Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế THC từ cây cần sa làm chất chuẩn

Luận văn thạc sĩ Dược học nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế Δ⁹-THC từ cây cần sa để thiết lập chất chuẩn trong kiểm nghiệm.

• Tác giả: Phạm Thanh Hiền
• Người hướng dẫn: TS. Trần Nguyên Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu Chiết xuất, Phân lập và Tinh Chế Δ9-Tetrahydrocannabinol từ Cây Cần Sa Làm Nguyên Liệu Thiết Lập Chất Chuẩn
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Dược học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về chiết xuất THC từ cần sa

Chiết xuất THC từ cần sa là một quá trình khoa học phức tạp nhằm tách chiết Δ9-Tetrahydrocannabinol từ nguyên liệu thực vật. Đây là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong kiểm nghiệm dược học và phân tích độc chất. Cần sa chứa nhiều hợp chất cannabinoid khác nhau, trong đó THC là thành phần chính có tác dụng sinh học đáng kể. Quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế THC yêu cầu sử dụng các kỹ thuật hiện đại và thiết bị phân tích chuyên dụng. Mục tiêu là tạo ra chất chuẩn THC với độ tinh khiết cao, phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm, phân tích và nghiên cứu khoa học.

1.1. Đặc điểm và thành phần hóa học của cây cần sa

Cây cần sa (Cannabis sativa L.) là một loài thực vật chứa hơn 100 hợp chất cannabinoid khác nhau. Các thành phần chính bao gồm THC, CBD (Cannabidiol), CBN (Cannabinol) và nhiều chất khác. Δ9-THC là thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhất. Ngoài cannabinoid, cây cần sa còn chứa các terpene, flavonoid và các hợp chất hữu cơ khác tạo nên đặc tính phức tạp của nguyên liệu.

1.2. Ứng dụng của chất chuẩn THC trong kiểm nghiệm

Chất chuẩn THC được sử dụng rộng rãi trong phân tích định lượng, kiểm định chất lượng và giám định pháp y. Nó là công cụ không thể thiếu trong kiểm nghiệm dược phẩm, kiểm soát chất kích thích và nghiên cứu khoa học. Việc thiết lập chất chuẩn có độ tinh khiết cao đảm bảo tính chính xác của các kết quả phân tích trong phòng thí nghiệm pháp y và các cơ sở kiểm nghiệm.

II. Phương pháp chiết xuất và phân lập THC

Quá trình chiết xuất THC từ nguyên liệu cần sa là bước đầu tiên trong việc tạo ra chất chuẩn. Các phương pháp chiết xuất hiện đại bao gồm sử dụng các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, hexane hoặc ethyl acetate. Điều kiện chiết xuất như nhiệt độ sấy, thời gian sấy, loại dung môi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất và chất lượng dịch chiết. Sau chiết xuất, cần thực hiện phân lập THC khỏi các hợp chất cannabinoid khác như CBD và CBN bằng sắc kí lớp mỏng (TLC) và các kỹ thuật sắc kí khí hoặc sắc kí lỏng.

2.1. Quy trình khảo sát điều kiện chiết xuất

Điều kiện chiết xuất bao gồm lựa chọn dung môi chiết, nhiệt độ sấy mẫu và thời gian sấy. Việc khảo sát nhiệt độ sấy giúp xác định điểm tối ưu để loại bỏ nước mà không làm hư hại hợp chất cannabinoid. Thời gian sấy được xác định thông qua các thí nghiệm liên tiếp. Lựa chọn dung môi dựa trên khả năng chiết xuất THC hiệu quả và tính an toàn trong thí nghiệm.

2.2. Sắc kí lớp mỏng và phân tách hợp chất

Sắc kí lớp mỏng (TLC) là phương pháp định tính và phân tách các hợp chất cannabinoid. Phương pháp này giúp xác định các thành phần trong dịch chiết và chọn lựa hệ dung môi phù hợp để phân lập THC, CBD, CBN. Ghi nhận giá trị Rf của từng thành phần là cơ sở để thiết kế quá trình phân lập bằng các kỹ thuật sắc kí lỏng hoặc sắc kí cột điều chế.

