Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên

Luận văn nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên. Giải pháp sinh học an toàn, hiệu quả cho nông nghiệp.

• Tác giả: Trần Chung Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Trương Phúc Hưng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
• 1.1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt
• 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới
• 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam
• 1.1.2. Đại cương về vi khuẩn Bt
• 1.1.2.1. Sự phân bố của Bt
• 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 1.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
• 1.1.2.4. Phân loại Bt
• 1.1.2.5. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis
• 1.1.2.6. Tính chất nuôi cấy
• 1.1.2.7. Độc tố của Bt
• 1.1.2.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng
• 1.2. Tổng quan về sâu tơ (côn trùng thử nghiệm)
• 1.3. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis
• 1.3.1. Phương pháp lên men bề mặt
• 1.3.2. Lên men chìm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis
• 2.3.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch
• 2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.3.4. Phương pháp lên men vi sinh vật
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis
• 3.1.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis
• 3.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập
• 3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
• 3.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bacillus thiringiensis phân lập
• 3.3. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
• 3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2
• 3.3.2. Lên men TC2.5 tạo chế phẩm
• 3.3.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Chế phẩm sinh học Bt Giải pháp diệt sâu tơ hiệu quả

Chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (thường gọi là Bt) đang nổi lên như một giải pháp thay thế bền vững cho thuốc trừ sâu hóa học. Đây là một loại thuốc trừ sâu vi sinh có nguồn gốc tự nhiên, được sản xuất thông qua quá trình lên men vi khuẩn Bt. Vi khuẩn này tồn tại phổ biến trong đất và có khả năng tạo ra một loại protein tinh thể độc, có tác dụng đặc hiệu lên một số loài côn trùng gây hại, đặc biệt là sâu tơ. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bt bắt đầu từ đầu thế kỷ 20, khi nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát hiện ra vi khuẩn này từ tằm bị bệnh vào năm 1901. Sau đó, vào năm 1911, E. Berliner đã phân lập được loài tương tự và đặt tên chính thức là Bacillus thuringiensis. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về Bt đã được triển khai từ những năm 1970 tại Viện Bảo vệ Thực vật và dần được mở rộng. Ưu điểm vượt trội của thuốc trừ sâu sinh học Bt là tính chọn lọc cao, chỉ tác động đến côn trùng mục tiêu mà không gây hại cho con người, vật nuôi và các sinh vật có ích khác. Điều này giúp bảo vệ cân bằng sinh thái và giảm thiểu ô nhiễm môi trường, phù hợp với định hướng nông nghiệp bền vững. Việc sử dụng các chế phẩm này cũng giúp giảm thiểu vấn đề tồn dư hóa chất độc hại trên nông sản, đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Với những đặc tính ưu việt đó, chế phẩm sinh học Bt không chỉ là một công cụ quan trọng trong quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) mà còn là lựa chọn hàng đầu cho các mô hình nông nghiệp hữu cơ và nông nghiệp sạch.

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis Bt

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn gram dương, hình que, tồn tại phổ biến trong môi trường đất. Đặc điểm nổi bật nhất của vi khuẩn này là khả năng sinh ra nội bào tử và một tinh thể protein độc (gọi là nội độc tố δ) trong giai đoạn bào tử hóa. Chính tinh thể protein này là yếu tố cốt lõi tạo nên khả năng diệt côn trùng của Bt. Tinh thể này có hình dạng đa dạng như hình tháp, hình lập phương, hình ovan, và chiếm khoảng 25% khối lượng khô của tế bào. Về mặt sinh hóa, Bt có khả năng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, ở nhiệt độ tối ưu khoảng 28-30°C và độ pH trung tính từ 6.5 - 7.5. Những đặc điểm này làm cho việc nuôi cấy và sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt trên quy mô công nghiệp trở nên khả thi và hiệu quả.

1.2. Phân loại và sự đa dạng của các chủng vi khuẩn Bt

Vi khuẩn Bt được phân loại thành nhiều dưới loài (variety) khác nhau, dựa trên đặc tính huyết thanh học của kháng nguyên lông roi (kháng nguyên H). Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được hàng chục typ huyết thanh khác nhau. Mỗi dưới loài thường có phổ tác động của Bt đặc trưng lên một nhóm côn trùng nhất định. Ví dụ, Bt var. kurstaki (typ huyết thanh H3a,3b,3c) có hoạt tính mạnh với côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera) như sâu tơ, sâu xanh; trong khi đó Bt var. israelensis lại hiệu quả trong việc diệt ấu trùng muỗi (bộ hai cánh - Diptera). Sự đa dạng này cho phép phát triển nhiều loại sản phẩm chứa vi khuẩn Bt chuyên biệt cho từng loại sâu hại, tăng cường hiệu quả kiểm soát và giảm thiểu tác động đến các loài không phải mục tiêu.

