Nghiên cứu chiết xuất bromelain từ vỏ dứa bằng phương pháp tách hai pha lỏng

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ nghiên cứu chiết xuất bromelain từ vỏ dứa bằng phương pháp tách hai pha lỏng. Tổng quan quy trình và kết quả thực nghiệm.

• Tác giả: Trần Thị Khánh Dương
• Người hướng dẫn: ThS. Mai Văn Hiên
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất Bromelain từ vỏ dứa (Ananas comosus) bằng phương pháp tách hai pha lỏng
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Bromelain và Nguồn gốc từ Vỏ Dứa

Bromelain là một enzyme proteolytic quan trọng được chiết xuất từ vỏ dứa (Ananas comosus), có ứng dụng rộng rãi trong y dược học và các lĩnh vực công nghệ sinh học. Enzyme này được phân loại theo Tiểu ban Enzyme (EC) với khả năng phân hủy các liên kết peptide trong protein. Vỏ dứa là nguồn phồn phú của bromelain, chứa nồng độ enzyme cao và là nguyên vật liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại các khu vực trồng dứa. Việc chiết xuất bromelain từ vỏ dứa không chỉ tận dụng phụ phẩm nông nghiệp mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm dược phẩm giá trị cao. Bromelain có cấu trúc hóa học phức tạp với cấu trúc không gian đặc biệt, cho phép nó hoạt động hiệu quả trong môi trường khác nhau.

1.1. Cấu trúc và Tính chất Hóa lý của Bromelain

Bromelain là một enzyme proteolytic thuộc nhóm cysteine protease với cấu trúc hóa học gồm một chuỗi peptide dài chứa các amino acid quan trọng. Cấu trúc không gian của bromelain được xác định bằng điện di SDS-PAGE, cho thấy khối lượng phân tử khoảng 21-40 kDa. Tính chất hóa lý của enzyme này bao gồm khả năng hoạt động ở pH 6-8, nhiệt độ tối ưu 50-65°C. Enzyme có độ ổn định cao nhưng dễ bị biến tính khi tiếp xúc với nhiệt độ quá cao hoặc pH cực đoan.

1.2. Ứng dụng của Bromelain trong Y Dược và Công Nghiệp

Bromelain có ứng dụng trong y dược học như hỗ trợ tiêu hóa, giảm viêm, và chữa lành vết thương. Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme này được dùng để mềm thịt, làm rõ bia, và sản xuất các sản phẩm lên men. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác bao gồm công nghệ sinh học, sản xuất mỹ phẩm, và nông nghiệp. Khả năng phân hủy protein của bromelain làm cho nó trở thành enzyme đa năng, mang lại giá trị kinh tế cao cho các doanh nghiệp.

II. Phương Pháp Tách 2 Pha Lỏng ATPS cho Chiết Xuất Bromelain

Phương pháp tách 2 pha lỏng (ATPS) là một trong những kỹ thuật tinh sạch enzyme hiệu quả nhất hiện nay, được ứng dụng rộng rãi trong chiết xuất bromelain từ vỏ dứa. Hệ thống này dựa trên nguyên lý tách chiết bằng Polyethylene glycol (PEG) và các muối vô cơ như natri sulfate, natri fosfat. ATPS cho phép tinh sạch bromelain với hiệu suất cao, độ tinh khiết tốt và bảo vệ hoạt tính enzyme tốt hơn so với phương pháp kết tủa truyền thống. Việc tối ưu hóa các thành phần của ATPS và tỷ lệ các thành phần là chìa khóa để đạt hiệu quả chiết xuất tối đa.

2.1. Nguyên Lý và Cơ Chế Hoạt Động của ATPS

Hệ thống hai pha lỏng (ATPS) hoạt động dựa trên sự phân chia protein giữa hai pha: pha trên phong phú PEG và pha dưới chứa muối. Bromelain có xu hướng tích tụ ở pha nhất định tùy thuộc vào pH của ATPS, thành phần và tỷ lệ các thành phần. Nguyên lý này cho phép tách chiết enzyme khỏi các protein khác, lipid, và các chất cản trở. Điều kiện tối ưu của ATPS bao gồm độ pH 6-8, nhiệt độ 4-25°C, và tỷ lệ PEG:muối phù hợp để đạt hiệu suất cao nhất.