III. Tinh chế và xác định cấu trúc THC

Giai đoạn tinh chế THC sử dụng sắc kí lỏng điều chế (PHPLC) để tách chiết THC tinh khiết từ hỗn hợp cannabinoid. Sắc kí lỏng điều chế là phương pháp định lượng cho phép thu hồi chất tinh khiết với độ tinh khiết cao (≥95%) phục vụ mục đích làm chất chuẩn. Sau khi tinh chế, cần xác định cấu trúc của THC tinh khiết bằng các phương pháp quang phổ như NMR (Nuclear Magnetic Resonance), MS (Mass Spectrometry) và IR (Infrared Spectroscopy). Các phương pháp này xác nhận công thức phân tử, cấu trúc hóa học và nhận dạng chính xác của THC.

3.1. Sắc kí lỏng điều chế PHPLC phương pháp tinh chế

PHPLC là kỹ thuật sắc kí lỏng quy mô lớn dùng để tách chiết và tinh chế THC từ hỗn hợp cannabinoid phức tạp. Phương pháp này sử dụng các cột sắc kí chuyên dụng với đầu dò UV để giám sát quá trình phân tách. Điều kiện sắc kí được tối ưu hóa để đạt độ phân tách tối đa giữa THC và các cannabinoid khác, thu hồi hiệu suất cao và độ tinh khiết tối ưu.

3.2. Xác định cấu trúc bằng quang phổ NMR MS và IR

NMR (phổ cộng hưởng từ) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử và sự sắp xếp nguyên tử. MS (phổ khối) xác định khối lượng phân tử chính xác và mô hình phân mảnh, giúp xác nhận danh tính hợp chất. IR (phổ hồng ngoại) phát hiện các nhóm chức năng như hydroxyl, carbonyl và aromatic. Sự kết hợp ba phương pháp này đảm bảo xác định cấu trúc THC một cách toàn diện và chính xác.

IV. Thẩm định phương pháp định lượng THC bằng LC MS MS

Sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS) là phương pháp định lượng tiên tiến dùng để xác định hàm lượng THC trong mẫu tinh chế. Phương pháp này cung cấp độ nhạy cao, độ chuyên biệt tuyệt đối và khả năng phát hiện các tạp chất. Quá trình thẩm định phương pháp bao gồm khảo sát điều kiện khối phổ, lựa chọn điều kiện sắc kí, xác định khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ) và xác định tạp chất liên quan. Phương pháp LC-MS/MS là tiêu chuẩn vàng trong kiểm nghiệm dược phẩm hiện đại, đảm bảo chất lượng chất chuẩn THC được sử dụng trong các phòng thí nghiệm.

4.1. Khảo sát điều kiện khối phổ và sắc kí

Khảo sát điều kiện khối phổ liên quan đến lựa chọn loại ion hóa, điện áp tăng tốc, điện áp chiết xuất và các tham số MS/MS khác. Tối ưu hóa điều kiện sắc kí bao gồm lựa chọn pha động, tốc độ dòng chất, pH, nhiệt độ cột để đạt độ phân tách tối ưu. Chuẩn bị mẫu cần sử dụng các chất hóa dùng phân tích có độ tinh khiết cao nhất để tránh nhiễu nền và đảm bảo chất lượng phân tích.

4.2. Xác định tạp chất liên quan và đánh giá chất lượng

Xác định tạp chất liên quan là bước quan trọng để đảm bảo độ tinh khiết của chất chuẩn THC. Phương pháp LC-MS/MS có khả năng phát hiện những tạp chất ở nồng độ rất thấp, bao gồm các hợp chất cannabinoid khác (CBD, CBN), tạp chất từ quá trình sản xuất. Khoảng tuyến tính được xác định để đánh giá độ chính xác của phương pháp trong một dải nồng độ nhất định. Việc thẩm định hoàn toàn phương pháp đảm bảo chất chuẩn THC có độ tinh khiết ≥95% và phù hợp các tiêu chuẩn quốc tế như USP (Dược điển Mỹ).

