MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm đông trùng hạ thảo là tên chung chỉ một nhóm các loài nấm ký sinh trên sâu non, sâu trƣởng thành hoặc nhộng của một số loại côn trùng. Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào quá trình phát sinh, phát triển và vòng đời của chúng. Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh.
Các loài nấm này sử dụng các chất hữu cơ trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả. Nhƣ vậy, mùa đông nấm ký sinh trên sâu, tồn tại ở giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo.
Một số loài đáng chú ý là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền thống, các loài này đƣợc xếp vào họ Clavicipitaceae [33]. Đông trùng hạ thảo không chỉ đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu, mà còn đƣợc cả xã hội quan tâm đến, vì nấm là loại dƣợc liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ con ngƣời, phù hợp với mọi lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên, cho đến ngƣời già. Theo các tài liệu ghi chép về đông dƣợc cổ, đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, và có tác dụng tốt đối với trẻ em còi xƣơng chậm lớn.
Một số nghiên cứu hiện đại gần đây đã chỉ ra rằng nấm đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công năng của tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức năng thận, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ và chất phóng xạ. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về đông trùng hạ thảo nhìn chung chƣa nhiều. Phần lớn những gì mà các nhà nghiên cứu Việt Nam có đƣợc về nguồn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 3 dƣợc liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng của đông trùng hạ thảo sẵn có trong tự nhiên. Một số ít tiến hành những nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh lý của đông trùng hạ thảo cũng chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm.
Nhìn chung các nghiên cứu về đông trùng hạ thảo ở Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống. - Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng và phƣơng thức cấy giống đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn ƣơm sợi.
- Xác định đƣợc sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, độ ẩm không khí và cƣờng độ chiếu sáng đến sự hình thành phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris. Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống. - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng và phƣơng thức cấy giống đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn ƣơm sợi. - Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, độ ẩm không khí và cƣờng độ chiếu sáng đến sự hình thành phát triển quả thể nấm Cordyceps militaris.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 4 Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số yếu tố cơ bản tới sự sinh trƣởng của hệ sợi, sự hình thành, phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris sẽ là căn cứ khoa học cho việc hoàn thiện và đƣa quy trình sản xuất quả thể nấm đông trùng hạ thảo vào thực tế phục vụ đời sống con ngƣời. Ngoài ra kết quả của đề tài cũng cung cấp thông tin khoa học cho các nhà khoa học nghiên cứu chuyên sâu loài nấm quý hiếm Cordyceps militaris. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cƣơng về nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1.
Lịch sử nghiên cứu về Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo đƣợc xem là rất quý, hiếm. Những câu truyện mang tính thần thoại và truyền thuyết liên quan đến loài nấm này đƣợc lƣu truyền trong nhiều thiên niên kỷ. Hiện nay, các ghi nhận về thời gian phát hiện đầu tiên loài nấm này chƣa đƣợc thống nhất. Nhƣng theo Holliday và cộng sự (cs) (2004) tổng hợp từ nhiều nguồn tài liệu ghi nhận đầu tiên về nấm đông trùng hạ thảo đƣợc thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào triều đại nhà Đƣờng (618-907 sau công nguyên).
Sự ghi nhận này đã làm rõ bản chất sinh học từ những câu truyện huyền thoại và truyền thuyết về đông trùng hạ thảo. Đông trùng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm đƣợc chuyển một cách thần bí từ động vật sang thực vật vào mùa hè và sau đó lại từ thực vật chuyển sang động vật vào mùa đông. Tiếp sau đó có nhiều công trình đƣợc xuất bản với nội dung về loài nấm đông trùng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ 18, trong đó có công trình đầu tiên đƣợc cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả về nấm đông trùng hạ thảo của Wu-Yiluo năm 1757, trong cuốn sách Dược điển, dƣới triều đại Thanh. Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị của đông trùng hạ thảo thuộc về những ngƣời chăn bò trên núi Hymalaya ở Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng những chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm đông trùng hạ thảo vào mùa xuân đã trở nên cuồng nhiệt, bò đực luôn tìm và theo sát bò cái [18].
Phân loại học Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 6 Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau. Theo hệ thống phân loại truyền thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae [33]. Hình ảnh đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (www.jp) Phân loại nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Phân ngành : Ascomycotina Lớp : Sordariomycetes Bộ : Hypocreales Họ : Clavicipataceae Chi : Cordyceps Loài : Cordyceps militaris 1. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps Nấm đông trùng hạ thảo là tên chung chỉ một nhóm các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc sâu trƣởng thành của một số loại côn trùng.
Nấm đƣợc đặt tên đông trùng hạ thảo dựa vào quá trình phát sinh, phát triển và vòng đời của chúng. Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh. Các loài nấm này sử dụng các chất hữu cơ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 7 trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi.
Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả [7]. Nấm đông trùng hạ thảo thƣờng phát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển; đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam. Đây chính là nguồn đông trùng hạ thảo tự nhiên [11]. Ngoài ra còn phát hiện tại các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan.
Hiện nay, khoảng hơn 400 loài đã đƣợc tìm thấy, trong đó có khoảng 90 loài đƣợc phát hiện ở Trung Quốc [44]. Tại Việt Nam, đông trùng hạ thảo cũng đã đƣợc phát hiện tại nhiều địa điểm khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cs đã phát hiện 3 chủng là Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang [3], Cordyceps gunni Berk.
tại vƣờn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc [4], Cordyceps militaris Link. tại vƣờn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai [5]. Năm 2009, Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình về loài đông trùng hạ thảo lần đầu tiên đƣợc tìm thấy ở Việt Nam đó là loài đông trùng hạ thảo có tên là Isaria cerambycidae. Loài Đông trùng hạ thảo này đƣợc tìm thấy trên ấu trùng xén tóc [1].
Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát hiện đƣợc 2 giống là Cordyceps nutans ở Vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình) và Cordyceps militaris ở Vũ Quang (Hà Tĩnh) [8]. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps 1. Cordycepin Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng của nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đƣờng ribose. Cordycepin đƣợc phân lập lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris.
Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared), cordycepin đƣợc xem nhƣ là một hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc ly trích từ quả thể và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 8 sợi nấm. Cordycepin có công thức C10H13N5O3 và có phân tử lƣợng 251, điểm nóng chảy tại 230-2310C, độ hấp thu cực đại tại 259 nm. Có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhƣng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi [44]. Vì cordycepin có cấu trúc tƣơng tự adenosin nên RNA polymerase không thể phân biệt.
Khi tham gia tổng hợp nên phân tử RNA, cordycepin ngăn chặn quá trình kéo dài thêm các RNA và tạo ra các phân tử RNA kết thúc sớm. Do đó, cordycepin đƣợc xem nhƣ chất kháng ung thƣ hiệu quả [20]. Năm 2003, Sun và cs đã chứng minh hàm lƣợng cordycepin với hoạt tính kháng khối u ở Cordyceps kyushuensis cao hơn Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris, ở Cordyceps nuôi cấy cao hơn tự nhiên, và trong sợi nấm cao hơn ấu trùng chủ [32]. Tác giả cũng khẳng định rằng đây là hợp chất có tiềm năng dƣợc học cao.