Tài liệu Y tế: Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu

Phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác độc tố gây hại cho sức khỏe người dùng.

• Tác giả: Hà Anh Tuấn
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Phương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái Niệm Về Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng

Xây dựng phương pháp định lượng là quá trình phát triển và thiết lập các kỹ thuật phân tích khoa học để đo lường chính xác hàm lượng các chất trong mẫu. Trong lĩnh vực dược liệu, việc xây dựng phương pháp định lượng đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn sản phẩm. Phương pháp này áp dụng các công nghệ hiện đại như sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để phát hiện và định lượng các tạp chất có hại, đặc biệt là aflatoxin - một độc tố nguy hiểm từ nấm mốc. Quá trình xây dựng bao gồm lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng đường chuẩn, và thẩm định phương pháp để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy.

1.1. Định Nghĩa Phương Pháp Định Lượng

Phương pháp định lượng là kỹ thuật phân tích cho phép xác định chính xác nồng độ hoặc hàm lượng của một hay nhiều chất trong mẫu. Nó khác với phương pháp định tính chỉ xác định sự có mặt hay vắng mặt của chất. Trong dược liệu, phương pháp này cực kỳ quan trọng để kiểm soát chất lượng sản phẩm và đảm bảo hiệu quả điều trị cũng như an toàn cho người sử dụng.

1.2. Tầm Quan Trọng Trong Dược Liệu

Việc xây dựng phương pháp định lượng trong dược liệu giúp phát hiện các tạp chất độc hại như aflatoxin, một độc tố gây ung thư. Sử dụng công nghệ LC-MS/MS cho phép đạt độ chính xác cao, giới hạn phát hiện thấp, và khả năng phân biệt các chất tương tự. Điều này bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và nâng cao chất lượng sản phẩm dược liệu trên thị trường.

II. Aflatoxin Và Tầm Quan Trọng Của Việc Phát Hiện

Aflatoxin là các độc tố sinh ra từ các loài nấm mốc, đặc biệt là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Chúng có thể xuất hiện trong dược liệu do điều kiện bảo quản không tốt hoặc nguyên liệu bị nhiễm. Các loại aflatoxin chính bao gồm AFB1, AFB2, AFG1, và AFG2, trong đó AFB1 là độc tố mạnh nhất gây ung thư gan ở người. Việc xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin bằng LC-MS/MS cho phép phát hiện những hàm lượng rất nhỏ, đảm bảo an toàn sản phẩm. Giới hạn định lượng được thiết lập theo tiêu chuẩn quốc tế, giúp kiểm soát chất lượng dược liệu bán trên thị trường.

2.1. Đặc Điểm Và Độc Tính Của Aflatoxin

Aflatoxin là một độc tố sinh học có khả năng gây ung thư gan (HCC), đặc biệt là AFB1 được IARC xếp vào nhóm độc tố loại 1. Chúng có thể tích lũy trong cơ thể con người qua thực phẩm, dược liệu nhiễm bẩn. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin liên quan đến việc ức chế hệ miễn dịch và gây đột biến DNA, dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng.

2.2. Nguy Hiểm Từ Dược Liệu Nhiễm Bẩn

Các dược liệu giàu tinh bột như lạc, cây cối và hạt giống có nguy cơ cao bị nhiễm aflatoxin do điều kiện lưu trữ không tốt. Khi những sản phẩm này được xử lý thành dược liệu mà không kiểm soát chất lượng, aflatoxin có thể đi vào cơ thể người tiêu dùng, gây ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe.

III. Công Nghệ LC MS MS Trong Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng

Sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS/MS) là công nghệ tiên tiến trong xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin. Kỹ thuật này kết hợp sắc ký lỏng với khối phổ hai lần, cho phép tách biệt các chất và xác định chính xác cấu trúc phân tử của từng hợp chất. Ưu điểm của LC-MS/MS bao gồm độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) tốt, và khả năng phân tích đa phần tử cùng lúc. Phương pháp này tuân thủ tiêu chuẩn quốc tế AOAC, đảm bảo độ tin cậy và độ lặp lại của kết quả phân tích. Quy trình xây dựng bao gồm khảo sát điều kiện pha tĩnh, pha động, xử lý mẫu, và thẩm định toàn diện.