2.2. So Sánh ATPS với Các Phương Pháp Tinh Sạch Khác

Phương pháp kết tủa sử dụng axit trichloroacetic (TCA) hoặc muối ammonium sulfate có hiệu suất thấp hơn ATPS. Sắc ký trao đổi ion (IEC) như sắc ký trao đổi cation (CEC) hay sắc ký trao đổi anion (AEC) có thể tinh sạch protein tốt nhưng phức tạp và tốn kém. ATPS kết hợp ưu điểm của cả hai: hiệu suất cao, chi phí thấp, bảo vệ hoạt tính enzyme tốt, và dễ mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp.

III. Quy Trình Chiết Xuất và Tinh Sạch Bromelain thực Tế

Quy trình chiết xuất bromelain từ vỏ dứa bao gồm ba bước chính: chiết lấy dịch vỏ dứa, tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, và tinh sạch bằng ATPS. Đầu tiên, vỏ dứa được cắt nhỏ, rửa sạch, và cho vào dung dịch đệm có pH tối ưu để chiết lấy enzyme. Dịch này chứa bromelain cùng với nhiều protein khác, lipid, và các tạp chất. Sau đó, phương pháp kết tủa được áp dụng để loại bỏ các protein không mong muốn, và cuối cùng ATPS được sử dụng để tinh sạch bromelain đến độ tinh khiết cao. Xác định hoạt tính enzym bromelain bằng các phương pháp xác định hàm lượng protein và điện di SDS-PAGE là bước quan trọng để đánh giá chất lượng sản phẩm.

3.1. Bước Chiết Lấy Dịch Vỏ Dứa

Chiết lấy dịch vỏ dứa là bước đầu tiên và quan trọng trong quy trình chiết xuất bromelain. Vỏ dứa tươi được rửa sạch, cắt nhỏ, và ép để thu được dịch vỏ dứa chứa enzyme bromelain. Dịch này được lọc để loại bỏ các mảnh vụn thô. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết lấy bao gồm tỷ lệ khối lượng vỏ/dung dịch đệm, pH của dung dịch đệm, thời gian chiết, và nhiệt độ. Dịch chiết được bảo quản ở 4°C để bảo vệ hoạt tính của enzyme.

3.2. Tinh Sạch Kết Hợp bằng Kết Tủa và ATPS

Tinh sạch bằng phương pháp kết tủa sử dụng TCA hoặc muối ammonium sulfate để loại bỏ protein nền. Sau đó, tinh sạch bằng ATPS được áp dụng với tỷ lệ các thành phần PEG và muối được tối ưu hóa. Bromelain tích tụ ở pha trên hoặc pha dưới tùy thuộc vào pH của ATPS và thành phần. Qua quá trình này, hiệu quả tinh sạch của ATPS đạt 70-90%, với độ tinh khiết protein chiết xuất tăng đáng kể so với chỉ dùng phương pháp kết tủa đơn thuần.

IV. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng đến Hoạt Tính Bromelain

Hoạt tính enzyme bromelain bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, và thời gian phản ứng. Khảo sát ảnh hưởng của pH cho thấy bromelain có hoạt tính tối ưu ở pH 6.5-7.5, và hoạt tính giảm khi pH quá axit hoặc quá kiềm. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chỉ ra rằng hoạt tính đạt cực đại ở 50-60°C, nhưng giảm nhanh khi nhiệt độ vượt quá 70°C do bromelain bị biến tính. Thời gian phản ứng cũng quan trọng: hoạt tính tăng từ 0-60 phút, sau đó giảm do enzyme bị mất hoạt tính. Hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng này là cơ sở để tối ưu hóa quy trình chiết xuất và bảo vệ hoạt tính của enzyme trong các ứng dụng thực tế.

4.1. Ảnh Hưởng của pH lên Hoạt Tính Enzym

Ảnh hưởng của pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với hoạt tính của enzym bromelain. Khảo sát ảnh hưởng của pH từ 4.0 đến 9.0 cho thấy hoạt tính đạt mức cao nhất ở pH 6.5-7.0. Ở pH tối ưu, enzyme có khả năng phân hủy protein mạnh nhất, cho hoạt tính cao nhất. Khi pH < 6.0 hoặc pH > 8.0, hoạt tính enzyme giảm đáng kể do enzyme bị biến tính một phần. Các điều kiện tối ưu của pH cần được duy trì trong quy trình tinh sạch ATPS để bảo vệ hoạt tính của bromelain.

