CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về collagen và gelatin Gelatin là protein hòa tan, được thu nhận bằng cách thủy phân một phần collagen có nguồn gốc từ da, mô sụn, xương động vật,… Gelatin có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, sinh học, dược phẩm, y học, phim ảnh,. bởi các tính chất chức năng độc đáo của nó. Để sản xuất gelatin, nguyên liệu giàu collagen được ngâm trong dung dịch acid hoặc kiềm loãng, dẫn đến sự phân cắt một phần các liên kết ngang của collagen.
Sau đó hỗn hợp được gia nhiệt, làm cho phân tử collagen được phân nhỏ đến mức tan được trong nước ấm, khi đó gelatin đã được hình thành [98]. Để thu được sản phẩm gelatin tốt, đảm bảo chất lượng, yêu cầu nguồn collagen phải tốt, phù hợp với yêu cầu sản phẩm gelatin. Chất lượng collagen phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn nguyên liệu (bò, heo, cá,.), độ tuổi của nguyên liệu, điều kiện sống của vật nuôi,… 1. Tổng quan về collagen “Collagen” trong tiếng Hy Lạp được tạo nên từ 2 thành phần, một là “kolla” có nghĩa là “keo” và hai là “gennao” có nghĩa là “sản xuất”, nên “collagen” có nghĩa là “sản xuất keo” [44].
Collagen có chức năng như một chất keo gắn các bộ phận trong cơ thể thành một khối hoàn chỉnh. Nếu không có collagen, cơ thể người và động vật chỉ là các phần rời rạc không liên kết được với nhau. Đối với da của người và động vật, collagen còn có nhiệm vụ tạo sự đàn hồi. Đây chính là lý do tại sao collagen ở da có hình dạng khác so với collagen ở bộ phận khác.
Collagen là một trong những protein dạng sợi phong phú nhất và đáp ứng được các tính chất chức năng cơ học, đặc biệt là ở động vật có vú, chiếm khoảng 25÷35% protein của toàn bộ cơ thể. Nó được tìm thấy chủ yếu ở các mô như: da, gân và dây chằng. Chúng có hầu hết trong xương, ngà, răng, mạch máu, sụn và trong các cấu trúc ngoại bào. Ngoài ra collagen cũng có mặt trong các loài động vật không xương sống như các loại nhuyễn thể [44][102].
Cấu trúc của collagen Collagen có cấu tạo tương đối phức tạp, cấu trúc đơn giản nhất là collagen phân tử hay tropocollagen. Chúng có dạng hình sợi, được tạo thành từ 3 chuỗi polypeptid (chuỗi α) liên kết với nhau, gọi là collagen xoắn ba và tạo thành cấu trúc không gian 3D như hình 1. 8,6 nm 0,87 nm 1,5 nm Hình 1. Cấu trúc xoắn ba của collagen [41] Cấu trúc xoắn ba ổn định nhờ các liên kết hydro trong mỗi chuỗi và giữa các chuỗi với nhau.
Các chuỗi xoắn ba có chiều dài khoảng 300 nm và khối lượng phân tử khoảng 105 kDa. Cấu trúc đặc biệt này là do sự lặp lại gần như liên tục của trình tự các acid amin Gly-X-Y với khoảng 334 đơn vị, trong đó proline thường xuất hiện ở vị trí Y và hydroxyproline hầu như luôn xuất hiện ở vị trí X. Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử collagen [44] 6 Glycine (Gly) chiếm khoảng 33% các thành phần acid amin, proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm lần lượt khoảng 22% và 25%, các acid amin còn lại được phân phối ngẫu nhiên ở vị trí X và Y [52]. Các acid amin, 1nm Chuỗi xoắn ba tropocollagen, 300nm Các sợi collagen, 1µm Bó sợi collagen, 10µm Hình 1.
