Xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm từ dược liệu Lạc tiên và Bình vôi - Khóa luận Dược sĩ

Khóa luận Dược sĩ trình bày phương pháp xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm từ dược liệu Lạc tiên và Bình vôi, gồm các chỉ tiêu kiểm nghiệm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Phan Anh
• Người hướng dẫn: Thạc Sĩ Nguyễn Hoàng Lê
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Tiêu Chuẩn Chế Phẩm Từ Dược Liệu Chứa Lạc Tiên Và Bình Vôi
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về dược liệu Lạc tiên và Bình vôi

Lạc tiên và Bình vôi là hai dược liệu quý trong y học cổ truyền Việt Nam, được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm dạng viên nang. Dược liệu Lạc tiên chứa thành phần hoạt chất Vitexin, có tác dụng bình tĩnh thần kinh và cải thiện giấc ngủ. Dược liệu Bình vôi chứa alkaloid Tetrahydropalmatin (THP), có khả năng điều hòa huyết áp và cấp máu não. Việc xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm từ hai dược liệu này là cần thiết để đảm bảo chất lượng, an toàn và hiệu quả của sản phẩm. Các nghiên cứu hiện đại về tiêu chuẩn chất lượng đòi hỏi phải kiểm định các chỉ tiêu độc lập và lặp lại với phương pháp khoa học.

1.1. Dược liệu Lạc tiên và hoạt chất Vitexin

Lạc tiên là dược liệu từ cây Vitex trifolia L., có tác dụng hỗ trợ giấc ngủ và cân bằng tâm lý. Hoạt chất chính Vitexin là một flavonoid glycoside, có khả năng kích thích các thụ thể thần kinh. Chứng minh tiêu chuẩn Vitexin trong chế phẩm giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm cuối cùng.

1.2. Dược liệu Bình vôi và hoạt chất Tetrahydropalmatin

Bình vôi (Stephania tetrandra S. Moore) là dược liệu quý hiếm, chứa alkaloid Tetrahydropalmatin có tác dụng an thần, điều hòa huyết áp. THP là hoạt chất chính cần được kiểm định trong xây dựng tiêu chuẩn. Nồng độ THP ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả lâm sàng của chế phẩm.

II. Các phương pháp phân tích trong xây dựng tiêu chuẩn

Xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm yêu cầu áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại để đánh giá chất lượng toàn diện. Những phương pháp chính bao gồm sắc kí lớp mỏng (TLC) để kiểm định định tính, sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng hoạt chất Vitexin và Tetrahydropalmatin, và quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để phát hiện kim loại nặng. Mỗi phương pháp phải trải qua thẩm định phương pháp phân tích theo các tiêu chí LOD (Limit of Detection) và LOQ (Limit of Quantitation). Việc lựa chọn phương pháp thích hợp đảm bảo độ chính xác, độ lặp lại và đặc hiệu cao cho tiêu chuẩn chế phẩm.

2.1. Sắc kí lớp mỏng TLC cho kiểm định định tính

TLC là phương pháp đơn giản, nhanh chóng để kiểm định định tính Vitexin và Tetrahydropalmatin. Phương pháp này giúp xác định sự hiện diện của hoạt chất thông qua sắc kí đồ TLC so sánh với chất chuẩn. TLC có chi phí thấp và thích hợp cho kiểm tra chất lượng nhanh trong quy trình sản xuất chế phẩm viên nang.

2.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC cho định lượng

HPLC là phương pháp tiêu chuẩn vàng trong xây dựng tiêu chuẩn định lượng Vitexin và THP. Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chính xác hoạt chất trong chế phẩm, xây dựng đường chuẩn tuyến tính và tính độ thu hồi mẫu. HPLC đảm bảo đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp và lặp lại tốt.

2.3. Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS cho xác định kim loại nặng

AAS được sử dụng để xác định giới hạn kim loại nặng như Pb, Cd, As, Hg trong chế phẩm Lạc tiên và Bình vôi. Phương pháp này đạt độ nhạy cao, cho phép phát hiện các chất ô nhiễm ở nồng độ thấp, đảm bảo an toàn sử dụng cho bệnh nhân.