3.1. Nguyên Lý Hoạt Động Của LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động bằng cách tách các chất trong mẫu bằng sắc ký lỏng, sau đó các phân tử được ion hóa bằng electrospray ionization (ESI) và phân tích bằng khối phổ hai lần. Phương pháp này cho phép phát hiện các tạp chất ở hàm lượng cực thấp, đặc biệt hữu ích trong việc định lượng aflatoxin trong dược liệu.

3.2. Thẩm Định Phương Pháp LC MS MS

Thẩm định phương pháp bao gồm xác định tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại (RSD), và độ thu hồi (R%). Những thông số này đảm bảo phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu chất lượng quốc tế và có thể áp dụng thực tế để kiểm soát dược liệu trên thị trường.

IV. Quy Trình Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Aflatoxin Trong Dược Liệu

Quy trình xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin bao gồm nhiều bước quan trọng. Đầu tiên, thu thập mẫu dược liệu từ thị trường Hà Nội, đặc biệt là những dược liệu giàu tinh bột. Tiếp theo là khảo sát điều kiện sắc ký bao gồm lựa chọn pha tĩnh (C18 hoặc tương tự) và pha động (dung dịch đệm và methanol). Xử lý mẫu là bước quan trọng, bao gồm chiết mẫu với các dung môi thích hợp và làm sạch bằng SPE (chiết pha rắn) hoặc SPE-IM (chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch). Sau đó, xây dựng đường chuẩn bằng các chất chuẩn aflatoxin chính thức. Cuối cùng, thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn AOAC, kiểm tra độ chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại, và độ thu hồi.

4.1. Thu Thập Và Xử Lý Mẫu Dược Liệu

Thu thập mẫu được thực hiện từ các cửa hàng, nhà phân phối dược liệu trên thị trường Hà Nội. Mẫu được chọn ngẫu nhiên từ các lô khác nhau để đảm bảo tính đại diện. Xử lý sơ bộ mẫu bao gồm làm khô, nghiền mịn, và lưu trữ ở điều kiện thích hợp. Sau đó, mẫu được chiết bằng dung môi phù hợp (thường là methanol hoặc dung dịch đệm) để tách aflatoxin từ ma trận mẫu.

4.2. Khảo Sát Điều Kiện Sắc Ký Và Khối Phổ

Khảo sát pha tĩnh nhằm chọn cột sắc ký phù hợp (thường là C18 hay tương tự). Khảo sát pha động bao gồm lựa chọn tỷ lệ methanol/dung dịch đệm tối ưu để đạt độ phân biệt tốt nhất. Khảo sát khối phổ xác định điều kiện ion hóa và đo lường tối ưu. Những thông số này đảm bảo phương pháp định lượng có độ chính xác cao và khả năng phát hiện aflatoxin hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, dƣợc liệu cũng nhƣ các sản phẩm từ dƣợc liệu đƣợc nhân dân sử dụng ngày càng nhiều. Để đảm bảo ngƣời dân đƣợc sử dụng những sản phẩm tốt nhất, cũng nhƣ an toàn cho sức khỏe, ngoài việc đảm bảo các tiêu chí trong Dƣợc điển các sản phầm này cũng nên đƣợc kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm các độc tố nấm, trong đó phổ biến nhất là aflatoxin. Hiện nay trên thế giới nhiều tác giả đã tiến hành xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong nhiều nền mẫu dƣợc liệu khác nhau. Tuy nhiên, trong nƣớc hiện tại các nghiên cứu công bố cho thấy quy trình xử lý mẫu trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều thời gian nên hiệu suất còn chƣa đƣợc cao.

