để.
  • Khóa luận chưa tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn kém phân cực (n-hexan, 10 g) và phân đoạn phân cực cao (cắn nước, 300 g).
  • Do giới hạn thời gian và khuôn khổ của khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, nghiên cứu mới dừng lại ở bước phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp trên các hợp chất tinh khiết đã thu nhận.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục khai thác, tách chiết và tinh chế các hợp chất hóa học từ các phân đoạn còn lại của cao ethyl acetat (E1, E2, E4 - E7) cũng như phân đoạn n-hexan và cắn nước nhằm tìm kiếm thêm các cấu trúc xanthon hoặc các nhóm chất tự nhiên mới.
  • Thiết kế thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro đối với các cao phân đoạn và hai hợp chất phân lập được; trong đó ưu tiên thử nghiệm tác dụng kháng viêm đối với 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon và tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư đối với euxanthon.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo học thuật đối với:

  • Sinh viên và học viên chuyên ngành Dược học, Dược liệu học và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết ngâm nóng quy mô phòng thí nghiệm, quy trình định tính hóa thực vật theo tiêu chuẩn Dược điển và các kỹ thuật sắc ký cột kết hợp pha thuận - pha đảo RP-C18.
  • Các nhà nghiên cứu hóa thực vật về chi Cratoxylum và họ Ban (Hypericaceae): Cung cấp bộ thông số phổ thực nghiệm chuẩn (độ dịch chuyển hóa học $\delta$, độ chẻ vạch, hằng số ghép J, tương tác HMBC) của hai khung cấu trúc xanthon là 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon và 1,7-dihydroxyxanthon (euxanthon) đo trong dung môi CD3OD.
  • Nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu: Cung cấp thông tin tổng quan có hệ thống về hoạt tính sinh học (chống ung thư, kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus HIV) của các dẫn chất xanthon, làm luận cứ xây dựng các đề tài sàng lọc dược lý chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

Mẫu thực vật nghiên cứu được thu hái ở đâu và tiêu bản được giám định như thế nào?

Mẫu nghiên cứu là bộ phận trên mặt đất (thân, cành, lá) của cây Thành ngạnh nam, được thu hái vào tháng 07 năm 2023 tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. Tên khoa học của mẫu được ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và DS. Nhâm Minh Phúc thuộc Trung tâm Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược liệu) giám định là Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume, họ Ban (Hypericaceae). Tiêu bản mẫu khô mang số hiệu DV - N14 hiện được lưu trữ tại Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.

Quy trình chiết xuất từ 8 kg dược liệu ban đầu đạt hiệu suất bao nhiêu và phân tách thành những phân đoạn nào?

Từ 8 kg bộ phận trên mặt đất sấy khô (độ ẩm 5%) được chiết ngâm nóng với ethanol 70% (tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/8 kg/L, thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 giờ), tác giả thu được 525 g cao tổng khô, tương ứng hiệu suất chiết đạt 5,56% (độ ẩm cao tổng là 15,6%). Từ 525 g cao tổng đem phân tán trong nước nóng và chiết lỏng - lỏng với các dung môi tăng dần độ phân cực thu được 3 phân đoạn: cao n-hexan (10 g), cao ethyl acetat (124 g) và cắn nước (300 g).

Tại sao tác giả lại lựa chọn cao phân đoạn ethyl acetat để tiếp tục sắc ký phân lập hợp chất?

Khi khảo sát sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi dichloromethane - methanol (20:1 v/v), tác giả nhận thấy cả hai cao phân đoạn n-hexan và ethyl acetat đều thể hiện nhiều vết chất và có khả năng phân tách tốt. Tuy nhiên, khối lượng cao ethyl acetat thu được là 124 g, lớn hơn rất nhiều so với khối lượng cao phân đoạn n-hexan chỉ có 10 g. Do đó, việc lựa chọn phân đoạn ethyl acetat cho phép triển khai sắc ký cột quy mô lớn hơn và có khả năng phân lập được nhiều hợp chất hơn.

Cấu trúc hóa học của hai hợp chất phân lập được xác định là gì và dựa trên những bằng chứng phổ nào?

Hai hợp chất phân lập được đều thuộc nhóm xanthon:

  • Hợp chất E3.1 được xác định là 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon (dạng chất rắn màu vàng nhạt). Cấu trúc được xác định dựa trên phổ 13C-NMR có 14 tín hiệu carbon (bao gồm 1 carbon carbonyl ở $\delta_{\text{C}}$ 183,8; 1 nhóm methoxy ở $\delta_{\text{C}}$ 62,2; 5 carbon thơm gắn oxy); phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu 2 proton ghép ortho (H-3, H-4), 3 proton thơm thế 1,2,3 (H-5, H-6, H-7), 1 mũi đơn methoxy ($\delta_{\text{H}}$ 3,95); và tương tác HMBC giữa nhóm 1-OCH3 với C-1 và C-2.
  • Hợp chất E3.2 được xác định là 1,7-dihydroxyxanthon (euxanthon) (dạng tinh thể hình kim màu vàng). Cấu trúc được xác định dựa trên phổ 13C-NMR hiển thị 13 tín hiệu carbon (1 carbonyl ở $\delta_{\text{C}}$ 183,5 và 4 carbon thơm gắn oxy); phổ 1H-NMR ghi nhận hệ 3 proton benzen thế 1,2,3 (H-2, H-3, H-4) và hệ 3 proton benzen thế 1,3,4 (H-5, H-6, H-8).

Thử nghiệm định tính bằng phản ứng hóa học phát hiện những nhóm chất nào có trong mẫu dược liệu?

Kết quả thực nghiệm định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy bộ phận trên mặt đất của cây Thành ngạnh nam có phản ứng dương tính với 7 nhóm hoạt chất: saponin triterpenoid, coumarin, flavonoid, tanin, đường khử tự do, polysaccharid và anthranoid. Ngược lại, mẫu thử cho kết quả âm tính với chất béo, carotenoid, phytosterol, acid hữu cơ, acid amin, alcaloid và glycosid tim.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Lê Đăng Chính đã thực hiện thành công việc định tính có hệ thống 14 nhóm hoạt chất thường gặp trên bộ phận trên mặt đất cây Thành ngạnh nam (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume) thu hái tại Bình Phước, khẳng định sự hiện diện của saponin triterpenoid, coumarin, flavonoid, tanin, đường khử tự do, polysaccharid và anthranoid. Từ 8 kg dược liệu ban đầu, tác giả đã xây dựng quy trình chiết ngâm nóng thu 525 g cao tổng và phân lập thành công hai hợp chất xanthon tinh khiết từ phân đoạn ethyl acetat bằng kỹ thuật sắc ký cột pha thuận kết hợp pha đảo RP-C18. Dựa trên phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D và đối chiếu tài liệu quốc tế, hai hợp chất đã được xác định chính xác cấu trúc là 2,8-dihydroxy-1-methoxyxanthon và euxanthon (1,7-dihydroxyxanthon), đóng góp dữ liệu khoa học tin cậy cho công tác nghiên cứu hóa thực vật và định hướng phát triển dược liệu trong nước.