III. Tiêu chí kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm viên nang

Tiêu chuẩn chế phẩm viên nang chứa Lạc tiên và Bình vôi bao gồm nhiều chỉ tiêu kiểm nghiệm chi tiết. Các tiêu chí chất lượng cần đánh giá bao gồm: mất khối lượng do làm khô (water loss), giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn (tổng vi khuẩn hiếu khí, nấm men, nấm mốc), VK gram âm dung nạp mật. Ngoài ra, định lượng Tetrahydropalmatin và Vitexin là chỉ tiêu đặc biệt quan trọng để đảm bảo hiệu quả lâm sàng. Mỗi tiêu chí phải được xác định giới hạn cụ thể dựa trên DDDVN, Ph.Eur hoặc USP, đảm bảo tiêu chuẩn chế phẩm cao nhất.

3.1. Tiêu chí vật lý và hóa học

Mất khối lượng do làm khô (drying loss) phải nằm trong giới hạn 5-10% để đảm bảo chất lượng chế phẩm viên nang. Định lượng Tetrahydropalmatin tối thiểu 0,2% và Vitexin tối thiểu 0,5% cần được xác định bằng HPLC. Độ hòa tan viên nang trong dung dịch pH 1.2 và pH 6.8 phải đạt yêu cầu để đảm bảo sinh khả dụng dược học.

3.2. Tiêu chí vi sinh vật

Giới hạn nhiễm khuẩn bao gồm tổng vi khuẩn hiếu khí (≤10⁴ CFU/g), tổng nấm men/mốc (≤10² CFU/g), không chứa S. aureus, E. coli, Salmonella. Các tiêu chí vi sinh vật này bắt buộc theo DDDVN 2017 để đảm bảo an toàn sử dụng chế phẩm viên nang.

3.3. Tiêu chí kim loại nặng và tạp chất

Giới hạn kim loại nặng phải kiểm định Pb (≤10 ppm), Cd (≤0,5 ppm), As (≤1 ppm), Hg (≤0,1 ppm) bằng AAS. Kiểm định tạp chất hữu cơ từ công đoạn chế biến, tạp chất vô cơ từ dung dịch chiết, đảm bảo chất lượng chế phẩm an toàn lâu dài.

IV. Thẩm định phương pháp phân tích và ứng dụng thực tiễn

Thẩm định phương pháp phân tích là bước không thể thiếu trong xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm hiện đại. Phương pháp định lượng Tetrahydropalmatin bằng HPLC cần được thẩm định các tham số: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (1-20 ppm), độ chính xác (recovery 90-110%), độ lặp lại (RSD < 5%), LOD (0,2 ppm), LOQ (0,5 ppm). Tương tự, phương pháp định lượng Vitexin cũng cần thẩm định đầy đủ. Sau khi phương pháp được thẩm định, có thể áp dụng để kiểm nghiệm mẫu chế phẩm trong sản xuất hàng loạt, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng ổn định, nhất quán. Kết quả thẩm định phương pháp cung cấp cơ sở khoa học cho tiêu chuẩn chế phẩm chính thức.

4.1. Các tham số thẩm định phương pháp HPLC

Độ đặc hiệu được xác định bằng cách chạy HPLC mẫu gốc, mẫu chuẩn và mẫu bổ sung, không được có tín hiệu can nhiễu tại thời gian lưu của hoạt chất. Khoảng tuyến tính phải bao phủ nồng độ dự kiến của mẫu. Độ lặp lại (intra-day precision) được xác định qua 6 mẫu chuẩn trên cùng ngày.

4.2. Ứng dụng tiêu chuẩn trong kiểm soát chất lượng sản xuất

Tiêu chuẩn chế phẩm được xây dựng sau khi thẩm định phương pháp phân tích giúp kiểm soát chất lượng ở mỗi giai đoạn sản xuất viên nang Lạc tiên-Bình vôi. Kiểm nghiệm từng batch đảm bảo nồng độ hoạt chất ổn định, không có tạp chất, an toàn vi sinh vật. Kết quả định lượng Tetrahydropalmatin và Vitexin qua HPLC cung cấp đảm bảo hiệu quả lâm sàng cho bệnh nhân.