4.2. Ảnh Hưởng của Nhiệt Độ và Thời Gian Phản Ứng

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cho thấy bromelain có hoạt tính cao nhất ở 50-60°C, đây là nhiệt độ tối ưu của enzyme. Khi nhiệt độ tăng lên 70°C, hoạt tính giảm do enzyme bị biến tính. Thời gian phản ứng cũng ảnh hưởng: hoạt tính tăng tuyến tính từ 0-60 phút, sau đó plateauing hoặc giảm nhẹ. Sự kết hợp giữa nhiệt độ tối ưu 55°C và thời gian 45-60 phút cho hoạt tính cao nhất. Để bảo vệ hoạt tính enzyme, cần tránh tiếp xúc lâu dài với nhiệt độ cao, đặc biệt là trong quy trình tinh sạch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, với sự phát triển không ngừng của ngành công nghiệp tại nước ta nói riêng và trên toàn thế giới nói chung, mối quan tâm về việc sử dụng hiệu quả dư lượng nông nghiệp, chẳng hạn như vỏ, hạt và các vật liệu khác từ ngành công nghiệp thực phẩm ngày càng trở thành một vấn đề quan trọng [1]. Dứa là loại phổ biến nhất trong tất cả các loại trái cây nhiệt đới và trở thành một thành phần quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm với các sản phẩm như nước trái cây cô đặc, mứt, thạch, tinh chất,…[2]. Tuy nhiên, chỉ có 25% trong số đó có thể được sử dụng như một sản phẩm bán trên thị trường, trong khi 75% còn lại (lá, ngọn, thân và vỏ) được coi là chất thải nông nghiệp [3]. Trên thực tế, chất thải từ dứa đã được xác định là một nguồn tiềm năng của protease, chẳng hạn như bromelain [4].

Bromelain đã được ứng dụng trong y học dân gian từ nhiều năm trước để giải quyết các vấn đề về sức khỏe [5]. Nó sở hữu một loạt các ứng dụng điều trị như tiêu sợi huyết, chống huyết khối, chống ung thư, chống viêm và chống vi khuẩn. Ngoài ra, bromelain còn có nhiều ứng dụng công nghiệp khác nhau bao gồm thực phẩm, dệt may và công nghiệp mỹ phẩm [6]. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm và đồ uống của bromelain là lớn nhất, các phần này trong suốt giai đoạn dự báo từ 2017-2025, đều dự kiến sẽ chiếm hơn 85% thị phần bromelain toàn cầu [7].

Sự quan tâm đối với những ứng dụng của bromelain đã khuyến khích nhiều nhà nghiên cứu phân lập, tinh sạch và mô tả đặc điểm của enzym bromelain từ phế phẩm hoặc nước trái cây dứa. Bên cạnh đó, phương pháp tách chiết 2 pha lỏng có nhiều ưu điểm như chi phí vật liệu thấp, độ căng bề mặt thấp, khả năng tương thích sinh học cao, không độc hại, tiêu thụ năng lượng và thời gian tối thiểu, năng suất cao [8]. Điều này làm cho nó trở thành một giải pháp thay thế hấp dẫn để phân lập các phân tử sinh học [9]. Tuy nhiên, hiệu suất tách chiết phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần, tỷ lệ 2 pha, pH, nhiệt độ, thời gian, và các điều kiện khác [10].

Xuất phát từ tình hình thực tế, đề tài “Nghiên cứu chiết xuất Bromelain từ vỏ dứa bằng phương pháp tách 2 pha lỏng” được thực hiện với 3 mục tiêu chính: 1. Đánh giá hiệu quả tinh sạch của phương pháp tách hai pha lỏng trong quy trình tách chiết bromelain từ vỏ dứa. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình tinh sạch bromelain từ vỏ dứa bằng phương pháp tách hai pha lỏng. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain từ vỏ dứa.