Cấu tạo phân tử collagen [44] Trong tất cả các acid amin, hydroxyproline đóng vai trò rất quan trọng cho sự ổn định của collagen, là một acid amin đặc trưng của collagen và không được tìm thấy trong bất kì một protein nào khác. Trong hydroxyproline có gắn nhóm -OH nằm ở vị trí cacbon gamma. Polypeptide của collagen nếu thiếu hydroxyproline sẽ tạo nên cấu trúc gấp khúc ở nhiệt độ thấp và sẽ không bền vững ở nhiệt độ thân nhiệt [44]. Phân loại collagen Cho đến nay khoảng 28 loại collagen khác nhau được xác định.
Một số loại collagen phổ biến được thống kê ở Bảng 1. Hơn 90% collagen trong cơ thể thuộc loại I, collagen loại I được sử dụng để sản xuất gelatin, bao gồm khoảng 1014 acid amin liên kết dưới dạng chuỗi với khối lượng phân tử xấp xỉ 100. Một số loại collagen phổ biến [98] Loại Cấu tạo STT Đặc trưng cấu trúc Nguồn collagen collagen phân tử 1 I [α1]2 α2 Sợi dài 300 nm Da, gân, xương, dây chằng,. 2 II [α1]3 Sợi dài 300 nm Sụn, thủy tinh thể 3 III [α1]3 Sợi dài 300 nm Da, cơ, mạch máu, phổi 4 V [α1]2 α2 và Sợi kết hợp với loại I Tương tự như loại I, α1 α2 α3 với hai đầu chuỗi cũng có ở tế bào đang hình cầu.
phát triển, thai nhi. 5 XI α1 α2 α3 Sợi kết hợp với loại II Tương tự như loại II 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc của collagen a. Ảnh hưởng bởi nước Nước giữ vai trò trực tiếp trong các biến đổi hóa học của collagen thông qua sự thủy phân, sự ổn định các liên kết hydro và khả năng tạo thành gelatin.
Phân tử nước có tính lưỡng cực nên tác động đến các thành phần mang điện tích âm và điện tích dương trong phân tử collagen, làm giảm sự thu hút tĩnh điện giữa các ion bằng cách hình thành vỏ ngậm nước xung quanh. Collagen giữ nước ở hai hình thức: nước cấu trúc và nước tự do. Nước cấu trúc là nước hydrat hóa các nhóm chức chức năng của collagen trong các dạng đơn lớp hoặc đa lớp. Mỗi nhóm phân cực trong collagen liên kết với H+ hoặc OH- của phân tử nước.
Phần nước tự do ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc không gian của collagen, làm thay đổi lực tĩnh điện của các nhóm ion và liên kết hydro do H+, OH- [28][52]. Ảnh hưởng bởi acid và kiềm Collagen cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ H+ và OH- trong môi trường nước vì collagen có bản chất là protein. Trong phân tử collagen có chứa các nhóm mang điện, ở pH đẳng điện các liên kết nội phân tử chặt chẽ nhất. Sự gia tăng nồng độ H+ 8 hoặc OH- làm phá vỡ các liên kết nội tại của chuỗi collagen để chúng liên kết với ion, làm tăng điện tích dương hoặc âm tùy thuộc vào môi trường.
Tuy nhiên, collagen không liên kết một cách tự do với các điện tích trong môi trường mà nó chỉ liên kết với một lượng nhỏ H+ hoặc OH-. Bằng cách tăng nồng độ H+ hoặc OH- dẫn đến sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu tạo nên một lớp màng điện thế. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho nước di chuyển vào trong chuỗi collagen tạo liên kết tĩnh điện với các nhóm mang điện và tạo liên kết hydro với các nhóm không mang điện [28][48]. Ảnh hưởng bởi enzyme Quá trình khử trùng hợp các đại phân tử tropocollagen có thể xảy ra nhờ các enzyme bẻ gãy các liên kết ở khu vực không tạo xoắn.
Cụ thể: pepsin hoặc trypsin tấn công vào khu vực giàu tyrosine và các acid amin có tính acid và không có hydroxyproline. Các enzyme xúc tác thủy phân peptid như pepsin và chymotrypsin không có khả năng phá vỡ cấu trúc xoắn ốc của collagen. Tuy nhiên, chymotrypsin và enzyme lysozyme có thể chuyển đổi chuỗi β và γ thành chuỗi α bằng cách thủy phân các liên kết peptid giữa glycine – isoleucine hoặc giữa serine và valine của chuỗi α1 ở đầu -NH2 [44]. Ngoài ra, enzyme collagenase thủy phân phân tử collagen có nguồn gốc tự nhiên ở điểm khoảng 3/4 chiều dài từ đầu -NH2.
