Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô nhọ nồi (Eclipta prostrata) và đánh giá tác dụng đông máu in-vitro

Nghiên cứu xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô nhọ nồi và đánh giá tác dụng đông máu in vitro thông qua thời gian PT APTT. Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ về

• Tác giả: Lê Thị Linh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Chi
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và đánh giá ảnh hưởng đến thời gian PT và APTT của quá trình đông máu in-vitro của cao khô nhọ nồi
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây nhọ nồi và cao khô dược liệu

Cây nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae), là dược liệu quen thuộc trong y học cổ truyền Việt Nam. Cây phân bố rộng rãi tại vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, thường mọc hoang ở những nơi ẩm ướt. Bộ phận sử dụng chủ yếu là toàn cây, thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa hè. Thành phần hóa học chính bao gồm wedelolactone, demethylwedelolactone, ecliptasaponin A, B, C cùng các flavonoid và polyphenol. Cao khô nhọ nồi được bào chế bằng phương pháp chiết xuất ethanol, cô đặc dưới áp suất giảm. Quá trình sản xuất phải đảm bảo giữ nguyên hoạt chất sinh học. Dược liệu này có tác dụng cầm máu, bổ gan thận, làm đen tóc theo y học dân gian. Nghi cứu hiện đại证实 tác dụng chống viêm, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Việc xây dựng chỉ tiêu chất lượng cho cao khô là bước quan trọng để标准化 sản xuất và đảm bảo hiệu quả điều trị.

1.2. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý chính

Nghiên cứu hóa học cho thấy nhọ nồi chứa coumestan (wedelolactone, demethylwedelolactone), triterpenoid (ecliptasaponin A, B, C), flavonoid (luteolin, apigenin), polyphenol và tinh dầu. Wedelolactone là marker compound chính, có hoạt tính chống viêm mạnh thông qua ức chế NF-κB. Ecliptasaponin có tác dụng bảo vệ gan, hạ men gan. Dịch chiết nhọ nồi显示出 tác dụng cầm máu rõ rệt trên mô hình in-vitro bằng cách缩短 thời gian prothrombin (PT) và thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (APTT). Hoạt chất chính responsible cho tác dụng đông máu là các flavonoid và polyphenol.

II. Xây dựng chỉ tiêu chất lượng cho cao khô nhọ nồi

Xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô nhọ nồi bao gồm nhiều hạng mục kiểm tra khác nhau. Chỉ tiêu cảm quan đánh giá màu sắc, mùi vị, trạng thái của cao khô đạt chuẩn. Chỉ tiêu định tính sử dụng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lớp mỏng (TLC) để xác định sự có mặt của nhóm hoạt chất. Phản ứng với NaOH 10% cho tủa vàng, với FeCl3 5% cho tủa xanh đen xác định flavonoid và tanin. Phản ứng diazo phát hiện coumarin. Định tính bằng TLC sử dụng wedelolactone làm chất đối chiếu, hệ dung môi chloroform-methanol (9:1). Chỉ tiêu định lượng xác định hàm lượng wedelolactone bằng HPLC. Các chỉ tiêu lý hóa bao gồm độ ẩm (không quá 10%), tro toàn phần (không quá 5%), tan trong nước (không dưới 50%). Kiểm tra tạp nhiễm vi sinh vật phải đạt tiêu chuẩn dược điển. Việc xây dựng hệ thống chỉ tiêu toàn diện đảm bảo chất lượng đồng nhất giữa các lô sản xuất.

2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng định tính cao khô

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để định tính cao khô nhọ nồi với wedelolactone làm chất đối chiếu. Hệ thống sắc ký gồm: pha tĩnh silica gel 60 F254, pha động chloroform-methanol (9:1). Điểm mẫu và chất đối chiếu được chấm lên bản TLC, phát triển sắc ký trong buồng bão hòa. Quan sát dưới đèn UV 254 nm và 365 nm. Wedelolactone cho vết huỳnh quang đặc trưng màu xanh tím dưới UV 365 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% và sấy ở 105°C, xuất hiện các vết màu đặc trưng. Rf của wedelolactone trong điều kiện chuẩn khoảng 0.45-0.55. Phương pháp này có độ nhạy cao, chi phí thấp, phù hợp kiểm tra chất lượng hàng loạt.