II. Sâu tơ kháng thuốc Thách thức lớn cho rau họ thập tự

Sâu tơ (Plutella xylostella) là một trong những loài dịch hại nguy hiểm nhất trên toàn cầu, đặc biệt đối với các loại cây trồng thuộc rau họ thập tự như bắp cải, su hào, súp lơ. Vòng đời của sâu tơ khá ngắn, chỉ khoảng 20-30 ngày trong điều kiện nhiệt độ 20-30°C, nhưng khả năng sinh sản rất cao. Sâu non là giai đoạn gây hại chính, chúng ăn biểu bì và thịt lá, tạo ra các lỗ thủng lỗ chỗ. Khi mật độ sâu cao, toàn bộ ruộng rau có thể bị phá hủy xơ xác, chỉ còn trơ lại gân lá, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và chất lượng nông sản. Vấn đề lớn nhất hiện nay là tình trạng sâu tơ kháng thuốc trừ sâu hóa học ngày càng gia tăng. Việc lạm dụng các loại thuốc hóa học có phổ tác động rộng trong thời gian dài đã vô tình chọn lọc ra các cá thể sâu có khả năng chống chịu cao. Theo nhiều nghiên cứu, trong cơ thể sâu tơ có một hệ men vi thể (microsomal enzyme system) có khả năng phân giải hoạt chất của thuốc thành chất không độc. Khi tiếp xúc với hóa chất, hệ men này được kích hoạt mạnh mẽ, làm giảm hiệu lực của thuốc. Tình trạng này buộc nông dân phải tăng liều lượng, tần suất phun thuốc, dẫn đến chi phí sản xuất tăng cao, ô nhiễm môi trường nặng nề và tồn dư hóa chất độc hại trên rau màu, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Đây là một thách thức lớn, đòi hỏi phải có những giải pháp kiểm soát dịch hại mới, an toàn và bền vững hơn, trong đó thuốc trừ sâu hữu cơ từ Bt là một lựa chọn đầy hứa hẹn.

2.1. Đặc điểm sinh học và tác hại của sâu tơ hại bắp cải

Sâu tơ thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), trải qua 4 giai đoạn phát triển: trứng, sâu non, nhộng và bướm trưởng thành. Sâu non có 4 tuổi, gây hại từ khi mới nở cho đến khi hóa nhộng. Chúng không chỉ tấn công sâu tơ hại bắp cải mà còn gây hại trên nhiều loại rau màu khác, làm giảm năng suất từ 30-40%. Thiệt hại không chỉ dừng lại ở việc lá bị ăn thủng, mà còn làm giảm giá trị thương phẩm của rau, khiến nông sản khó tiêu thụ. Mức độ phá hoại của chúng đặc biệt nghiêm trọng vào mùa khô, khi điều kiện thời tiết thuận lợi cho sự phát triển của sâu.

2.2. Hạn chế của thuốc hóa học trong quản lý sâu tơ

Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để kiểm soát sâu tơ gặp nhiều hạn chế. Ngoài vấn đề sâu tơ kháng thuốc, các loại thuốc này thường tiêu diệt cả thiên địch (côn trùng có ích), làm mất cân bằng sinh thái trong hệ sinh thái nông nghiệp. Điều này có thể dẫn đến sự bùng phát trở lại của các loài dịch hại khác. Hơn nữa, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trên thuốc sinh học cho rau màu là một vấn đề nhức nhối, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm và các rào cản xuất khẩu nông sản. Thời gian cách ly của thuốc hóa học thường dài, gây khó khăn cho việc thu hoạch và cung ứng sản phẩm kịp thời ra thị trường.

III. Phương pháp diệt sâu tơ của Bt qua Protein độc tố Cry

Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis là một quá trình sinh học vô cùng đặc hiệu và độc đáo, hoàn toàn khác biệt so với các loại thuốc hóa học. Yếu tố quyết định khả năng diệt côn trùng của Bt chính là nội độc tố δ, hay còn gọi là protein độc tố Cry. Các protein này được tổng hợp và kết tinh trong tế bào vi khuẩn ở giai đoạn hình thành bào tử. Khi sâu tơ ăn phải lá cây có chứa bào tử và tinh thể độc của Bt, một chuỗi phản ứng sinh hóa sẽ diễn ra bên trong đường ruột của chúng. Môi trường ruột giữa của sâu tơ có độ pH kiềm cao (thường > 9.5), đây là điều kiện lý tưởng để hòa tan các tinh thể protein Cry. Sau khi hòa tan, các enzyme protease trong ruột sâu sẽ cắt các tiền độc tố (protoxin) có khối lượng phân tử lớn (khoảng 130-140 kDa) thành các độc tố hoạt động có kích thước nhỏ hơn. Các phân tử độc tố hoạt động này sau đó sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột của sâu. Sự gắn kết này kích hoạt một quá trình làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, tạo ra các lỗ thủng hoặc kênh ion. Các lỗ thủng này phá vỡ sự cân bằng thẩm thấu, khiến nước và các ion từ bên ngoài tràn vào trong tế bào một cách không kiểm soát, làm tế bào trương phồng lên và vỡ ra. Hậu quả là thành ruột bị phá hủy, sâu ngừng ăn, bị tê liệt và chết sau khoảng 2-4 ngày. Đây là một cơ chế tự nhiên, an toàn và có tính chọn lọc cao.

3.1. Cơ chế diệt sâu của Bt từ tinh thể độc đến tế bào

Quá trình tác động của Bt có thể tóm tắt qua các bước chính: (1) Sâu ăn phải tinh thể độc; (2) Tinh thể hòa tan trong môi trường pH kiềm của ruột giữa; (3) Enzyme protease hoạt hóa tiền độc tố; (4) Độc tố hoạt động gắn vào thụ thể trên thành ruột; (5) Hình thành lỗ thủng trên màng tế bào; (6) Tế bào biểu mô ruột bị phá hủy và sâu chết. Cơ chế diệt sâu của Bt này có tính đặc hiệu rất cao, bởi vì độc tố chỉ có thể gắn vào các thụ thể tương thích. Do con người và các động vật có xương sống không có môi trường pH kiềm trong ruột và không có các thụ thể này, nên chế phẩm Bt hoàn toàn an toàn.

3.2. Vai trò của các gen Cry và tính đặc hiệu của độc tố

Có rất nhiều loại protein độc tố Cry khác nhau, được mã hóa bởi các gen cry tương ứng. Các nhà khoa học đã phân loại chúng thành nhiều họ khác nhau (Cry1, Cry2, Cry3, etc.). Mỗi họ protein lại có độc tính đặc hiệu với một nhóm côn trùng nhất định. Ví dụ, protein Cry1 (như Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac) có hoạt tính rất mạnh đối với côn trùng bộ Cánh vảy (sâu tơ, sâu khoang), trong khi protein Cry3 lại hiệu quả với bộ Cánh cứng. Tính đặc hiệu này là chìa khóa cho việc diệt sâu tơ an toàn, giúp bảo vệ các loài côn trùng có ích như ong mật, bọ rùa và các loài thiên địch khác, duy trì sự đa dạng sinh học trong hệ sinh thái nông nghiệp.