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Tệ nạn ma túy là hiểm họa đối với toàn xã hội, gây tác hại cho sức khỏe, là nguyên nhân dẫn đến nhiều loại tội phạm khác. Cùng với sự gia tăng của tệ nạn ma túy thế giới, những năm qua, tệ nạn ma túy nƣớc ta cũng tăng lên. Cần sa và các sản phẩm của cần sa đƣợc trồng, sản xuất và buôn bán bất hợp pháp tại nhiều quốc gia, chiếm 65% tổng số vụ bắt giữ ma túy trên thế giới (1.65 triệu vụ) thu giữ 5200 tấn cây cần sa và 1000 tấn nhựa cần sa năm 2006.Năm 2006, hiện có hơn 160 triệu ngƣời trên thế giới sử dụng cần sa thƣờng xuyên và hiện vẫn có xu hƣớng gia tăng [27]. Những năm gần đây ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Công an năm 2015, tỷ lệ sử dụng cần sa ở nƣớc ta chiếm khoảng 1,6-2% số ngƣời nghiện nhƣng tình hình sử dụng cần sa trong nhóm thanh thiếu niên ngày càng phổ biến hơn.Thời gian gần đây, cần sa lại đƣợc buôn bán dƣới nhiều hình thức: buôn bán công khai qua mạng hay đƣợc trồng trong vƣờn ngay tại các ngôi nhà trong thành phố.

Theo quy định tại Bộ Luật Hình sự Việt Nam 2015, tất cả các mẫu thu giữ nghi là ma túy đều phải giám định. Trong quy trình giám định, hầu hết các phƣơng pháp đều cần dùng đến chất chuẩn. Hoạt chất chính trong cần sa là Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC). Chính hoạt chất đó làm cho ngƣời sử dụng cần sa có cảm giác hƣng phấn, tinh thần lên cao; khi dùng liều cao sẽ gây ảo giác; sử dụng lâu dài gây ra rối loạn tâm thần [47].

Để xác định và kết luận giám định là cần sa, ngoài giám định đặc điểm thực vật học, cần phân tích hàm lƣợng THC trong mẫu vật. Đến nay, Trung tâm giám định ma túy, Viện Khoa học hình sự đã thiết lập đƣợc một số chất chuẩn nhƣng chuẩn THC vẫn phải mua ở nƣớc ngoài với giá cao, thủ tục phức tạp và không chủ động trong công tác giám định tƣ pháp. Nhƣ vậy, với nhu cầu thực tiễn đòi hỏi có chất chuẩn phục vụ cho công tác giám định nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol từ cây cần sa làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn” với các mục tiêu: 1 - Chiết xuất, phân lập, tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol từ cây cần sa có hàm lƣợng tối thiểu 95% làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. - Nhận dạng, xác định cấu trúc và xác định tạp liên quan của Δ9- tetrahydrocannabinol tinh chế đƣợc.

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng Δ9-tetrahydrocannabinol trong mẫu tinh chế. 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1. Tên khoa học và đặc điểm thực vật Cây cần sa có tên khoa học là: Canabis sativa, Họ Cần sa (Cannabaceae) [15] ❖ Phân loại theo thực vật học [15] Ngành -Tracheophyta Phân ngành-Pteropsida Lớp-Angiospermae Phân lớp-Vrticales Bộ-Dicotyledoneae Họ -Cannabaceae Chi - Cannabis ❖ Đặc điểm thực vật học Cần sa là một loài cây thân thảo, thân mọc thẳng đứng có thể cao tới 0.2 – 6m nhƣng phổ biến nhất cây cao từ 1 – 3 m [2],[15], [34],.

Chiều cao cây, độ phân nhánh phụ thuộc yếu tố môi trƣờng, di truyền và phƣơng pháp canh tác [12]. Lá cây màu xanh đậm, có răng cƣa, thô ráp cả hai mặt. Cặp lá đầu tiên chỉ có một lá chét, số lƣợng lá chét tăng dần, tối đa là 13 lá chét trên mỗi lá, phụ thuộc vào giống và điều kiện sinh trƣởng.Cặp lá bên dƣới thƣờng mọc đối trong khi cặp lá phía trên mọc so le [41]. Cần sa là loài cây lƣỡng tính hoặc hoa đơn tính khác gốc [3].

Các hoa cái mọc theo chùm gồm một trục chính là hoa lớn và nhánh là các hoa nhỏ. Các hoa đực mọc thành các chùy hoa lỏng lẻo [15]. Cây đực thƣờng cao hơn nhƣng không sum suê bằng cây cái [34]. Hạt cần sa có hình dạng bầu dục và hơi dẹt, màu xanh lục hoặc xám.

