Khóa luận Dược sĩ: Nghiên cứu chiết xuất và bào chế cao Đan sâm định lượng Tanshinon IIA

Khóa luận Dược sĩ trình bày nghiên cứu chiết xuất, bào chế cao Đan sâm và phương pháp định lượng hoạt chất quan trọng Tanshinon IIA trong dược liệu.

• Tác giả: Vũ Quốc Anh
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hải Dâng Triều
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Xuất Và Bào Chế Cao Đan Sâm Định Lượng Tanshinon IIA
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đan Sâm và Tanshinon IIA

Đan sâm là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền Đông Á, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tim mạch. Thành phần chính của đan sâm bao gồm các tanshinon, trong đó tanshinon IIA là hợp chất hoạt tính quan trọng nhất. Tanshinon IIA sở hữu các đặc tính dược học nổi bật như chống viêm, hoạt huyết hóa ứ, và bảo vệ tim mạch. Việc chiết xuất cao đan sâm định lượng tanshinon IIA là quá trình khoa học nhằm tăng nồng độ chất hoạt tính này, đảm bảo chất lượng và hiệu quả dược học của sản phẩm. Nghiên cứu này dựa trên nền tảng khoa học hiện đại tại Trường Đại học Dược Hà Nội, kết hợp các phương pháp phân tích tiên tiến như HPLC để xác định chính xác hàm lượng tanshinon IIA trong cao đan sâm.

1.1. Đặc Điểm Thực Vật và Thành Phần Hóa Học

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza) là cây thuộc họ Lamiaceae, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và được trồng tại Việt Nam. Bộ phận dùng là rễ và rễ thân. Thành phần hóa học chính bao gồm các tanshinon (tanshinon I, II, IIA, VI), phenolic acids, và các hợp chất khác. Tanshinon IIA chiếm khoảng 1-2% trong dược liệu tươi, là thành phần chủ yếu cho tác dụng dược học.

1.2. Tính Chất và Hoạt Động Dược Học của Tanshinon IIA

Tanshinon IIA là một quinin khử với công thức phân tử C₁₉H₁₈O₃. Hợp chất này có tính hydrophobin cao, tan trong dung môi hữu cơ nhưng hạn chế trong nước. Hoạt động dược học chính bao gồm kháng viêm, ức chế platelet, cải thiện lưu thông máu, và bảo vệ mô tim. Các nghiên cứu lâm sàng chứng minh hiệu quả trong điều trị bệnh tim mạch.

II. Quy Trình Chiết Xuất và Tinh Chế Tanshinon IIA

Chiết xuất cao đan sâm định lượng tanshinon IIA là quá trình phức tạp bao gồm nhiều giai đoạn. Đầu tiên, cần xử lý dược liệu thích hợp để tăng diện tích tiếp xúc và hiệu suất chiết xuất. Sau đó, thực hiện chiết xuất tanshinon IIA sử dụng các dung môi hữu cơ như ethanol hoặc ethyl acetate. Bước tiếp theo là làm giàu tanshinon IIA thông qua các phương pháp tinh chế như sắc ký cột hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Cuối cùng, sản phẩm được làm khô bằng phương pháp quay tính chất để thu được cao khô định lượng. Các yếu tố ảnh hưởng quan trọng bao gồm tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ, thời gian chiết xuất, và pH. Tối ưu hóa quá trình này giúp đạt hiệu suất chiết xuất cao nhất.

2.1. Các Phương Pháp Chiết Xuất Hiện Đại

Ngoài chiết xuất truyền thống bằng ngâm hay sắc, các phương pháp hiện đại bao gồm chiết xuất hỗ trợ siêu âm (UAE), chiết xuất hỗ trợ vi sóng (MAE), và chiết xuất siêu tới hạn (SPE). Các phương pháp này có ưu điểm giảm thời gian, tăng hiệu suất, và bảo tồn chất hoạt tính. CUAE-HIUP (chiết xuất liên tục hỗ trợ siêu âm với đầu dò cường độ cao) là kỹ thuật tiên tiến cho chiết xuất tanshinon IIA hiệu quả cao.