Vì vậy, nhằm đƣa ra đƣợc phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu với hiệu suất thu hồi cao và phƣơng pháp đơn giản, cũng nhƣ tiết kiệm thời gian hơn, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin trong dƣợc liệu bằng LC-MS/MS”, áp dụng để xác định hàm lƣợng aflatoxin trong một số dƣợc liệu với mục tiêu: - Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời 4 độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn với cột ái lực miễn dịch (SPE-IM). - Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm một số aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu thu mua trên thị trƣờng Hà Nội.MS CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về aflatoxin 1. Giới thiệu về aflatoxin Aflatoxin đƣợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây.

Những con gà tây này bị hoại tử gan sau khi đƣợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƣợc xác định là nguyên nhân gây bệnh [15,25]. Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus. Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trƣớc và sau khi thu hoạch, khi bảo quản cũng nhƣ chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƣ ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu nhƣ hạt đậu, hạt hƣớng dƣơng, bông; các loại gia vị nhƣ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát.

Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tƣơng tự nhau và đều là dẫn chất của difuranocoumarin, đƣợc tổng hợp nhờ con đƣờng polyketide. Ngày nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƣợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2 [27]. Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. Thông thƣờng, nếu không có aflatoxin B1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14].

Tính chất hóa lý Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ nhƣ cloroform, methanol, dimethyl sulfoxid. Độ tan của aflatoxin trong nƣớc vào khoảng 10– 20 mg/l. Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể đƣuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3].MS Ở nhiệt độ đun nấu thông thƣờng không thể phân hủy đƣợc aflatoxin, nhƣng dƣới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy. Trong công thức cấu tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƣợc tái tạo [3].

Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát hiện với lƣợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn). Đây chính là cơ sở hóa lý cho việc phát hiện và định lƣợng các hợp chất này [3]. Tính chất của một vài aflatoxin Loại TLPT STT CTPT Tính chất CTCT TLTK aflatoxin (đvC) - Nhiệt độ nóng chảy 268-269 oC - Huỳnh quang màu xanh da trời. - [α]D: -480o (0,1M/dimethyl 1 AFB1 C17H12O6 312 [22] formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 223; 265; 362 nm.

- Nhiệt độ nóng chảy 286-289 oC - Huỳnh quang màu xanh da trời. 2 AFB2 C17H14O6 314 - [α]D: -492o (0,1M/cloroform) [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 265; 363 nm.MS - Nhiệt độ nóng chảy 244-246 oC - Huỳnh quang màu xanh lá cây. - [α]D: -556o (0,1M/cloroform) 3 AFG1 C17H12O7 328 [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 243; 257; 264; 362nm. - Nhiệt độ nóng chảy 237-240 oC - Huỳnh quang màu xanh lá cây.

4 AFG2 C17H14O7 330 - [α]D: -430o (0,084M/cloroform) [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 265; 363 nm. - Nhiệt độ nóng chảy 299 oC - Huỳnh quang màu xanh tím. - [α]D: -280o (0,1M/dimethyl 5 AFM1 C17H12O8 344 [22] formamid) - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 266; 265; 357 nm.MS - Nhiệt độ nóng chảy 293 oC - Huỳnh quang màu tím. 6 AFM2 C17H14O8 346 [22] - Hấp thụ UV cực đại trong môi trƣờng ethanol: 221; 264; 357 nm.

Điều kiện sinh aflatoxin  Chủng giống: Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A. parasiticus là hai chủng nấm chủ yếu thƣờng gặp sinh aflatoxin B1 [12]. Hầu hết các chủng nấm Aspergillus sinh trƣởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm không khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng lƣợng dạng tinh bột [6]. Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học.