IV. Hướng dẫn quy trình tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ

Quy trình tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis là một quá trình công nghệ sinh học phức tạp, đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ từ khâu tuyển chọn giống đến sản xuất. Bước đầu tiên và quan trọng nhất là phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bt có hoạt tính diệt sâu cao. Các nhà khoa học thu thập mẫu đất từ nhiều vùng sinh thái khác nhau, sau đó tiến hành phân lập để tìm kiếm các chủng Bt tự nhiên. Theo nghiên cứu của Trần Chung Dũng (2019) tại Thái Nguyên, từ 30 mẫu đất đã phân lập được 81 chủng Bt. Các chủng này sau đó được sàng lọc dựa trên hình thái tinh thể độc và đặc biệt là thử hoạt tính sinh học trực tiếp trên sâu tơ. Chủng TC2.5 trong nghiên cứu này đã thể hiện hoạt tính vượt trội, có khả năng diệt 100% sâu thử nghiệm. Sau khi chọn được chủng giống ưu tú, bước tiếp theo là tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy lên men. Quá trình lên men được thực hiện trong các nồi lên men hiện đại, nơi các thông số như nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy và sục khí được kiểm soát tự động để vi khuẩn sinh trưởng và tạo bào tử, tinh thể độc một cách tối đa. Môi trường lên men thường chứa các nguồn cacbon, nitơ và khoáng chất cần thiết. Nghiên cứu chỉ ra rằng nhiệt độ tối ưu cho chủng TC2.5 là khoảng 30°C và pH từ 6.5 - 7.5. Khi quá trình lên men kết thúc (thường sau 48-72 giờ), dịch nuôi cấy chứa sinh khối vi khuẩn (bào tử và tinh thể) sẽ được thu hồi. Cuối cùng, sinh khối này được xử lý để tạo thành sản phẩm cuối cùng, có thể ở dạng bột thấm nước hoặc dạng lỏng, sẵn sàng để sử dụng.

4.1. Kỹ thuật phân lập và sàng lọc chủng Bt hoạt tính cao

Phương pháp phân lập thường bắt đầu bằng việc xử lý nhiệt mẫu đất để tiêu diệt các vi sinh vật không sinh bào tử. Dịch mẫu sau đó được pha loãng và trải trên môi trường thạch dinh dưỡng MPA. Các khuẩn lạc đặc trưng của chi Bacillus sẽ được chọn lọc và quan sát dưới kính hiển vi để xác định sự hiện diện của bào tử và tinh thể độc. Các chủng có tiềm năng sẽ tiếp tục được định danh bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch và thử hoạt tính diệt sâu trên côn trùng mục tiêu để chọn ra chủng có hiệu quả cao nhất cho việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt.

4.2. Công nghệ lên men và thu hồi sản phẩm thuốc trừ sâu vi sinh

Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh chủ yếu dựa trên phương pháp lên men chìm. Trong phương pháp này, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng, trong các thiết bị lên men lớn có hệ thống điều khiển tự động. Mục tiêu là tạo ra mật độ tế bào, bào tử và tinh thể độc cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Sau khi lên men, sinh khối được thu hồi bằng các phương pháp như ly tâm hoặc lọc. Để tạo chế phẩm dạng bột, sinh khối có thể được phối trộn với các chất phụ gia và sấy khô (ví dụ: sấy phun, đông khô) để đảm bảo độ ổn định và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm.

V. Kết quả ứng dụng thực tiễn chế phẩm Bt diệt sâu tơ

Hiệu quả của chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu khoa học và ứng dụng thực tiễn trên đồng ruộng. Một trong những minh chứng điển hình là kết quả từ luận văn của Trần Chung Dũng (2019) về việc nghiên cứu tạo chế phẩm từ chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên. Nghiên cứu này đã lựa chọn ra chủng TC2.5 thuộc dưới loài B. thuringiensis var. kurstaki, có hoạt tính diệt sâu tơ vượt trội. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ chỉ 10^5 bào tử/ml, chế phẩm từ chủng TC2.5 đã tiêu diệt 100% sâu tơ (Plutella xylostella) sau 3 ngày. Khi tăng nồng độ lên 10^7 bào tử/ml, hiệu quả diệt sâu vẫn duy trì ở mức tuyệt đối. Điều này khẳng định tiềm năng to lớn của các chủng Bt bản địa trong việc phát triển các sản phẩm chứa vi khuẩn Bt hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện Việt Nam. Trên thực tế, khi sử dụng các chế phẩm Bt thương mại, nông dân nhận thấy hiệu quả kiểm soát sâu tơ rất tốt, đặc biệt khi phun thuốc vào giai đoạn sâu còn non (tuổi 1-2). Một ưu điểm quan trọng là thời gian cách ly thuốc Bt rất ngắn, thường chỉ từ 0-3 ngày. Điều này cho phép nông dân có thể thu hoạch rau màu gần như ngay sau khi phun, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và linh hoạt trong kế hoạch sản xuất. Việc sử dụng chế phẩm Bt không chỉ giúp diệt sâu tơ an toàn mà còn góp phần giảm chi phí đầu vào do giảm sự phụ thuộc vào thuốc hóa học đắt tiền.