2.2. Các Phương Pháp Tinh Chế và Làm Giàu

Tinh chế tanshinon IIA sử dụng sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hoặc sắc ký ngược dòng tốc độ cao (CCC). Phương pháp HPLC được ưa chuộng nhất do độ chính xác cao và khả năng định lượng chính xác tanshinon IIA. Chiết điểm đám mây (CPE) là phương pháp mới giúp làm giàu hợp chất chủ yếu hiệu quả.

III. Phương Pháp Thẩm Định và Định Lượng Tanshinon IIA

Định lượng tanshinon IIA là khâu quan trọng để đảm bảo chất lượng cao đan sâm định lượng. Phương pháp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) được sử dụng làm tiêu chuẩn vàng với độ nhạy cao và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thấp. Quá trình thẩm định phương pháp bao gồm xác định độ chính xác, độ chặt chẽ, tuyến tính, phạm vi đo lường, và sự ổn định. Chuẩn tanshinon IIA với độ tinh khiết HPLC cao được sử dụng để xây dựng đường chuẩn tanshinon IIA. Các chỉ tiêu chất lượng khác như hàm ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axit cũng được kiểm tra. Sắc ký lớp mỏng (SKLM) có thể sử dụng như phương pháp định tính nhanh chóng.

3.1. Xây Dựng Đường Chuẩn và Thẩm Định Phương Pháp HPLC

Đầu tiên, xây dựng đường chuẩn tanshinon IIA bằng cách sử dụng chuẩn tinh khiết HPLC với nồng độ khác nhau (thường từ 10-50 μg/mL). Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm độ chính xác (recovery 95-105%), tuyến tính (R² ≥ 0.99), và RSD (< 2%). Phương pháp được kiểm chứng theo Dược điển Việt Nam hoặc Dược điển Trung Quốc 2020 để đảm bảo độ tin cậy.

3.2. Định Lượng Tanshinon IIA trong Nguyên Liệu và Sản Phẩm

Mẫu đan sâm được chiết xuất, tinh chế, rồi định lượng tanshinon IIA bằng HPLC. Hàm lượng tanshinon IIA thường được tính dựa trên diện tích peak. Yêu cầu chất lượng của cao đan sâm định lượng phải chứa tối thiểu 5-10% tanshinon IIA (tính trên chất khô), tuỳ theo tiêu chuẩn yêu cầu.

IV. Tối Ưu Hóa Quá Trình Bào Chế và Kiểm Định Chất Lượng

Tối ưu hóa quá trình chiết xuất tanshinon IIA là bước quyết định để đạt cao đan sâm định lượng có chất lượng cao nhất. Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp với thiết kế thí nghiệm (DoE) được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nhiều yếu tố: tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, số lần chiết xuất. Mô hình CCD (Central Composite Design) hoặc BBD (Box-Behnken Design) giúp xác định điểm tối ưu. Sau khi xây dựng quy trình bào chế, sản phẩm cao khô định lượng đan sâm phải thỏa các chỉ tiêu chất lượng: hàm ẩm < 5%, tro toàn phần < 5%, tro không tan axit < 1%, và hàm lượng tanshinon IIA theo quy định. Kiểm định độc tính, an toàn cũng là phần quan trọng.

4.1. Ứng Dụng Phương Pháp RSM và Design of Experiments

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) cho phép xây dựng mô hình toán học dự báo hàm lượng tanshinon IIA dựa trên các yếu tố đầu vào. Mô hình Box-Behnken hoặc CCD được lựa chọn để thiết kế các thí nghiệm hiệu quả. Phân tích ANOVA xác định yếu tố nào ảnh hưởng mạnh nhất đến kết quả. Kết quả cuối cùng cho phép tối ưu hóa sản lượng và chất lượng tanshinon IIA.