 Điều kiện môi trƣờng và cơ chất: Các chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lƣợng (thƣờng dƣới dạng tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm (Zn). Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thƣờng có trong những sản phẩm nhiều tinh bột, các hạt có dầu nhƣ hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14]. Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hƣởng đến sự tạo thành aflatoxin. Nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƣợt là 12oC và 42oC.

Nhiệt độ tối ƣu để hình thành aflatoxin là 25-35oC, nhiệt độ tối ƣu để tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28oC. Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21]. Nhƣ vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hƣởng rất lớn đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm. Các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mƣa nhiều phần lớn 7 Xay.MS thời gian trong năm, thƣờng có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với các nƣớc ôn đới.

Các nƣớc đang phát triển nhƣ ở khu vực Đông Nam Á, Châu Phi.chƣa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và bảo quản chƣa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dƣợc liệu nói riêng. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin Trong số các loại aflatoxin thì AFB1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lƣơng thực, thực phẩm. AFB1 đƣợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo- 8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa AFB1 là một bƣớc nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƣ.

Aflatoxin exo-8,9-epoxide là một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine. Aflatoxin-N7-guanine methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thƣ [13,19]. Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hƣởng chức năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hƣởng đến quá trình phiên mã và dịch mã [12].

AFB1 ức chế enzyme glycogen synthetase và transglycosylase làm giảm glycogen ở gan và tăng glucose trong máu. AFB1 ức chế phosphoglucomutase – một enzyme xúc tác thuận nghịch phản ứng chuyển G6P Glucose-6-phosphate thành Glucose-1-phosphate, dẫn đến tích lũy G6P Glucose-6-phosphate và giảm tổng hợp glycogen [12].MS Aflatoxin còn ảnh hƣởng đến DNA và cấu trúc ty thể. Aflatoxin-8,9- epoxide ƣu tiên gắn vào DNA của ty thể hơn là DNA nhân tế bào cản trở sản xuất ATP làm mất chức năng tổng hợp năng lƣợng dƣới dạng ATP của ty thể và gây tăng chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [12,13]. Độc tính của aflatoxin lên cơ thể ngƣời Aflatoxicosis là tình trạng bệnh lý do nhiễm độc aflatoxin, ở ngƣời phơi nhiễm với aflatoxin có thể xảy ra aflatoxicosis cấp hoặc mạn tính [9,13].

Độc tính cấp bao gồm: sốt cao, xuất huyết, tổn thƣơng gan cấp với biểu hiện nhiễm độc gan nặng (tỷ lệ tử vong 25%), phù, rối loạn tiêu hóa, rối loạn hấp thu và/hoặc chuyển hóa chất dinh dƣỡng, thậm chí có thể gây tử vong. Aflatoxicosis nguyên phát cấp tính xuất hiện khi phơi nhiễm với lƣợng trung bình đến lƣợng lớn aflatoxin [12,14]. Độc tính mạn của aflatoxin B1 do tiêu thụ lƣợng thấp đến trung bình aflatoxin, thƣờng không có biểu hiện lâm sàng và khó nhận ra. Sau thời gian phơi nhiễm kéo dài, AFB1 có thể gây quái thai và tật nguyền bẩm sinh; đột biến gen làm thay đổi mã gen và DNA, phá vỡ nhiễm sắc thể, tái sắp xếp các mảnh nhiễm sắc thể, tăng thêm hoặc mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung thƣ trong đó HCC (ung thƣ biểu mô tế bào gan) là loại ung thƣ thƣờng gặp do AFB1 [12,14].

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc AFB1 là yeus tố nguy cơ chính dẫn đến ung thƣ gan. IARC phân loại AFB1 là tác nhân gây HCC nhóm I [23]. Cơ chế HCC do AFB1 đƣợc chứng minh là do đột biến gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T), kết quả là argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những bệnh nhân HCC [14].

Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với AFB1 và virus HBV hoặc HCV [27]. Ở những cá thể có HbsAg dƣơng tính, aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những ngƣời không nhiễm virus.