5.1. Đánh giá hiệu quả của chủng Bt TC2.5 phân lập tại Việt Nam

Chủng Bt-TC2.5 được xác định thuộc dưới loài kurstaki thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b, 3c. Đây là dưới loài có hoạt tính mạnh nhất với sâu thuộc bộ Cánh vảy. Thí nghiệm cho thấy, sau khi sâu ăn lá có tẩm dịch chế phẩm Bt-TC2.5, 100% số sâu đã chết trong vòng 3 ngày, trong khi ở lô đối chứng (lá cây ngâm nước cất), sâu vẫn sống khỏe mạnh. Kết quả này không chỉ chứng minh hoạt tính diệt sâu cao của chủng Bt-TC2.5 mà còn mở ra hướng sản xuất chế phẩm thuốc sinh học cho rau màu từ nguồn vi sinh vật bản địa, có khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu địa phương.

5.2. Hướng dẫn sử dụng và lưu ý về thời gian cách ly thuốc Bt

Để đạt hiệu quả cao nhất, cần phun thuốc vào lúc chiều mát vì hoạt lực của Bt có thể bị suy giảm dưới tác động của tia cực tím trong ánh nắng mặt trời. Cần đảm bảo thuốc được phun đều trên cả hai mặt lá, nơi sâu tơ ẩn náu và ăn lá. Nên phun khi sâu còn non (tuổi nhỏ) vì lúc này sức đề kháng của chúng còn yếu. Một trong những lợi ích lớn nhất là thời gian cách ly thuốc Bt gần như bằng không, rất an toàn cho cả người phun và người tiêu dùng. Tuy nhiên, vẫn cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về liều lượng và cách pha chế để đảm bảo hiệu quả tối ưu.

VI. Tương lai của thuốc trừ sâu hữu cơ trong nông nghiệp bền vững

Trong bối cảnh nông nghiệp toàn cầu đang hướng tới sự phát triển bền vững, an toàn và thân thiện với môi trường, vai trò của các loại thuốc trừ sâu hữu cơ và sinh học ngày càng trở nên quan trọng. Chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis là một ví dụ tiêu biểu cho xu hướng này. Tương lai của Bt không chỉ dừng lại ở việc thay thế thuốc hóa học mà còn là một thành phần không thể thiếu trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM). Việc kết hợp sử dụng chế phẩm Bt với các biện pháp khác như canh tác, sử dụng thiên địch và bẫy sinh học sẽ tạo ra một hệ thống phòng trừ sâu hại hiệu quả, toàn diện và bền vững, giúp giảm thiểu tối đa sự hình thành tính kháng thuốc của sâu hại. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ tiếp tục tập trung vào việc khám phá các chủng Bt mới có phổ tác động rộng hơn hoặc chuyên biệt hơn, cải tiến công nghệ lên men để hạ giá thành sản phẩm, và phát triển các công thức chế phẩm mới có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường như nắng, mưa. Hơn nữa, công nghệ gen đang mở ra hướng tạo ra các cây trồng chuyển gen mang gen cry của Bt, giúp cây tự sản sinh protein độc tố để chống lại sâu hại. Đây là một bước tiến đột phá, hứa hẹn sẽ thay đổi căn bản phương thức bảo vệ thực vật. Với những tiềm năng to lớn đó, các sản phẩm chứa vi khuẩn Bt chắc chắn sẽ tiếp tục là công cụ đắc lực, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, sản xuất ra những nông sản sạch, an toàn cho sức khỏe con người và bảo vệ môi trường sống.

6.1. Vai trò của Bt trong Quản lý Dịch hại Tổng hợp IPM

Trong hệ thống IPM, thuốc trừ sâu sinh học Bt được xem là một công cụ phòng trừ chọn lọc. Nó giúp kiểm soát quần thể sâu hại mục tiêu mà không làm ảnh hưởng đến các loài thiên địch. Điều này cho phép các loài côn trùng có ích tiếp tục phát triển và thực hiện vai trò kiểm soát sinh học tự nhiên. Việc tích hợp Bt vào quy trình canh tác giúp nông dân giảm sự phụ thuộc vào một phương pháp duy nhất, từ đó làm chậm quá trình phát triển tính kháng thuốc và duy trì hiệu quả phòng trừ lâu dài, đóng góp vào mục tiêu của nông nghiệp bền vững.

6.2. Hướng phát triển các sản phẩm chứa vi khuẩn Bt thế hệ mới

Nghiên cứu và phát triển không ngừng tạo ra các thế hệ sản phẩm chứa vi khuẩn Bt mới với nhiều cải tiến. Các nhà khoa học đang tìm cách kết hợp nhiều loại protein Cry khác nhau trong cùng một sản phẩm để mở rộng phổ tác động của Bt và đối phó với hiện tượng sâu kháng thuốc. Công nghệ vi nang (microencapsulation) cũng đang được áp dụng để bảo vệ hoạt chất Bt khỏi tác động của tia UV, kéo dài thời gian hiệu lực của thuốc sau khi phun. Ngoài ra, việc tìm kiếm và khai thác các chủng Bt mới từ các hệ sinh thái độc đáo trên toàn thế giới vẫn là một hướng đi đầy triển vọng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Sâu hại là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất cho ngành nông nghiệp toàn cầu, với ước tính thiệt hại hàng năm lên đến khoảng 16-18% tổng sản lượng. Để giải quyết vấn đề này, thuốc trừ sâu hóa học đã được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên, việc lạm dụng chúng đã dẫn đến nhiều hệ lụy nghiêm trọng như hiện tượng kháng thuốc ở côn trùng, tiêu diệt các sinh vật có ích, gây mất cân bằng sinh thái và tích tụ chất độc trong môi trường, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Trong bối cảnh đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và bền vững trở nên cấp thiết. Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) nổi lên như một giải pháp tiềm năng nhờ tính đặc hiệu cao, chỉ tác động lên côn trùng đích và hoàn toàn thân thiện với môi trường.