Định nghĩa Bromelain là một hỗn hợp các enzyme tiêu protein (protease) được chiết xuất từ cây dứa (thân, quả, lá). Nó là một loại enzyme cystein protease, có khả năng phân giải protein thành các peptide và axit amin nhỏ hơn [6], [11], [12], [13]. Bromelain lần đầu tiên được xác định vào năm 1876 nhưng chưa được phân lập, tinh chế, mô tả đầy đủ [14]. Nguồn gốc Bromelain là một enzym phân giải protein có nguồn gốc từ cây Ananas comosus (dứa) thuộc họ thực vật Bromeliaceae và là một trong số các protease thực vật có giá trị thương mại cao nhất hiện nay.

Enzym bromelain chủ yếu được chiết xuất tự nhiên từ thịt quả dứa (EC 3.33) hoặc thân cây dứa (EC 3. Bên cạnh đó, bromelain có thể được tìm thấy trong các bộ phận không sử dụng đến của dứa như vỏ, lõi, và ngọn [8]. Cấu trúc và tính chất hóa lý 1. Cấu trúc hóa học của bromelain Bromelain là một enzym thuộc nhóm enzym thiol protease.

Khác với các protease thực vật khác như papain hay ficin, bromelain là một glycoprotein gồm phần protein và phi protein. Phần phi protein là một chuỗi oligosaccharid bao gồm 1 fructose, 1 xylose, 2 N-acetylglucosamin (GlcNAc) và 3 mannose [15], [16], [17]. Cấu trúc sợi hydratcarbon của bromelain [15] Phần nối trực tiếp với mạch polypeptid của phần protein là glucosamin. Tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần của amino acid trong bromelain được chiết xuất từ thân và quả là khác nhau.

Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 144 – 321 amino acid và bromelain quả là 161 – 283 2 amino acid. Bromelain thân là một sợi polypeptid có amino acid ở đầu amin là valin và ở đầu carbohydrat là glycin, còn bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanin [15]. Cấu trúc không gian của bromelain Cấu trúc bậc 1 của bromelain được phân tích và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử như sau [15]: Bromelain là một protease trong trung tâm hoạt động có chứa cystein và hai sợi polypeptid liên kết với nhau bằng cầu nối disulfur S-S. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp.

Trong phân tử bromelain thân chứa nhóm sulfuhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác, trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfit. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có lẽ có vai trò trong việc duy trì cấu trúc không gian của enzym [15]. Cấu trúc không gian của bromelain [18] 1. Tính chất hoá lý của bromelain Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelain thân dứa được công bố vào năm 1964 như sau [15]: 3 Bảng 1.

Tính chất vật lý của enzym bromelain Hằng số sa lắng S 2,73S Hằng số khuếch tán D 7,77 x 10-7 cm2/s Thể tích riêng phần V 0,743 ml/g Độ nhớt bên trong [I] 0,039 dl/g Tỷ số ma sát f/fo 1,26 Điểm đẳng điện pI 9,55 1% Sự hấp thụ A cm ở 280 nm 20,1 Các thông số về khối lượng phân tử, điểm đẳng điện, độ hấp thụ tại bước sóng 280nm, sự có mặt của glycoprotein trong bromelain từ thân và quả được thể hiện trong bảng dưới đây [18]: Bảng 1. So sánh một số đặc điểm giữa bromelain thân và bromelain quả Bromelain quả Bromelain thân MW 25 – 31 kDa 23,4 – 35,73 kDa pI 4,6 9,55 Glycoprotein Không có Có A1%cm 280nm 19,2 20,1 1. Cơ chế hoạt động Hiện tại, bromelain trong thân dứa được ghi nhận có tám thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein. Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5.

Phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% trên tổng số protein. Bromelain được chiết tách từ các phần khác nhau trên cây dứa sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein là như nhau [15]. Bằng chứng thu được dựa trên việc quan sát một dải hấp thụ có cường độ cực đại ở 316nm của một chất trung gian là S-acyl-enzym sau khi trộn bromelain và methyl thionohippurat. Trong bước acyl hóa, người ta nghi ngờ rằng chức năng cho hoặc nhận proton là của nhóm imidazol của gốc histidyl duy nhất nằm rất gần về mặt không gian với nhóm sulfuhydryl [17].