4.3. Xây dựng tiêu chuẩn chính thức DDDVN

Sau khi hoàn thành thẩm định phương pháp và kiểm nghiệm mẫu thực tế, tiêu chuẩn chế phẩm có thể được biên soạn vào DDDVN (Dược Điển Dân Tộc Việt Nam). Quá trình xây dựng tiêu chuẩn cần báo cáo kỹ lưỡng, đánh giá độc lập từ các chuyên gia, cơ quan kiểm định để đảm bảo chất lượng cao nhất cho sản phẩm dược phẩm công khai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, “thực phẩm bảo vệ sức khoẻ” đã trở thành một cụm từ khá thông dụng trong đời sống thường nhật. Các thực phẩm bảo vệ sức khỏe nguồn gốc thiên nhiên trong thời gian gần đây được gia tăng sử dụng, vì được coi là an toàn, nhưng trên thực tế, đã có nhiều trường hợp thực phẩm bảo vệ sức khỏe có trộn trái phép hoạt chất hoá dược không công bố, gây nguy hại cho sức khoẻ. Bên cạnh đó, cũng tồn tại vấn đề về một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ thảo dược không có tác dụng thực sự, có thể vì nhiều nguyên nhân: nguồn thảo dược nguyên liệu không đảm bảo chất lượng, quy trình sản xuất không phù hợp làm mất tác dụng của dược liệu. Tuy nhiên vẫn tồn tại nhiều thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ dược liệu có chất lượng tốt các thuốc dược liệu được kiểm soát chất lượng rất chặt chẽ, nhưng yêu cầu đối với thực phẩm bảo vệ sức khỏe không được nghiêm ngặt giống như thuốc từ dược liệu.

Do vậy, việc tiêu chuẩn hoá tốt các chế phẩm từ dược liệu là một phần quan trọng để có thể phát triển các thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị bệnh hiệu quả, tiến tới phát triển thành dược liệu. Các nhà nghiên cứu kêu gọi việc thực thi nghiêm ngặt và đặt ra những tiêu chuẩn quy định cho thực phẩm bảo vệ sức khoẻ như dược phẩm cùng một mục tiêu là bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng [34]. Nightcare – thực phẩm bổ sung hỗ trợ điều trị mất ngủ do trường đại học Bách Khoa Hà Nội nghiên cứu và phát triển, chứa đồng thời hai dược liệu Bình vôi và Lạc tiên. Hiện nay trên thị trường được bán dưới dạng thực phẩm chức năng, đã được chứng nhận an toàn ở Cục an toàn Vệ sinh thực phẩm.

Do đó nhóm nghiên cứu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội hiện đang phối hợp với nhóm nghiên cứu ở bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm chứa Bình vôi và Lạc tiên” với mục tiêu: • Xây dựng tiêu chí chất lượng cho chế phẩm chứa Bình vôi và Lạc tiên. • Thử nghiệm tính khả thi và thẩm định phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để đánh giá chất lượng của chế phẩm.1 Tổng quan về dược liệu Bình vôi và Tetrahydropalmatin 1.1 Dược liệu Bình vôi 1.1 Đặc điểm dược liệu và phân bố Dược liệu Bình vôi (Tuber Stephaniae), là phần rễ củ đã phơi hay sấy khô của cây Bình vôi (Stephania glabra - Họ Tiết Dê), mặt ngoài màu đen, hình dạng không nhất định. Bình vôi trồng 2-3 năm có thể cho thu hoạch củ, củ trồng càng lâu thì năng suất càng cao.

Để củ có hàm lượng hoạt chất cao nhất, nên thu hoạch vào mùa thu - đông [7]. Ở Việt Nam có khoảng 10 -12 loài, trong đó có 8-9 loài có rễ củ to còn được gọi chung là “củ Bình vôi”, phân bố chủ yếu ở vùng núi đá vôi các tỉnh phía Tây Bắc: Hà Giang; Lào Cai; Lạng Sơn; Cao Bằng… Hình 1.1: Hình ảnh sau khi chế biến của củ Bình vôi (dược liệu Bình vôi) 1.2 Thành phần hóa học Hàm lượng alkaloid toàn phần cũng như hàm lượng Tetrahydropalmatin thay đổi tùy theo loài và vùng thu hái [6]. Loài Stephania glabra chứa alkaloid chính là Tetrahydropalmatin, hay còn gọi là rotundin; hyndarin. Ngoài ra còn chứa cyleanin; stephanin; palmatin; tinh bột, đường và acid hữu cơ [7].3 Công dụng Theo kinh nghiệm của nhân dân, Bình vôi chữa mất ngủ, ho hen, sốt, kiết lỵ, đau bụng.