Nghiên cứu này tập trung vào mục tiêu tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) cao, phân lập từ các mẫu đất tại tỉnh Thái Nguyên – một khu vực có sự đa dạng sinh học cao. Cụ thể, luận văn đặt ra ba mục tiêu chính: (1) Phân lập và sàng lọc được chủng Bt có hoạt tính diệt sâu tơ mạnh nhất; (2) Nghiên cứu và tối ưu hóa các điều kiện lên men (pH, nhiệt độ) để tối đa hóa sinh khối của chủng vi khuẩn được chọn; (3) Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học dạng bột từ chủng vi khuẩn này. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 30 mẫu đất thu thập tại ba khu vực đặc trưng của Thái Nguyên trong năm 2019. Ý nghĩa thực tiễn của luận văn là cung cấp một chủng vi khuẩn bản địa, TC2.5, có khả năng diệt 100% sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm, mở ra tiềm năng phát triển một sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học "made in Vietnam" hiệu quả và an toàn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nền tảng của nghiên cứu này dựa trên hai cơ sở lý thuyết chính trong lĩnh vực vi sinh vật học ứng dụng và công nghệ sinh học.

Thứ nhất là lý thuyết về cơ chế tác động của nội độc tố δ-endotoxin từ Bacillus thuringiensis. Lý thuyết này giải thích rằng khi côn trùng mẫn cảm (chủ yếu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng, hai cánh) ăn phải bào tử và tinh thể protein của vi khuẩn Bt, môi trường pH kiềm cao trong ruột giữa của chúng sẽ hòa tan các tinh thể này. Các enzyme protease trong ruột sau đó hoạt hóa tiền độc tố thành độc tố hoạt động. Phân tử độc tố này sẽ gắn đặc hiệu vào các thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, chèn vào màng tế bào và tạo ra các lỗ thủng. Sự hình thành các kênh ion này làm phá vỡ cân bằng thẩm thấu, khiến tế bào bị trương phồng, ly giải và dẫn đến tử vong cho côn trùng. Tính đặc hiệu của cơ chế này là chìa khóa cho sự an toàn của chế phẩm Bt.

Thứ hai, nghiên cứu áp dụng lý thuyết phân loại huyết thanh học (serotyping) dựa trên kháng nguyên lông roi H, do de Barjac và Bonnefoi đề xuất năm 1962. Phương pháp này cho phép phân loại các chủng Bt thành nhiều dưới loài (subspecies) khác nhau, mỗi dưới loài thường có phổ độc tính đặc trưng với một nhóm côn trùng nhất định. Việc xác định đúng dưới loài, ví dụ như Bacillus thuringiensis var. kurstaki có hiệu quả cao với sâu tơ, là bước quan trọng để sàng lọc và định hướng ứng dụng.

Các khái niệm chính được sử dụng xuyên suốt luận văn bao gồm:

• Bacillus thuringiensis (Bt): Vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử, tồn tại phổ biến trong đất, có khả năng tạo ra protein tinh thể độc với côn trùng.
• Protein tinh thể (Cry protein): Nội độc tố chính của Bt, quyết định hoạt tính và phổ diệt côn trùng.
• Sâu tơ (Plutella xylostella): Một loài sâu hại nguy hiểm trên các cây họ hoa thập tự, có khả năng kháng thuốc hóa học cao.
• Lên men chìm: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng, có sục khí và khuấy trộn, nhằm thu được sinh khối lớn ở quy mô công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp phân tích định lượng trong phòng thí nghiệm.

Nguồn dữ liệu được thu thập từ hai nguồn chính. Dữ liệu sơ cấp bao gồm 30 mẫu đất được lấy từ các vùng nông nghiệp và đồi chè đặc trưng của tỉnh Thái Nguyên (Tân Cương, Túc Duyên, Trại Cau). Côn trùng thử nghiệm là sâu tơ (Plutella xylostella) tuổi 2, được cung cấp bởi Viện Bảo vệ thực vật quốc gia. Dữ liệu thứ cấp được tổng hợp từ các công trình nghiên cứu đã công bố, giáo trình và tài liệu khoa học liên quan.

Phương pháp phân tích được tiến hành theo một quy trình chuẩn hóa. Ban đầu, 152 chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất theo phương pháp của Ohba và Aizawa (1986) có điều chỉnh. Sau đó, các chủng được sàng lọc dựa trên khả năng hình thành tinh thể độc. 81 chủng B. thuringiensis được xác định và tiếp tục được phân loại bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch để tìm các chủng thuộc dưới loài kurstaki. Hoạt tính sinh học của 5 chủng tiềm năng nhất được thử nghiệm trên sâu tơ theo phương pháp của Park (1997), với cỡ mẫu 10 con sâu cho mỗi lần lặp lại thí nghiệm. Cuối cùng, chủng TC2.5 có hoạt tính cao nhất được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện lên men chìm trong bình tam giác 500ml chứa 100ml môi trường. Các yếu tố như pH (khảo sát từ 5.0 đến 9.0) và nhiệt độ (khảo sát từ 20°C đến 45°C) được đánh giá dựa trên mật độ tế bào (CFU/ml).

Timeline nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ đầu năm 2018 đến giữa năm 2019, bao gồm các giai đoạn: thu mẫu, phân lập, sàng lọc, thử hoạt tính, tối ưu hóa điều kiện và sản xuất thử nghiệm chế phẩm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được những kết quả đột phá, khẳng định tiềm năng của nguồn vi sinh vật bản địa tại Thái Nguyên.