Các bước quá trình xúc tác của bromelain được mô tả như sau [19]: Bước 1: Enzym tự do (cấu trúc a) liên kết với cơ chất tạo thành phức hợp (cấu trúc b). Bước 2: Xảy ra quá trình acyl hóa enzym (cấu trúc c) tạo ra R ’-NH2. Bước 3: Cuối cùng xảy ra phản ứng deacyl hóa acyl – enzym để giải phóng acid cacboxylic và enzym tự do. Cơ chế xúc tác của enzym bromelain [19] 1.

Ứng dụng Bromelain từ dứa có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp chế biến và có ý nghĩa đặc biệt với y dược học. Ứng dụng trong y dược học Trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe, bromelain đã được sử dụng để điều trị bệnh viêm tắc tĩnh mạch, tụ máu, viêm miệng, loét do tiểu đường, trực tràng và viêm quanh trực tràng, đau thắt ngực, viêm phế quản, viêm xoang,…[6], [20]. Trong mọi trường hợp, khi dùng qua đường uống, bromelain đã được chứng minh là làm giảm đáng kể cơn đau và sưng tấy [6], [11]. 5 Bromelain ảnh hưởng đến quá trình đông máu thông qua khả năng tiêu sợi huyết của huyết thanh ngăn ngừa sự tổng hợp các protein đông máu như fibrin [21].

Bromelain hạn chế sản xuất fibrin bằng cách giảm một số chất trung gian của quá trình hình thành cục máu đông (yếu tố X và prothrombin) và đẩy nhanh quá trình xơ hóa [22]. Bromelain có tác dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm thấp khớp, do đó các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm giảm đau, kháng viêm và kháng sưng. Cơ chế của bromelain là làm giảm số lượng các prostagladin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản những tiền chất gây viêm [15]. Bromelain tăng cường khả năng miễn dịch phụ thuộc tế bào T trong cơ thể sống [23], giảm sự phát triển của phản ứng dị ứng bằng cách thay đổi quần thể tế bào lympho T CD4+ thành CD8+, từ đó gợi ý bromelain có thể tạo ra những tác dụng tương tự trong điều trị bệnh hen suyễn và quá mẫn [24].

Gần đây, nhiều bằng chứng cho thấy bromelain có thể là một chất chống lại tế bào ung thư bằng cách gây ra apoptosis các tế bào ung thư ở người [25]. Điều trị các bệnh tim mạch Hiệu quả trong Giúp loại bỏ các điều trị viêm khớp mô bị tổn dạng thấp thương BROMELAIN Chống lại các Có hoạt tính mầm bệnh đường chống ung thư ruột Có hoạt tính Có tác dụng điều kháng vi sinh hòa miễn dịch vật Hình 1. Một số ứng dụng trong y dược học của bromelain [26] 1. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác Bên cạnh những ứng dụng quan trọng trong lĩnh vực sức khỏe, bromelain còn được ứng dụng trong nhiều ngành như mỹ phẩm, thực phẩm,… Nhờ đặc tính kháng khuẩn, bromelain được ứng dụng để điều trị mụn trứng cá.

Trong ngành công nghiệp 6 thực phẩm, bromelain chủ yếu được sử dụng để làm mềm thịt bằng cách thủy phân các protein myofibril của thịt. Ứng dụng của bromelain trong các lĩnh vực khác Ngành Ứng dụng TLTK - Cải thiện độ giãn nở của bột và giúp Ngành làm bánh bột nở đều. [27], [28], [29] - Sản xuất bột ít gây dị ứng. - Thủy phẩm protein cơ thịt.

[30], [31], [32], Làm mềm thực phẩm - Làm chất thủy phân cho thịt, hàu, [33] gà,… - Tăng độ bền protein trong bia Sản xuất rượu [34] - Ngăn ngừa hiện tượng mờ đục Ước tính sự phân giải protein trong dạ Thức ăn chăn nuôi [35] cỏ ở động vật nhai lại - Giảm thời gian nấu kén tơ - Loại bỏ lớp vảy và tạp chất của len và Ngành dệt may [36], [37] tơ tằm - Tăng khả năng nhuộm sợi - Loại bỏ vết ố, mảng bám và thức ăn Tẩy trắng răng [38], [39] trên bề mặt răng - Điều trị mụn, nếp nhăn và bong tróc Ngành mỹ phẩm da.