Khi chín hạt đổi màu thành nâu nhạt hoặc nâu [34]. Hạt không có nội nhũ, chứa nhiều dầu [3]. Quả có chứa một hạt giống gồm hai lá mầm, phần lớn là chứa các chất dự trữ [12]. 3 ❖ Trồng và thu hoạch cần sa Nếu ngƣời trồng không loại bỏ những cây đực và cây lƣỡng tính (bao gồm cả hoa đực và hoa cái) thì khi hoa đực trƣởng thành sẽ bung túi phấn ra.

Phấn hoa trong tự nhiên theo gió đến với hoa của cây cái. Hoa cái sau khi nhận đƣợc phấn sẽ thụ phấn và tạo hạt đến cuối vụ ngƣời trồng sẽ thu hoạch đƣợc hạt cần sa và những bông hoa nhỏ do hoa tập trung vào thụ phấn mà không phát triển hoa. Trên thế giới hiện nay, cần sa đƣợc trồng theo hai phƣơng thức chính: ngoài trời hoặc trong nhà. Để tăng hàm lƣợng THC trong cây:đối với cần sa trồng ngoài trời thƣờng đƣợc áp dụng kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn để không tạo hạt; nếu trồng cần sa trong nhà thì kiểm soát các yếu tố: nhiệt độ, pH đất, môi trƣờng (ánh sáng, khí) và kết hợp dùng kỹ thuật nhân giống[43].

Phần lớn những giống cần sa hiện nay có thời điểm thu hoạch vào khoảng tháng 5 hoặc tháng 10 hàng năm. Trên cây cần sa, lá hoa và quả là những phần chính chứa hoạt chất tác dụng lên hệ thần kinh đƣợc gọi là “những phần chứa ma túy”. Khi những bông hoa chuyển thành màu lốm đốm, cánh hoa quăn dần rồi chuyển màu nâu là dấu hiệu báo hiệu đã đến lúc thu hoạch cần sa. Thành phần hóa học trong cần sa Có khoảng 20 nhóm hợp chất trong cây cần sa, trong đó có 3 nhóm hợp chất chính là: Cannabinoids, Flavonoids, Terpenoid [15].

Thành phần Terpenoids và Flavonoids có ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học của nhóm Cannabinoids trong cây cần sa [34].  Tổng quan về nhóm hợp chất Cannabinoids Mechoulam và Gaoni (1967) định nghĩa Cannabinoids là: nhóm các hợp chất 21C có ở hầu hết ở các loài Canabis, bao gồm các dạng: trung tính, acid carboxylic (dạng A, B), các đồng phân và các sản phẩm chuyển hóa của chúng[11], [12]. Cannabinoids là thành phần hoạt tính sinh học chính của cây cần sa [26]. Hầu hết các bộ phận trong cây đều chứa Cannabinoids có nhiều trong lá và hoa nhƣng hạt không có thành phần này [11], [12].

4 Phân loại dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra thành 10 nhóm: Cannabigerol, Cannabichromene, Cannabidiol, Delta-9-tetrahydrocannabinol, Delta-8-tetracannabinol, Cannabicycol, Cannabielsoin, Cannabinol và cannabinodiol, Cannabitrol và nhóm khác. Trong đó, hợp chất ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol,có hoạt tính chính trên thần kinh trung ƣơng. Hàm lƣợng THC có trong cây phụ thuộc vào tính di truyền, điều kiện nuôi trồng, khí hậu, đất và số năm trồng [34]. Các bộ phận khác nhau thì hàm lƣợng ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) cũng có sự khác nhau, giảm theo thứ tự: nhựa, hoa, lá và ít có trong rễ, thân.

Trong hoa cái có 10-12% THC, lá có 1-2% THC và thân 0,1-0,3%. THC trong cây có hai dạng chính: dạng acid và dạng trung tính. THCA có thể chuyển hóa thành THC dƣới tác động của nhiệt độ. Trong ngành khoa học hình sự một số thành phần Cannabinoids đƣợc coi là đối tƣợng trong giám định đƣợc trình bày ở bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa trong khoa học hình sự Tên hợp chất và công thức Đặc điểm và tính chất - Công thức phân tử: C21H30O2 - Khối lƣợng phân tử: 314,46 g/mol ∆9-Tetrahydrocannabinol - Tên khoa học: THC (6aR)-6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a,7,8,10a- tetrahydrobenzo[c] chromen-1-ol - Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol - Là chất bán rắn màu nâu, chất lỏng nhớt, hoặc là chất rắn màu vàng.

