Khảo sát ảnh hưởng của Ethyl Cellulose và Trehalose đến chất lượng bột đông khô Bacillus clausii

Khóa luận Dược sĩ nghiên cứu ảnh hưởng của Ethyl Cellulose và Trehalose đến chất lượng, khả năng sống sót của bột đông khô probiotic Bacillus clausii.

• Tác giả: Phạm Thị Minh Nguyệt
• Người hướng dẫn: PGS. Đàm Thanh Xuân
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của Ethyl cellulose và Trehalose đến một số chỉ tiêu chất lượng của bột đông khô Bacillus clausii
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Bacillus clausii Vi khuẩn probiotics trong bột đông khô

Bacillus clausii là một chủng vi khuẩn probiotics quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học dược phẩm. Chủng vi khuẩn này có khả năng hình thành bào tử vô cùng đặc biệt, giúp nó tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bacillus clausii được biết đến với vai trò bảo vệ sức khỏe đường ruột, cải thiện hệ miễn dịch và đối kháng các vi khuẩn gây bệnh như Helicobacter pylori. Quá trình đông khô là phương pháp bảo quản chính giúp duy trì khả năng sống sót và hoạt tính sinh học của Bacillus clausii trong thời gian dài. Kỹ thuật này cho phép giữ nguyên các đặc tính quý báu của vi khuẩn trong một hình thức bột ổn định, thuận tiện cho sản xuất các sản phẩm probiotics chất lượng cao.

1.1. Đặc điểm sinh lý và hình thái của Bacillus clausii

Bacillus clausii là vi khuẩn gram dương, có khả năng di động với hình dạng que. Chủng này phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37°C trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Tính năng nổi bật nhất của Bacillus clausii là khả năng tạo thành bào tử giúp nó sống sót qua các quá trình xử lý khắc nghiệt như đông khô, nóng và môi trường axit.

1.2. Tác dụng và ứng dụng của Bacillus clausii

Bacillus clausii có nhiều tác dụng quan trọng: cải thiện sức khỏe đường ruột, tăng cường hệ miễn dịch, cấp cứu dysbacteriosis sau khi sử dụng kháng sinh. Vi khuẩn probiotics này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất men vi sinh, bột đông khô và các sản phẩm chức năng khác nhằm bảo vệ và cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa.

II. Ethyl cellulose EC Chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông khô

Ethyl cellulose (EC) là một chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant) đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông khô Bacillus clausii. Chất này có khả năng tạo thành một lớp bảo vệ xung quanh tế bào vi khuẩn, ngăn chặn việc hình thành các tinh thể nước gây tổn hại đến cấu trúc tế bào. EC cải thiện đáng kể khả năng sống sót của Bacillus clausii trong quá trình đông khô và bảo quản. Ngoài ra, Ethyl cellulose còn ảnh hưởng tích cực đến thể chất của bột đông khô, giúp sản phẩm có độ hàm ẩm thích hợp, ổn định hơn. Việc lựa chọn nồng độ EC phù hợp là yếu tố quan trọng để đạt được bột đông khô có chất lượng cao với độ bền lâu dài.

2.1. Cơ chế bảo vệ của Ethyl cellulose

EC hoạt động bằng cách hình thành một lớp bảo vệ quanh tế bào Bacillus clausii, giảm thiểu sự mất nước và hạn chế hình thành tinh thể nước có hại. Chất này ổn định bão hòa pha lỏng bên trong tế bào, duy trì tính toàn vẹn của cấu trúc tế bào và hoạt tính sinh học của vi khuẩn.

2.2. Ảnh hưởng của EC đến chất lượng bột đông khô

Ethyl cellulose cải thiện thể chất bột đông khô, tăng sự ổn định và giảm hàm ẩm dư thừa. Ngoài ra, EC còn tăng cường hoạt độ nước (aw) thích hợp, đảm bảo sản phẩm duy trì được khả năng sống sót cao của Bacillus clausii trong quá trình bảo quản dài hạn.

III. Trehalose Chất bảo vệ lạnh thiên nhiên cho probiotics

Trehalose là một đường hai vòng tự nhiên, đóng vai trò quan trọng là chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông khô Bacillus clausii. Chất này được các vi sinh vật sử dụng như một cơ chế bảo vệ tự nhiên chống lại stress nhiệt và cơ học. Trehalose có khả năng thay thế nước bên trong tế bào, tạo thành một trạng thái amorphous giúp bảo vệ protein và màng tế bào khỏi tổn hại do đông lạnh. Khi kết hợp với Ethyl cellulose, Trehalose tạo ra hiệu ứng tích hợp mạnh mẽ, tăng đáng kể khả năng sống sót của Bacillus clausii trong bột đông khô. Nghiên cứu cho thấy Trehalose là một trong những chất bảo vệ lạnh hiệu quả nhất cho các probiotics trong công nghệ sinh học dược.