Tuy nhiên, có quan điểm cho rằng vị trí phân cắt chính xác trên các chuỗi xoắn ba collagen bởi enzyme collagenase ở các sản phẩm collagen biến tính là không rõ ràng [52]. Các liên kết ngang trong collagen Các liên kết ngang chính trong tropocollagen và giữa các tropocollagen với nhau thường được tạo thành do sự khử amin hóa của lysine với lysine để tạo thành lysine aldehyde được thể hiện minh họa ở Hình 1.4 như sau: 9 Hình 1. Tương tác tạo liên kết ngang của collagen [44] Ngoài ra phần hai đầu của chuỗi có thể tạo liên kết với các acid amin của chuỗi xoắn như hydroxylysine (Hyl), glycine (Gly), histidine (His), arginine (Arg) được minh họa như sau: Hình 1. Phản ứng giữa phức có liên kết aldimine với histidine hình thành liên kết ngang histidino-hydroxylysinonorleucine [44] 10 Hình 1.
Phản ứng giữa phức có liên kết keto- amine với hydroxylysine aldehyde, lysine aldehyde hình thành liên kết ngang [44] 1. Quá trình chuyển từ collagen thành gelatin Khi gia nhiệt collagen trong môi trường nước đến 500C, cấu trúc các sợi collagen co lại, collagen bị mất một phần nước và biến tính làm lộ ra một số các tương tác kỵ nước và bị keo tụ. Sự hấp thụ nước càng giảm khi nhiệt độ càng tăng. Khi tăng nhiệt độ đến 600C, lực liên kết để duy trì cấu trúc có trật tự của collagen bị suy yếu nhất, cấu trúc xoắn ba của collagen được thủy phân ở những vị trí có liên kết cộng hóa trị, các liên kết giữa các phân tử đã bị đứt.
Lúc này collagen bị biến tính hoàn toàn, các nhóm bên của các acid amin ẩn ở bên trong trước đây được lộ ra bên ngoài. Khi bị biến tính bởi nhiệt trong môi trường nước, chuỗi xoắn ba của collagen bị tháo xoắn và giải phóng ra các polypeptid đơn tức gelatin được hình thành [44]. Theo lý thuyết của Hofmeister, quá trình chuyển collagen thành gelatin được minh họa bằng phương trình [11]: 11 C102H149O38N31 + H2O C102H151O39N31 Collagen Gelatin Bên cạnh đó, khi phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao và thời gian quá dài, ngoài quá trình chuyển collagen thành gelatin thì gelatin tạo thành cũng bị tác động bởi nhiệt độ dẫn đến sự tạo thành các sản phẩm không mong muốn như gelatose và gelatone [11]: C102H151O39N31 + 2H2O C55H85O22N17 + C47H70O19 + 7N2 Gelatin Gelatose Gelatone 1. Tổng quan về gelatin Cách đây 8000 năm gelatin đã được sử dụng ở các hang động của dân cư vùng Trung Đông như là một chất keo sinh học được sản xuất từ mô của động vật.
Sau đó 3000 năm, người Ai Cập cổ đại đã nhận biết được chức năng của gelatin và sử dụng chúng như một loại keo dán gỗ. Ngày nay, gelatin đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp với những ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau [98]. Phân loại gelatin a. Phân loại dựa theo phương pháp xử lý nguyên liệu Trong sản xuất gelatin, nguyên tắc xử lý nguyên liệu là phân cắt một phần các liên kết ngang trong cấu trúc của collagen để có thể tan trong nước nóng và loại bỏ các hợp chất phi collagen có trong nguyên liệu.
Các phương pháp xử lý thông thường sử dụng acid loãng hoặc kiềm loãng. Khi nguyên liệu được xử lý bằng dung dịch acid, gelatin thu được là gelatin loại A.