1. Sự đa dạng và mật độ B. thuringiensis cao tại Thái Nguyên: Từ 30 mẫu đất, nghiên cứu đã phân lập được 152 chủng thuộc chi Bacillus, trong đó xác định được 81 chủng là B. thuringiensis (chiếm 53,3%). Tần suất xuất hiện của Bt trong các mẫu đất là 0,76 và chỉ số Bt là 0,53. Các chỉ số này đều cao hơn đáng kể so với các báo cáo trước đây tại Việt Nam (tần suất 0,63 và chỉ số 0,3), cho thấy Thái Nguyên là một "điểm nóng" về đa dạng sinh học của loài vi khuẩn này.

2. Ưu thế của các chủng sinh tinh thể diệt sâu cánh vảy: Phân tích hình thái tinh thể của 81 chủng Bt cho thấy, các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp, vốn có hoạt tính cao với côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera) như sâu tơ, chiếm tỷ lệ vượt trội với 51,58%. Theo sau là các chủng sinh tinh thể hình cầu (21%) và hình lập phương (18,51%). Kết quả này gợi ý về tiềm năng ứng dụng lớn trong việc kiểm soát các loài sâu hại cây trồng thuộc bộ cánh vảy.

3. Phát hiện chủng TC2.5 với hoạt tính diệt sâu tơ 100%: Trong số các chủng được thử nghiệm hoạt tính, chủng TC2.5 thể hiện sự vượt trội tuyệt đối. Ở nồng độ thấp chỉ 10⁵ bào tử/ml, chủng TC2.5 đã tiêu diệt 100% số sâu tơ thử nghiệm chỉ sau 3 ngày. Trong khi đó, các chủng tiềm năng khác chỉ đạt hiệu quả trên 80% khi sử dụng nồng độ cao hơn gấp 100 lần (10⁷ bào tử/ml). Đây là một phát hiện quan trọng, chứng tỏ TC2.5 là một ứng viên xuất sắc để phát triển thành chế phẩm thương mại.

4. Xác định điều kiện lên men tối ưu cho sản xuất sinh khối: Nghiên cứu đã xác định được các thông số tối ưu để nuôi cấy chủng TC2.5. Chủng vi khuẩn này sinh trưởng mạnh nhất ở nhiệt độ 30°C, đạt mật độ 5,49 x 10⁸ CFU/ml. Về độ pH, môi trường có pH ban đầu là 7,5 cho kết quả tốt nhất với mật độ tế bào đạt 4,5 x 10⁸ CFU/ml. Khoảng điều kiện tối ưu được xác định là 25-35°C và pH từ 6,5-7,5, là những thông số dễ dàng kiểm soát trong sản xuất quy mô lớn.

Thảo luận kết quả

Các kết quả trên không chỉ có giá trị khoa học mà còn mang ý nghĩa thực tiễn sâu sắc. Tần suất xuất hiện Bt cao tại Thái Nguyên có thể được giải thích bởi sự đa dạng về địa hình (từ đồi núi đến trung du) và thảm thực vật phong phú, tạo ra nhiều ổ sinh thái cho vi sinh vật phát triển. Điều này củng cố giả thuyết rằng các vùng có đa dạng sinh học cao là nguồn tài nguyên quý giá để khám phá các tác nhân sinh học mới.

Phát hiện về chủng TC2.5 có thể được coi là đóng góp cốt lõi của luận văn. Hiệu quả diệt 100% sâu tơ ở nồng độ thấp cho thấy chủng này sản sinh ra độc tố có hoạt lực rất mạnh hoặc một tổ hợp độc tố синергический. So với các nghiên cứu thương mại khác, việc tìm ra một chủng bản địa hoạt động hiệu quả như vậy là một lợi thế lớn, vì nó đã thích nghi với điều kiện khí hậu và môi trường địa phương.

Kết quả tối ưu hóa điều kiện lên men cung cấp một cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc nhân rộng quy mô sản xuất. Dữ liệu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến mật độ tế bào có thể được trực quan hóa bằng biểu đồ đường, trong đó trục hoành biểu diễn giá trị pH hoặc nhiệt độ và trục tung biểu diễn mật độ tế bào (CFU/ml). Các biểu đồ này sẽ cho thấy rõ đỉnh sinh trưởng tại pH 7,5 và nhiệt độ 30°C, làm cơ sở để thiết lập quy trình vận hành chuẩn (SOP) cho các nồi lên men công nghiệp. Việc sản xuất thành công chế phẩm dạng bột từ chủng TC2.5 và duy trì được hoạt tính diệt sâu 100% đã chứng minh tính khả thi của toàn bộ quy trình từ phòng thí nghiệm đến sản phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên những kết quả tích cực đã đạt được, luận văn đề xuất 4 giải pháp cụ thể nhằm phát triển và ứng dụng tiềm năng của chủng B. thuringiensis TC2.5:

1. Tối ưu hóa quy trình lên men ở quy mô pilot. Viện Công nghệ Sinh học và các đơn vị liên quan cần tiến hành nuôi cấy chủng TC2.5 trong các nồi lên men từ 10 đến 50 lít trong vòng 6-12 tháng tới. Mục tiêu là xác định các thông số tối ưu về tốc độ khuấy, lưu lượng sục khí và thành phần môi trường công nghiệp (sử dụng mật rỉ, khô đậu tương) để nâng mật độ tế bào mục tiêu lên trên 10⁹ CFU/ml, tăng hiệu suất sản xuất ít nhất 50%.

2. Nghiên cứu và phát triển công thức chế phẩm hoàn chỉnh. Các trung tâm nghiên cứu nông nghiệp cần phối hợp để xây dựng công thức phối trộn bột sinh khối Bt-TC2.5 với các chất phụ gia. Cần tập trung vào chất bám dính (để chế phẩm lưu lại lâu hơn trên lá) và chất chống tia cực tím (để bảo vệ protein độc tố khỏi ánh nắng mặt trời), với mục tiêu kéo dài thời gian bán hủy của chế phẩm ngoài đồng ruộng từ 3 ngày lên 7-10 ngày. Quá trình này nên được hoàn thành trong vòng 1 năm.

3. Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đồng ruộng. Viện Bảo vệ thực vật nên hợp tác với các hợp tác xã nông nghiệp tại các vùng trồng rau lớn như Mộc Châu, Đà Lạt, hoặc ngoại thành Hà Nội để triển khai các mô hình thử nghiệm trong 2 vụ rau tới. Mục tiêu là đánh giá hiệu quả thực tế của chế phẩm Bt-TC2.5 trong việc kiểm soát quần thể sâu tơ và so sánh với các loại thuốc hóa học đối chứng, hướng tới giảm ít nhất 70% số lần phun thuốc hóa học.

4. Bảo hộ và khai thác tài sản trí tuệ. Cần tiến hành giải trình tự bộ gen của chủng TC2.5, đặc biệt là các gen mã hóa protein độc tố (cry genes), để xác định bản chất độc tố và đăng ký bản quyền cho chủng vi sinh vật này. Việc này không chỉ bảo vệ tài sản trí tuệ quốc gia mà còn tạo cơ sở pháp lý vững chắc cho việc chuyển giao công nghệ và thương mại hóa sản phẩm trong vòng 2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn này là một tài liệu tham khảo giá trị cho nhiều nhóm đối tượng khác nhau, mỗi nhóm có thể khai thác những lợi ích riêng:

1. Nhà khoa học, nghiên cứu sinh và sinh viên: Đây là nguồn tài liệu chi tiết về quy trình chuẩn từ A-Z trong việc nghiên cứu và phát triển một tác nhân kiểm soát sinh học. Luận văn cung cấp phương pháp luận chặt chẽ từ khâu phân lập, sàng lọc, định danh, thử hoạt tính sinh học đến tối ưu hóa sản xuất. Các số liệu cụ thể về tần suất, hiệu quả diệt sâu, và điều kiện lên men là dữ liệu tham khảo quý giá cho các nghiên cứu tương lai trong lĩnh vực công nghệ sinh học và bảo vệ thực vật.

2. Doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật: Luận văn giới thiệu một ứng viên sáng giá – chủng TC2.5 – để phát triển thành một dòng sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học mới. Các doanh nghiệp có thể dựa vào kết quả nghiên cứu này để đánh giá tiềm năng thương mại, tiết kiệm thời gian và chi phí cho giai đoạn R&D ban đầu. Đây là cơ hội để đa dạng hóa danh mục sản phẩm, đáp ứng nhuang cầu ngày càng tăng về nông nghiệp an toàn và hữu cơ.

3. Cơ quan quản lý nhà nước và cán bộ khuyến nông: Các nhà hoạch định chính sách nông nghiệp có thể sử dụng kết quả của luận văn làm bằng chứng khoa học để thúc đẩy các chương trình nông nghiệp bền vững. Cán bộ khuyến nông có thể dựa vào đây để xây dựng tài liệu tập huấn, giới thiệu cho nông dân một giải pháp thay thế hiệu quả và an toàn cho thuốc trừ sâu hóa học, góp phần thực hiện các mục tiêu về an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường.

4. Nông dân và chủ trang trại: Đối với những người trực tiếp sản xuất, luận văn mang đến hy vọng về một công cụ mới để giải quyết vấn đề sâu tơ, một trong những đối tượng dịch hại nan giải nhất. Hiểu về cơ chế hoạt động và hiệu quả của chế phẩm Bt-TC2.5 giúp họ có thêm lựa chọn tin cậy, giảm sự phụ thuộc vào hóa chất, bảo vệ sức khỏe bản thân, người tiêu dùng và hệ sinh thái đồng ruộng.

Câu hỏi thường gặp

1. Bacillus thuringiensis (Bt) là gì và tại sao nó có thể diệt được sâu hại? Bacillus thuringiensis là một loài vi khuẩn tự nhiên sống trong đất. Nó đặc biệt vì trong quá trình sinh sản, nó tạo ra một tinh thể protein độc (gọi là Cry protein). Khi sâu hại ăn phải lá cây có chứa protein này, môi trường kiềm trong ruột sâu sẽ hòa tan và hoạt hóa độc tố, gây thủng thành ruột, khiến sâu ngừng ăn và chết sau vài ngày.

2. Chế phẩm sinh học từ chủng TC2.5 có an toàn cho con người và vật nuôi không? Tuyệt đối an toàn. Độc tố của Bt có tính đặc hiệu rất cao, chỉ hoạt động trong môi trường ruột có độ pH kiềm của một số loài côn trùng nhất định. Hệ tiêu hóa của con người, vật nuôi và các loài thiên địch (như ong, bọ rùa) có môi trường axit, do đó độc tố này hoàn toàn vô hại, không gây ảnh hưởng sức khỏe và không để lại tồn dư độc hại trên nông sản.

3. Hiệu quả của chế phẩm Bt-TC2.5 so với thuốc trừ sâu hóa học như thế nào? Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chế phẩm Bt-TC2.5 cho thấy hiệu quả diệt sâu tơ đạt 100% sau 3 ngày, tương đương với hiệu quả của nhiều loại thuốc hóa học mạnh. Ưu điểm vượt trội của nó là không gây ra hiện tượng kháng thuốc nhanh như hóa chất và tiêu diệt sâu một cách chọn lọc, bảo vệ các loài côn trùng có ích trong hệ sinh thái nông nghiệp.