Bình vôi được phối hợp với các vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngứa lở ngoài da, mụn nhọt. Củ Bình vôi được thái nhỏ, phơi khô sắc nước uống hoặc dạng bột 2 ngâm rượu hay chè thuốc. Củ Bình vôi còn có tác dụng dùng ngoài bằng cách giã nát, đắp vào chỗ vết thương [7]. Bình vôi còn rất hữu ích trong việc điều trị bệnh béo phì và xơ vữa động mạch [23].2 Tetrahydropalmatin Trong chuyên luận Dược điển Việt Nam V, Tetrahydropalmatin (THP) là hoạt chất chính dùng để định tính, định lượng dược liệu Bình vôi.1 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý, hóa học Cấu trúc hóa học của Tetrahydropalmatin được thể hiện ở Hình 1.

Tên IUPAC: (13aS)-2,3,9,10- tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5H- isoquinolino[2,1-b] isoquinoline. Công thức phân tử: C21H25NO4 Khối lượng phân tử: 355.2: Công thức cấu tạo Tetrahydropalmatin Tetrahydropalmatin là một alkaloid berberin thu được bằng cách bổ sung hai phân tử hydro vào vòng pyridin của palmatin [36]. THP có đầy đủ các tính chất của alkaloid. THP là chất rắn, có màu vàng.

Dạng base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ: methanol; ethanol; cloroform… [6].2 Tác dụng dược lý Đồng phân levo-Tetrahydropalmatin (l-THP) góp phần vào tác dụng chữa bệnh của dược liệu Bình vôi, còn đồng phân dextro-Tetrahydropalmatin (d-THP) có các tác dụng dược lý riêng như làm giảm thiểu monoamin và có độc tính [27]. Ngoài ra, d-THP còn hoạt động như là một chất cung cấp dopamin còn l-THP lại là chất đối kháng dopamin trong não [16]. Tác dụng giảm đau 3 THP có tác dụng giảm đau và đã được sử dụng trên lâm sàng ở Trung Quốc trong hơn 40 năm như một loại thuốc giảm đau. Tuy nhiên cơ chế giảm đau của nó vẫn chưa rõ ràng [31], có thể do tác dụng giảm đau đối kháng naloxon và không có ái lực với receptor opioid [33] hoặc đối kháng thụ thể dopamin D1 [32].

Tác dụng an thần, gây ngủ, giải lo âu Tác dụng này là do sự đối kháng với thụ thể dopamin D1/D2 trên não [16]. Cải thiện chứng sa sút trí tuệ liên quan đến lão hóa Một nghiên cứu tiến hành tiêm dưới da D-galactose, một loại đường khử gây stress oxy hoá gây suy giảm trí nhớ, với liều 100 mg/kg/ngày cho chuột trong 8 tuần đồng thời với uống THP ở liều 20,40,80 mg/kg/ngày. Kết quả cho thấy THP có thể bảo vệ hệ thống thần kinh chống lại những tổn thương do D-galactose gây ra [20]. Tiềm năng trong việc điều trị chứng nghiện cocain Các thử nghiệm lâm sàng sơ bộ ở Trung Quốc cho thấy l-THP làm giảm thèm muốn thuốc, tái nghiện và hỗ trợ quá trình cai nghiện ở những người nghiện heroin.