4.2. Đánh Giá Chỉ Tiêu Chất Lượng Cao Đan Sâm Định Lượng

Cao đan sâm định lượng tanshinon IIA phải đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng dược phẩm. Kiểm tra bao gồm: hàm ẩm (< 5% theo Karl Fischer), tro toàn phần (< 5%), tro không tan axit (< 1%), hàm lượng tanshinon IIA (HPLC), và tính ổn định (bảo quản). Kiểm định vi sinh (độ sạch vi khuẩn, nấm mốc) cũng bắt buộc theo yêu cầu dược điển.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày càng được chú ý và phát triển một cách rõ rệt. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số trên thế giới vẫn sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, đặc biệt phổ biến tại các quốc gia đang phát triển [1]. Đây không chỉ là xu hướng mà còn là cơ hội lớn cho những quốc gia sở hữu đa dạng sinh học phong phú như Việt Nam – nơi có nguồn tài nguyên thực vật dồi dào với nhiều loài thực vật được phát hiện có tác dụng hỗ trợ và điều trị bệnh. Bên cạnh những cây thuốc bản địa quý giá thì nhiều cây thuốc di thực như Đan sâm – dược liệu có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Trung Quốc [2], Hàn Quốc và Nhật Bản [3] cũng giữ vai trò then chốt trong việc cung cấp nguyên liệu cho ngành dược Việt Nam, từ đó giúp giảm sự phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu.

Trong số các thành phần có hoạt tính đã được phân lập, tanshinon IIA – thuộc nhóm diterpenoid – được xác định là hợp chất chính, có giá trị sinh học và tiềm năng ứng dụng cao, chẳng hạn như chống viêm, chống oxy hóa, xơ vữa động mạch, … [4]. Tuy nhiên, tanshinon IIA lại có hàm lượng thấp và không đồng đều giữa các lô dược liệu, đồng thời gặp hạn chế lớn về độ ổn định, khả năng hòa tan và sinh khả dụng kém. Do đó, việc nghiên cứu quy trình bào chế cao đan sâm có hàm lượng tanshinon IIA ổn định, đạt yêu cầu Dược điển là cần thiết và có ý nghĩa cả về mặt khoa học lẫn thực tiễn. Thực tế hiện nay có rất nhiều sản phầm từ đan sâm, từ thuốc điều trị cho đến thực phẩm chức năng, nhưng nguồn cao đan sâm trong nước vẫn chưa tự chủ được mà vẫn phải phụ thuộc vào cao nhập khẩu, đặc biệt là từ Trung Quốc.

Từ những vấn đề nêu trên, nghiên cứu xây dựng khóa luận với đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và bào chế cao đan sâm định lượng tanshinon IIA” với các mục tiêu chính sau: 1. Khảo sát được ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quá trình chiết xuất và làm giàu tanshinon IIA 2. Xây dựng được quy trình bào chế cao đan sâm định lượng tanshinon IIA có hàm lượng đạt tiêu chuẩn CP20. Tổng quan Đan sâm 1.

Tên gọi và phân bố Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge., thuộc chi Salvia, họ Hoa môi (Lamiaceae), bộ Labiatae. Dược liệu này còn được biết đến với tên gọi khác như huyết sâm, xích sâm, huyết căn [5]. Đan sâm trồng ở nước ta có nguồn gốc từ Trung Quốc. Hiện nay cây được trồng ở Sapa, Hà Giang, Hưng Yên, Tam Đảo – chủ yếu là những vùng có khí hậu mát mẻ, đất đai tơi xốp và giàu dinh dưỡng phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây [5], [6].

Đặc điểm thực vật Đan sâm là cây sống lâu năm, cao 30 – 80 cm. Rễ nhỏ, dài, hình trụ, màu đỏ nâu, đường kính 0,5 – 1,5 cm. Lá kép mọc đối, có 3 – 7 lá chét, mép có răng cưa tù. Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá hoặc đầu cành, màu xanh tím nhạt.

Quả nhỏ, dài khoảng 3 mm, rộng 1,5 mm. Cây ra hoa từ tháng 5–8, có quả từ tháng 6–9 hằng năm. Bộ phận dùng Rễ đan sâm đem phơi hoặc sấy khô [5]. Công dụng Trong Y học Cổ truyền: Đan sâm có vị đắng, tính mát, quy kinh tâm can.