3.1. Cơ chế hoạt động của Trehalose

Trehalose bảo vệ tế bào bằng cách thay thế nước bên trong, tạo ra một lớp bảo vệ giữ nguyên cấu trúc protein và màng tế bào. Chất này hình thành trạng thái kính (glass state), giảm thiểu hoạt độ hóa học và duy trì hoạt tính sinh học của Bacillus clausii trong quá trình đông khô và lưu trữ.

3.2. Phối hợp Trehalose và Ethyl cellulose

Kết hợp Trehalose với EC tạo ra hiệu ứng tích hợp mạnh mẽ, tăng cường khả năng bảo vệ cho Bacillus clausii. Trehalose bảo vệ từ bên trong tế bào, trong khi EC bảo vệ từ bên ngoài. Phối hợp này giúp bột đông khô đạt khả năng sống sót cao nhất và độ ổn định tối ưu.

IV. Chỉ tiêu chất lượng bột đông khô Bacillus clausii

Các chỉ tiêu chất lượng của bột đông khô Bacillus clausii bao gồm khả năng sống sót vi khuẩn, hàm ẩm, hoạt độ nước (aw) và thể chất sản phẩm. Khả năng sống sót được đánh giá thông qua số lượng CFU (Colony Forming Unit) còn lại sau quá trình đông khô. Hàm ẩm phải nằm trong khoảng tối ưu (thường dưới 5%) để đảm bảo ổn định bào tử và bảo quản dài hạn. Hoạt độ nước (aw) cần kiểm soát chặt chẽ vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phát triển của các vi sinh vật không mong muốn. Thể chất sản phẩm phải đảm bảo không cấp, dễ tan, và có màu sắc đều. Những chỉ tiêu này được xác định bằng các phương pháp phân tích tiêu chuẩn trong công nghệ dược.

4.1. Đánh giá khả năng sống sót CFU và hàm ẩm

Khả năng sống sót được tính bằng phương pháp pha loãng liên tục để đếm CFU. Hàm ẩm được xác định bằng phương pháp cân nóng hoặc phương pháp Karl Fischer. Bacillus clausii được coi là hiệu quả khi duy trì CFU ≥ 10⁹ sau đông khô và hàm ẩm < 5%.

4.2. Hoạt độ nước aw và cấu trúc bột đông khô

Hoạt độ nước (aw) phải kiểm soát < 0,6 để ngăn chặn phát triển vi sinh vật không mong muốn. Cấu trúc bột đông khô được quan sát bằng kính hiển vi điện tử để đảm bảo không có kết cột nước lớn, giúp duy trì thể chất và ổn định hóa lý của sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về probiotic 1. Khái niệm Thuật ngữ “probiotics” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó “probios” có nghĩa là vì sự sống được nhà khoa học người Đức Werner Kollath giới thiệu vào năm 1953 để chỉ “các hoạt chất cần thiết cho sự phát triển lành mạnh của sự sống”. Năm 1965, thuật ngữ này được Lilly và Stillwell sử dụng trong một bối cảnh khác để biểu thị “các chất do một sinh vật tiết ra có tác dụng kích thích sự phát triển của một sinh vật khác”. Cụ thể hơn, năm 1992, Fuller định nghĩa probiotic là “một chất bổ sung thức ăn có chứa vi khuẩn sống có tác dụng có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của vật chủ” [9].

Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau: “Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [57]. Trong tuyên bố đồng thuận được công bố năm 2014, Hiệp hội Khoa học Quốc tế về Probiotics và Prebiotics chỉ ra probiotics phát huy tác dụng có lợi của chúng thông qua một số cơ chế hoạt động và được sử dụng rộng rãi trong việc ngăn ngừa hoặc điều trị nhiều bệnh. Probiotics thuộc nhóm Lactobacillus spp. và Streptococcus spp.