Cơ chế được cho là do sự đối kháng thụ thể dopamin của l-THP. Tác dụng dược lý khác Tetrahydropalmatin còn có một số tác dụng dược lý khác bao gồm tác dụng hạ huyết áp [18], tác dụng bảo vệ tế bào nội mô do chiếu xạ gây ra [30], tác dụng bảo vệ các tổn thương tái tưới máu do thiếu máu cục bộ ở cơ tim [15]… 1.3 Các phương pháp xác định Bình vôi là dược liệu rất phổ biến, trong đó THP là thành phần hoạt chất chính đã được nhiều nhà nghiên cứu tiến hành phân tích. Một số phương pháp phân tích THP trong Bình vôi được trình bày trong Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích THP Tên tác giả Mẫu Phương pháp định lượng Kết quả Shi và cộng Viên nén HPLC: Độ thu hồi: sự (2003) Xion tong Pha tĩnh: Kromasil ODS C18 97,98%, [25] pian (250 mm × 4,6 mm,5 μm) RSD=1,19% Pha động: Methanol: Đệm phosphat (65:35) Detector DAD Guan Qiang Dược liệu HPLC Độ thu hồi: và cộng sự Huyền Hồ Pha tĩnh: ZORBAX SB C18 99,84%, (2009) [14] Pha động: methanol-acid phosphoric RSD=0,46% (60∶40) Detector: DAD Li Chao-Wu Huyết tương HPLC LLOQ = 0,01 và cộng sự Pha tĩnh: Phenomenex luna C18 (250 µg/ml (2011) [17] mm × 4,6 mm, 5 μm) Pha động: Methanol: H2O (75:25) Detector: DAD Nhận xét: Trong hầu hết các bài nghiên cứu, các tác giả chủ yếu sử dụng pha tĩnh là cột C18 không phân cực và pha động phân cực chứa methanol (MeOH), detector hay dùng là Diode- Array detector (DAD).2 Tổng quan về dược liệu Lạc tiên và Vitexin 1.1 Dược liệu Lạc tiên 1.1 Mô tả dược liệu Dược liệu Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae) là phần trên mặt đất đã phơi hoặc sấy khô của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.), họ Lạc tiên (Passifloraceae). Đoạn thân rỗng, dài khoảng 5 cm, mang tua cuốn và lá, có thể có lẫn hoa và quả.

Thân và lá có nhiều 5 lông. Cuống lá dài 3 cm đến 4 cm. Phiến lá mỏng màu lục hay hơi vàng nâu, dài và rộng khoảng 7 cm đến 10 cm, chia thành 3 thùy rộng, đầu nhọn. Mép lá có răng cưa nông, gốc lá hình tim.

Lá kèm hình vẩy phát triển thành sợi mang lông tiết đa bào, tua cuốn ở nách lá [4]. Ở Việt Nam, Lạc tiên là loài mọc tự nhiên phân bố rộng rãi nhất. Cây phân bố ở khắp các tỉnh trung du, vùng núi thấp (dưới 1000m) và đôi khi cả vùng đồng bằng [7]. Hình ảnh dược liệu Lạc tiên được trình bày ở Hình 1.3: Hình ảnh dược liệu Lạc tiên sau khi chế biến 1.2 Thành phần hóa học Thân mang lá của cây Lạc tiên mọc ở Việt Nam có triterpen, flavonoid, alkaloid, acid hữu cơ và chất khử.

Các hợp chất phenol có mặt cả trong thân và lá. Alkaloid chỉ có trong lá, chủ yếu là Vitexin và xylosyl Vitexin [5]. Hàm lượng flavonoid toàn phần là 0,074%. Ngoài ra cây còn chứa 0,033% alkaloid, trong đó có harman [7].3 Công dụng Lạc tiên được dùng làm thuốc an thần chữa bệnh mất ngủ, suy nhược thần kinh, động kinh, co giật [6], [7].

Ngọn và lá non làm rau, quả chín ăn được. Lá giã đắp chữa mụn nhọt, lở loét ở chân, viêm mủ da. Toàn cây chữa bỏng lửa, bỏng nước sôi [7].2 Vitexin Trong chuyên luận Dược điển Việt Nam V, Vitexin (VTX) là hoạt chất chính dùng để định tính dược liệu Lạc tiên bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng.1 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý, hóa học. Cấu trúc hóa học của Vitexin thể hiện ở hình 1.

Tên IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(4- hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)- 3,4,5-trihydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan- 2-yl] chromen - 4-one Công thức phân tử: C21H20O10 Khối lượng phân tử: 432,4 g/mol Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Vitexin Vitexin là chất rắn, có màu vàng, khó tan trong dung môi hữu cơ, tan tốt trong dimethyl sulfoxid [5]. Tác dụng chống oxy hóa Vitexin có tác dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng loại bỏ các gốc tự do sinh ra do quá trình tiếp xúc với tia UVB. Vitexin chống lại các loại phản ứng oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid và các tổn thương oxy hóa khác trong một loạt các bệnh liên quan đến oxy hóa, bao gồm co giật, suy giảm trí nhớ, thiếu máu cục bộ não, nhiễm độc thần kinh, tổn thương cơ tim và hô hấp và rối loạn chức năng trao đổi chất [11].