Giúp tăng cường tuần hoàn máu, hoạt huyết hóa ứ, chữa rối loạn kinh nguyệt, vô kinh, đau nhói ở ngực và bụng, viêm đau khớp cấp, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, mất ngủ, chứng to gan lách, đau thắt ngực [6]. Trong Y học hiện đại: Được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau. Nhiều nghiên cứu cho thấy đan sâm và các thành phần của nó giúp hỗ trợ ngăn ngừa, điều trị các bệnh tim mạch như thiếu máu cơ tim, tai biến mạch máu não, xơ vữa động mạch [7]. Ngoài ra, đan sâm còn có tác dụng chống viêm [8], chống oxy hóa [9], bảo vệ gan, thận, tim.

Bên cạnh đó, đan sâm cũng được nghiên cứu với vai trò bảo vệ thần kinh trong các bệnh như Alzheimer, Parkinson và có tiềm năng chống ung thư [4], [10]. Do đó, đan sâm được xem là một dược liệu có giá trị cao trong cả y học cổ truyền và hiện đại. Thành phần hóa học Tổng cộng có hơn 200 hợp chất từ đan sâm đã được phân lập [11]. Dựa vào tính tan có thể chia thành phần đan sâm thành 3 nhóm: thành phần tan trong nước, thành phần tan trong dầu và các thành phần khác.

Thành phần tan trong nước Các thành phần tan trong nước của đan sâm chủ yếu là các acid phenolic và dẫn chất. Một số acid phenolic chính là acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid rosmarinic, dansheshu và các dẫn xuất khác [3]. danshenshu acid caffeic acid salvinolic A acid salvinolic B Hình 1. Cấu trúc một số hợp chất thân nước có trong rễ đan sâm 1.

Thành phần tan trong dầu Thành phần tan trong dầu chủ yếu là nhóm diterpenoid [12]. Hầu hết các diterpenoid tồn tại dưới dạng tanshinon và các dẫn chất tương tự của chúng. Chẳng hạn như: tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon, dihydrotanshinon, … [13]. tanshinon IIA tanshinon IIB cryptotanshinon tanshinon I Hình 1.

Cấu trúc một số hợp chất thân dầu có trong rễ đan sâm 3 1. Các thành phần khác Các β-sitosterol, balcalin, acid ursolic và daucosterol tìm thấy trong dịch chiết ethanol, vitamin E và tannin tìm thấy trong dịch chiết ethyl acetat [6]. Ngoài ra, đan sâm còn chứa một số acid amin như acid glutamic, alanin và nhiều loại khác [13]. Tổng quan về tanshinon IIA 1.

Đặc tính và tính chất của tanshinon IIA Hình 1. Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA ❖ Tính chất vật lý: - Tanshinon IIA là chất kết tinh màu đỏ đến đỏ cam, có mùi, không hút ẩm. - Độ tan: Thực tế không tan trong nước, khó tan trong methanol và ethanol, tan trong các dung môi hữu cơ như: cloroform, dicloromethan, aceton, ethyl acetat. Độ tan của tanshinon IIA một số dung môi Độ tan (25oC) Số mL dung môi Dung môi (mg/mL) hòa tan 1g mẫu Nước 0,0042 238095 Methanol 5 200 Ethanol 5 200 Ethyl acetat 25 40 Dimethyl sulfoxid 25 40 ❖ Tính chất hóa học: - Trong phân tử có nhóm lacton và ceton nên dễ bị khử hóa mở vòng dưới tác động của ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ [14].

Đặc biệt ở nhiệt độ > 80oC, tanshinon IIA bị phân hủy [15]. Tanshinon IIA ổn định ở điều kiện pH 2-6. Ở pH 8-10, hàm lượng bị giảm nhẹ. - Tanshinon IIA có nhân thơm nên có thể hấp thụ UV-VIS mạnh ở ở bước sóng từ 254-280 nm có cực đại hấp thụ UV trong MeOH ở bước sóng 270 nm.