được tiêu thụ trên toàn thế giới vì lợi ích sức khỏe của chúng [5]. Đối với chế phẩm probiotic, có nhiều lợi ích sức khỏe đã được chứng minh khi tiêu thụ men vi sinh, tuy nhiên, điều quan trọng là những lợi ích đó chỉ xuất hiện nếu vi sinh vật tồn tại trong quá trình sản xuất, bảo quản, phải sống sót qua quá trình vận chuyển qua đường tiêu hóa, điều kiện acid của môi trường dạ dày và có thể đến được ruột già với số lượng thích hợp để cho phép vi khuẩn xâm nhập và phát triển [11]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng 108-109 CFU/g là liều lượng probiotic lý tưởng để đạt được lợi ích sức khỏe và do đó, tất cả các công thức phải chứa ít nhất số lượng vi khuẩn sống nói trên để có hiệu quả điều trị. Đặc điểm quan trọng nhất của các công thức probiotic là vi khuẩn dễ bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố môi trường và điều kiện sản xuất như nhiệt độ, độ ẩm, áp suất và điều kiện bảo quản làm giảm khả năng sống của vi khuẩn [4].

Vai trò của probiotic Lợi ích sức khỏe liên quan đến men vi sinh đã được nghiên cứu rộng rãi trong thế kỷ qua. Vào đầu những năm 1900, Louis Pasteur đã xác định được các vi sinh vật là tác nhân của các quá trình lên men, trong khi Elie Metchnikoff đã quan sát thấy tuổi thọ cao hơn của người dân Bulgaria tiêu thụ thường xuyên các sản phẩm từ sữa lên men. Sau 2 đó, ông đã đưa ra lý thuyết rằng việc tiêu thụ vi khuẩn acid lactic sẽ giảm thiểu tình trạng rối loạn tiêu hóa và kéo dài tuổi thọ [9]. Có một số cơ chế hoạt động có thể có mà vi khuẩn trong men vi sinh mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ.

Những cơ chế này bao gồm ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản xuất các hợp chất kháng khuẩn, cạnh tranh các vị trí bám dính và chất dinh dưỡng cũng như thay đổi quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bằng cách kiểm soát hoạt động của enzym trong ruột. Men vi sinh kích thích khả năng miễn dịch bằng cách tăng sản xuất tế bào T và điều chỉnh cytokine, yếu tố hoại tử khối u α, interleukin và interferon. Chúng ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì và các yếu tố tăng trưởng giống insulin trong tế bào khối u. Cuối cùng, mức kháng thể và đại thực bào đường ruột tăng làm tăng khả năng thực bào của bạch cầu trong máu [13].

Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng probiotic có nhiều tác động tích cực đối với sức khỏe con người bởi vậy probiotic có trong rất nhiều loại thực phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Probiotic đã được đánh giá lâm sàng và bằng chứng được xem xét cho một loạt các tình trạng ở người lớn và trẻ em, từ các rối loạn đường tiêu hóa đến dị ứng, bệnh truyền nhiễm, bệnh hô hấp, bệnh thần kinh, các tình trạng chuyển hóa và tự miễn dịch [58]. Probiotic góp phần trực tiếp hoặc gián tiếp vào một số lợi ích cho sức khỏe, bao gồm bảo vệ chống lại các vi sinh vật gây bệnh, tăng huyết áp, viêm nhiễm, tiểu đường, stress oxy hóa và cũng tham gia vào quá trình điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột, điều hòa miễn dịch, góp phần giảm cholesterol [11] và đóng vai trò tiềm năng to lớn trong điều trị và tiên lượng ung thư [15]. Ứng dụng của probiotic:  Hỗ trợ điều trị các bệnh tiêu hóa: Probiotic bao gồm các vi sinh vật sống, chúng bổ sung cho hệ vi sinh vật tự nhiên có trong ruột người và các thử nghiệm lâm sàng cho thấy Probiotic giúp giảm nhẹ các rối loạn đường ruột nhẹ như tiêu chảy hoặc táo bón thường xuyên, đầy hơi và đau bụng.

Cơ chế chính xác mà men vi sinh phát huy tác dụng có lợi đối với sức khỏe vẫn chưa được hiểu đầy đủ nhưng bằng chứng hiện tại cho thấy các cơ chế hoạt động của men vi sinh bao gồm quá trình xâm chiếm và phục hồi cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột; loại trừ cạnh tranh các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn, chẳng hạn như bacteriocin, và cạnh tranh về chất dinh dưỡng và bám dính vào biểu mô ruột; tăng cường sản xuất mucin và chức năng hàng rào niêm mạc; tiết ra các axit béo chuỗi ngắn; tác dụng điều hòa miễn dịch trên tế bào lympho và cytokine [2].  Ngăn ngừa tiêu chảy du lịch: 3 Phần lớn các trường hợp tiêu chảy của khách du lịch là do vi khuẩn gây ra, trong khi các trường hợp còn lại là do virus và động vật nguyên sinh. coli là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra tiêu chảy của khách du lịch do vi khuẩn. Một đánh giá của Cochrane bao gồm 23 nghiên cứu cho thấy rằng probiotic có hiệu quả trong việc giảm nguy cơ tiêu chảy và thời gian tiêu chảy [16].