- Không tan trong nƣớc (2,8 g/l ở 230C), - Tan tốt trong Ethanol, Chloroform, Hexan. - Nhiệt độ nóng chảy: 155-157°C ở áp suất 0. - Khối lƣợng phân tử: 314.6 - Năng suất quay cực: [α]=-150,5 (dung 5 dịch trong Ethanol). - Phổ hấp thụ UV có 2 cực đại ở 282 nm và 276 nm.

- Dƣợc lý: giảm đau kháng viêm, chống nôn. ∆9-acid tetrahydrocannabinolic THCA - Công thức phân tử: C22H30O4 - Khối lƣợng phân tử: 358 g/mol - Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol - Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt trong dung môi ethanol, chloroform, hexan - Dƣợc lý: Kháng khuẩn, kháng sinh Cannabinol, CBN - Công thức phân tử: C21H26O2 - Khối lƣợng phân tử: 310,43 g/mol - Thuộc nhóm Cannabinol và cannabinodiol - Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt trong dung môi ethanol, chloroform, hexan Cannabidiol, CBD - Công thức phân tử: C21H30O2 - Khối lƣợng phân tử: 314,46 g/mol - Thuộc nhóm Cannabinol và cannabinodiol - Gần nhƣ không tan trong nƣớc, tan tốt trong dung môi ethanol, clorofrom, hexan. Cannabigerol, CBG - Công thức: C21H32O2 - Khối lƣợng phân tử: 316,48 g/mol - Thuộc nhóm Cannabicycol 6 Các hợp chất trên có mối quan hệ với nhau thông qua 3 quá trình (hình 1.1) [27]:  Quá trình sinh tổng hợp.  Quá trình dercarboxyl hóa.

 Quá trình thoái hóa nhƣ: oxy hóa, đồng phân hóa hay tác động của ánh sáng. CBGA nhờ các enzyme synthase (THCA, CBDA synthase) tạo thành dạng acid phổ biến trong cây là THCA, CBDA. Các dạng acid này có thể bị decarboxyl hóa thành dạng trung tính dƣới tác động của nhiệt độ, ánh sáng và các yếu tố khác tạo các sản phẩm THC, CBDtƣơng ứng. THC sẽ bị oxy hóa tạo CBN, đồng phân hóa tạo Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC).

Dựa vào thành phần hóa học đặc trƣng trên chia thành hai loại cần sa sợi và cần sa ma túy [19], [24], [40]. Ngƣời ta phân biệt hai loại cần sa trên dựa vào tỉ lệ hàm lƣợng THC và CBD. Bởi vì THC bị oxy hóa một phần thành CBN, nên tổng diện tích píc của THC và CBN đƣợc sử dụng và đƣợc chia cho diện tích của CBD. [ ] [ ] [ ] [THC]: diện tích pic của THC trên sắc kí đồ [CBN]: diện tích pic của CBN trên sắc kí đồ [CBD]: diện tích pic của CBD trên sắc kí đồ Hệ thống phân loại của Grlic: + X ≥ 1: Cần sa ma túy: hàm lƣợng THC cao, CBD thấp.

+ X ≤ 1: Cần sa lấy sợi (hay đƣợc gọi là cây gai dầu): hàm lƣợng THC thấp, CBD cao. Hiện nay, châu Âu quy định đối với cần sa lấy sợi thì hàm lƣợng THC ≤ 0,2% còn ở Châu Âu và Canada ≤ 0,3%.1 Mối quan hệ các thành phần chính trong cây cần sa [36] 1. Sử dụng cần sa [43] Theo Nghị định 73/2018/NĐ-CP quy định các danh mục chất ma túy và tiền chất thì cần sa và các chế phẩm trong cần sa đều thuộc danh mục các chất ma túy cấm sử dụng dƣới mọi hình thức.Các sản phẩm buôn bán trái phép bao gồm: nhựa cần sa, cây cần sa. 8 Cây cần sa Các bộ phận nụ hoa và các lá gần nụ hoa chứa một lƣợng đáng kể THC và chúng đƣợc gọi là “những bộ phận chứa ma túy”.