- Đánh giá in silico các tính chất lý hóa của tanshinon IIA cho kết quả như sau: Bảng 1. Kết quả đánh giá in silico các tính chất lý hóa của tanshinon IIA cLogP TPSA MW nON nOHNH TLTK 4 4,16 47,28 294,35 3 0 [16] Những thông số lý hóa trên cho thấy tanshinon IIA có tiềm năng phát triển thành thuốc, cụ thể: - Hệ số phân bố dầu nước cLogP = 4,16 < 5 cho thấy tính thân dầu cao. - Tổng diện tích bề mặt của các nguyên tử phân cực (TPSA) = 47,28 cho thấy khả năng hấp thu tốt qua màng thế bào. - Trọng lượng phân tử (MW) = 294,36 < 500 Da là một phân tử nhỏ.

- Có ba nhóm nhận liên kết hydro và không có nhóm cho liên kết hydro. ❖ Dược động học Theo Hệ thống phân loại sinh dược học (BCS), tanshinon IIA được xếp vào nhóm IV: nhóm có độ tan kém, thấm kém [15], [17]. Tính thấm kém được chỉ ra trong nghiên cứu của Chen và cộng sự: Tan IIA có hệ số thấm biểu kiến là 6,86 × 10-7 cm/s trong mô hình Caco-2 [17]. Độ hòa tan trong nước kém và tốc độ hòa tan thấp, bị vận chuyển ngược bởi P-gp và chịu ảnh hưởng đáng kể bởi chuyển hóa bước một qua gan dẫn đến sinh khả dụng thấp và hạn chế ứng dụng lâm sàng của tanshinon IIA [18] [15] [19].

Hấp thu: Sự hấp thu tanshinon IIA cực kỳ kém với sinh khả dụng dưới 3,5% ở chuột. Điều này có thể do độ hòa tan trong nước thấp và tính thấm qua màng hạn chế [20] [21]. Cơ chế hấp thu ở dạ dày có thể là vận chuyển thụ động, trong khi cơ chế hấp thu ở ruột có thể là khuếch tán chủ động và ruột là nơi hấp thu tốt nhất. Ngoài ra, có nghiên cứu chỉ ra rằng, có nhiều loại vi khuẩn và chất chuyển hóa sinh học trong ruột cũng thúc đẩy sự hấp thu tanshinon IIA [22].

Phân bố: Nghiên cứu ở chuột cho thấy tanshinon IIA phân bố nhanh đến các mô khác nhau và nồng độ tanshinon IIA được ghi nhận cao trong các mô: dạ dày, gan, ruột non, phổi, tim, thận, ngoại trừ não và tinh hoàn. Sự hấp thu và phân bố nhanh này phù hợp với tính thân dầu cao của tanshinon IIA. Việc phân bố mạnh vào mô cũng góp phần làm giảm nồng độ thuốc trong huyết tương. Tanshinon IIA không vào được não và tinh hoàn có thể do không vượt qua được hàng rào máu – não và máu – tinh hoàn.

Ngoài ra, sự phân bố tanshinon IIA ở thận được cho là tương đối thấp [19], [21], [22]. Chuyển hóa: Bi và cộng sự nghiên cứu quá trình chuyển hóa tanshinon IIA trong enzym microsom gan chuột. Kết quả cho thấy các isoenzym CYP2C, 3A và 2D đều tham gia chuyển hóa tanshinon IIA tạo thành tanshinon IIB, hydroxytanshinon IIA và przewaquinon. Trong một nghiên cứu khác cho thấy tanshinon IIA bị oxy hóa mạnh qua trung gian hệ enzym CYP, tạo thành các chất chuyển hóa và tiếp tục bị glucuronid hoá mạnh [20], [22], [23].

5 Thải trừ: Nghiên cứu hiện tại cho thấy thải trừ qua mật và phân là con đường chính để đào thải tanshinon IIA, còn bài tiết qua nước tiểu chỉ đóng vai trò phụ, không phải con đường chính [19]. Tác dụng dược lý Nhiều nghiên cứu cho thấy tanshinon IIA có hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa, tạo ra tác dụng bảo vệ tim mạch thông qua việc tăng cường hình thành mạch, có tác dụng điều hòa miễn dịch sâu rộng và đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và hình thành chức năng của các tế bào miễn dịch. Tanshinon IIA cũng đóng vai trò bảo vệ trong cơ chế bệnh sinh của các rối loạn tim mạch (xơ vữa động mạch, tăng huyết áp) và bệnh Alzheimer.