 Phòng ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu: Việc sử dụng men vi sinh, đặc biệt là Lactobacillus, đã được cân nhắc để phòng ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu. Vì Lactobacillus chiếm ưu thế trong hệ vi khuẩn niệu sinh dục của phụ nữ khỏe mạnh, nên người ta cho rằng việc phục hồi hệ vi khuẩn niệu sinh dục có thể ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Lactobacillus rhamnosus GR-1 và L. reuteri RC-14 (trước đây gọi là L.

fermentum RC- 14) có vẻ là loại Lactobacillus hiệu quả nhất được nghiên cứu trong việc phục hồi hệ vi sinh vật có lợi đường tiết niệu [59]. Khái quát về Bacillus clausii. Đặc điểm sinh lý, hình thái Bacillus clausii là một loại vi khuẩn probiotic Gram dương, hình thành bào tử, di động, hình que, không độc và an toàn Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey 1994 (Bergey’s manual of determinative bacteriology), Bacillus clausii thuộc: Bộ: Eubacteriales - Họ: Bacillaceae - Chi: Bacillus - Loài: Bacillus clausii Phân bố: Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất (Bacillus clausii ATCC 31084, Bacillus clausii DSM 8716…) Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ). Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy Bacillus clausii đã được phân lập từ phân người trưởng thành khỏe mạnh, cho thấy khả năng sống sót của chúng khi đi qua đường tiêu hóa [5].

Hình thái: Bacillus clausii có dạng hình que đứng đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử có dạng bầu dục. Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2 µm, dài 5 µm. Đặc tính sinh lý: Các chủng B. clausii đã được sử dụng trong một loạt các nghiên cứu làm nổi bật các đặc tính sinh lý hữu ích của chúng, chẳng hạn như khả năng chịu nhiệt, chịu axit và chịu muối mật và xâm chiếm ruột ngay cả khi có kháng sinh [18] tăng cường 4 chức năng hàng rào ruột; khả năng kháng kháng sinh phổ rộng nhưng không chuyển gen sang các loài khác và tổng hợp vitamin [5].

Đặc điểm sinh hóa: Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân casein, gelatin, tinh bột và khử nitrat, nhưng không thủy phân được Tween 20 và Tween 80 [12]. Điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí, có khả năng tạo bào tử. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất là từ 15-50C. Mỗi chủng Bacillus sẽ có nhiệt độ thích hợp khác nhau, ví dụ: Chủng Bacillus clausii DSM 8716 có nhiệt độ thích hợp là 30C, chủng Bacillus clausii KSM-K16 có nhiệt độ thích hợp là 40C… Khoảng pH nuôi cấy thích hợp từ 7-10.

Chủng Bacillus clausii KSM-K16 có pH thích hợp là 9. Khả năng hình thành bào tử của Bacillus clausii Khi điều kiện môi trường khắc nghiệt, Bacillus clausii hình thành bào tử trải qua một quá trình phát triển phức tạp trong đó tế bào vi khuẩn phân hóa thành bào tử có thể tồn tại vô thời hạn khi không có nước, chất dinh dưỡng, nhiệt độ khắc nghiệt, độ pH, bức xạ cực tím và hóa chất độc hại [5]. Quá trình hình thành bào tử bao gồm sự tiến triển qua các giai đoạn khác nhau là: hình thành bào tử, phân ly nhiễm sắc thể, phân chia tế bào đặc hiệu bào tử, biểu hiện gen khác biệt và các cơ chế truyền tín hiệu cụ thể. Vào cuối quá trình, một bào tử trưởng thành, có sức đề kháng cao được hình thành.

Các bào tử ngủ đông có thể tồn tại vô thời hạn trong điều kiện không có nước và chất dinh dưỡng, sống sót qua nhiệt độ và độ pH khắc nghiệt và tiếp xúc với tia UV và các hóa chất độc hại. Khi các điều kiện môi trường trở lại thuận lợi cho sự phát triển của tế bào, bào tử nảy mầm tạo ra một tế bào sinh dưỡng mới có khả năng phát triển, nhân đôi và cuối cùng là hình thành bào tử một lần nữa [61]. Các thành phần cấu trúc chính của bào tử Bacillus clausii bao gồm màng ngoài là lớp vỏ dày giàu protein có chức năng khử độc các hóa chất phản ứng, lớp vỏ giữa (cortex) được cấu tạo từ vật liệu thành tế bào cứng chức, giúp tăng độ bền cơ học và khả năng chống chịu tổn thương vật lý.