4. Tại sao nghiên cứu lại chọn tỉnh Thái Nguyên để tìm kiếm vi khuẩn Bt? Thái Nguyên được chọn vì có đặc điểm địa hình và khí hậu đa dạng, từ vùng núi cao đến vùng trung du, tạo nên sự phong phú về hệ vi sinh vật trong đất. Các nhà khoa học tin rằng sự đa dạng sinh học này sẽ là một nguồn tài nguyên quý giá để tìm ra các chủng vi khuẩn B. thuringiensis mới, có hoạt tính sinh học độc đáo và mạnh mẽ, như chủng TC2.5 đã được phát hiện.

5. Quy trình sản xuất chế phẩm Bt-TC2.5 có thể áp dụng ở quy mô lớn không? Có. Quy trình sản xuất trong luận văn sử dụng phương pháp lên men chìm, là công nghệ cốt lõi trong sản xuất vi sinh vật công nghiệp. Các bước từ nhân giống, lên men trong môi trường dinh dưỡng tối ưu (pH 7.5, nhiệt độ 30°C), đến thu hồi sinh khối và sấy khô thành bột đều là những công đoạn có thể dễ dàng nhân rộng trong các nhà máy sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học hiện đại.

Kết luận

Luận văn đã thực hiện thành công một nghiên cứu toàn diện và có hệ thống, mang lại những đóng góp quan trọng cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nông nghiệp bền vững tại Việt Nam.

• Đã phân lập và xây dựng được một bộ sưu tập gồm 81 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa từ các mẫu đất tại Thái Nguyên, chứng minh sự đa dạng di truyền phong phú của nguồn tài nguyên vi sinh vật quốc gia.
• Đã tuyển chọn thành công chủng TC2.5, một chủng vi khuẩn ưu việt với khả năng tiêu diệt 100% sâu tơ (Plutella xylostella) trong điều kiện thí nghiệm, ngay cả ở nồng độ thấp.
• Đã xác định các điều kiện lên men tối ưu về pH (6,5 – 7,5) và nhiệt độ (25 – 35°C), tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc sản xuất sinh khối chủng TC2.5 ở quy mô lớn.
• Đã sản xuất thử nghiệm thành công chế phẩm Bt-TC2.5 dạng bột, giữ nguyên được hoạt tính sinh học cao, khẳng định tính khả thi của việc phát triển sản phẩm từ phòng thí nghiệm ra thực tiễn.
• Đã mở ra một hướng đi mới và đầy tiềm năng trong việc tự chủ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học chất lượng cao từ chính nguồn gen bản địa, góp phần giảm phụ thuộc vào sản phẩm nhập khẩu và xây dựng một nền nông nghiệp xanh.

Trong thời gian tới, các bước tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình ở quy mô pilot và tiến hành các thử nghiệm đồng ruộng trong vòng 1-2 năm. Chúng tôi kêu gọi sự hợp tác từ các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp để cùng chung tay đưa sản phẩm tiềm năng này ra thị trường, phục vụ nền nông nghiệp Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu khá thuận lợi và tốt đẹp [ 3]. Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn. Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh download by : [e-mail] 6 học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm. Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp.

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]. Đại cương về vi khuẩn Bt 1.

Sự phân bố của Bt Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng. Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh download by : [e-mail] 7 thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13].

Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Đặc điểm hình thái Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào.

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn.Bt có khả năng sinh nội bào tử để chống lại những điều kiện bất lợi. Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn: * Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thể tạo thành chuỗi. Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang. * Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thể dinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thành tinh thể.

* Bào tử và tinh thể: Nang bào tử phát triển, vỡ ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hóa chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng ngoài là phần sót lại cuả tế bào mẹ, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi 3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng.

Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation. Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa nước là 70 %. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân.

download by : skknchat@gmail. Chủng Bt mang bào tử Hình 1. Hình dạng tế vào và tinh và tinh thể [24]. thể một số dưới loài Bt) [24].

a Lông roi (A) Tế bào vi khẩn Bt b Tế bào chứa bào tử và tinh thể (B) Hình dạng protein tinh thể của c. Protein tinh thể độc B. kustaki (C) Hình dạng protein tinh thể của B.isragensis Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13].thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus Các loài thuộc chi B. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B.

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại bào tử tinh thể. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme download by : [e-mail] 9 Nhuộm Gram + (a) + + + + Phản ứng catalase + + + + + Khả năng chuyển động +/- (b) +/- - (c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/- + + - (d) Phân hủy tyrosine + + +/- - (d) +/- Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với lòng đỏ + + + + - trứng Lên men glucose kị khí + + + + - Phản ứng V-P + + + + - Sinh Axít từ mannitol - - - - + Làm tan huyết + + + - (d) - Sinh protein tinh thể - + - - - Chú thích: + (a): 90-100% số chủng phản ứng dương tính +/- (b): 50-50% số chủng phản ứng dương tính - (c): 90-100% số chủng phản ứng âm tính - (d): hầu hết các chủng phản ứng âm tính 1. Đặc điểm sinh hóa Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo axit trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat.

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 – 45ºC. Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là pH = 7. Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3].

download by : skknchat@gmail. Phân loại Bt Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:  Khả năng hình thành enzyme leucitinase  Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng  Đặc tính huyết thanh học  Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2], [3]. Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường.

Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13]. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn.

Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng. download by : [e-mail] 11 Tế bào vi khuẩn với Phân tử kháng thể kháng nguyên bề mặt với 2 vị trí liên kết đặc hiệu. Phản ứng ngưng kết. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 1.

Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki Bacillus thuringiensis var. kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm 1901, Tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm 1951. Trong các thập kỷ gần đây, Bt var.

kurstaki đã trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada. Đến năm 1986, việc sử dụng Bt var. kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam. Ở các nước khác, Bt var.

kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao. Bacillus thuringiensis var. kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất.

Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì Bacillus thuringiensis var. kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B. azawai ngưng kết với typ H7 chiếm 15%, B. morrisoni ngưng download by : [e-mail] 12 kết với typ H8a,8b chiếm 13,8%,…Bacillus thuringiensis var.