III. Đánh giá tác dụng đông máu in vitro của cao khô nhọ nồi

Đánh giá tác dụng đông máu in-vitro của cao khô nhọ nồi được thực hiện bằng hai chỉ tiêu chính: thời gian prothrombin (PT) và thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (APTT). Mẫu máu người khỏe mạnh được sử dụng, chống đông bằng natri citrat 3.8%. Cao khô nhọ nồi được hòa tan trong DMSO, pha loãng với nồng độ khác nhau (50, 100, 200, 400 µg/ml). Thiết bị đo đông máu tự động được hiệu chuẩn trước mỗi lần đo. Kết quả cho thấy cao khô nhọ nồi缩短 cả PT và APTT theo cách phụ thuộc liều. Ở nồng độ 200 µg/ml, PT giảm trung bình 15-20% so với nhóm đối chứng. APTT giảm 20-25% ở cùng nồng độ. Cơ chế tác dụng liên quan đến hoạt hóa yếu tố đông máu nội sinh và ngoại sinh. Các flavonoid trong cao khô có thể tác động lên con đường chung của quá trình đông máu,促进 hình thành fibrin từ fibrinogen. Kết quả证实 tác dụng cầm máu của dược liệu theo cơ chế đông máu.

3.2. Phương pháp đo thời gian APTT và phân tích kết quả

APTT đánh giá con đường đông máu nội sinh và con đường chung (yếu tố I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII). Thuốc thử phospholipid và chất hoạt hóa (kaolin hoặc ellagic acid) được thêm vào huyết tương, ủ 3 phút ở 37°C. Sau đó thêm CaCl2 0.025M đã ủ ấm, đo thời gian hình thành cục máu đông. Giá trị APTT bình thường là 25-35 giây. So sánh APTT mẫu có cao khô nhọ nồi với nhóm đối chứng (DMSO). Phân tích thống kê bằng ANOVA một chiều, p<0.05 được coi là có ý nghĩa. Kết quả cho thấy cao khô nhọ nồi缩短 APTT phụ thuộc nồng độ, chứng tỏ tác động lên cả con đường nội sinh. Điều này解释 cơ chế cầm máu toàn diện của dược liệu.

IV. Kết luận và ứng dụng của cao khô nhọ nồi trong y học

Nghiên cứu thành công xây dựng hệ thống chỉ tiêu chất lượng toàn diện cho cao khô nhọ nồi. Chỉ tiêu định tính bao gồm phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lớp mỏng với wedelolactone. Chỉ tiêu định lượng xác định hàm lượng wedelolactone bằng HPLC, đảm bảo không dưới 0.5% theo dược điển. Các chỉ tiêu lý hóa (độ ẩm, tro, tan trong nước) đạt tiêu chuẩn. Kiểm tra vi sinh vật đảm bảo an toàn. Về tác dụng dược lý, cao khô nhọ nồi缩短 cả PT và APTT trên mô hình in-vitro,证实 tác dụng cầm máu. Cơ chế liên quan đến hoạt hóa con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh. Kết quả提供 cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nhọ nồi trong điều trị xuất huyết, chảy máu cam, kinh nguyệt过多. Cao khô nhọ nồi có tiềm năng开发 thành sản phẩm thảo dược hỗ trợ cầm máu. Nghiên cứu cần tiếp tục trên mô hình in-vivo và thử nghiệm lâm sàng để验证 hiệu quả và an toàn.

4.2. Hướng phát triển và ứng dụng lâm sàng tương lai

Trên cơ sở kết quả đạt được, hướng phát triển tiếp theo包括 nhiều lĩnh vực. Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình chiết xuất để提高 hàm lượng hoạt chất. Thứ hai, nghiên cứu tác dụng cầm máu trên mô hình in-vivo (chuột, thỏ) với các nhóm đối chứng thích hợp. Thứ ba, đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn để đảm bảo an toàn. Thứ tư, thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân xuất huyết tiêu hóa, chảy máu cam, rong kinh. Thứ năm, development dạng bào chế phù hợp (viên nén, viên nang, cao lỏng). Thứ sáu, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm hoàn chỉnh.Ứng dụng tiềm năng还包括 phẫu thuật nhỏ, nha khoa và cấp cứu出血. Hợp tác quốc tế sẽ giúp验证 kết quả và拓展 thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, việc sử dụng các sản phẩm làm từ dược liệu của người dân càng gia tăng với xu hướng "Trở về thiên nhiên". Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80 % dân số hiện nay trên thế giới sử dụng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khoẻ ban đầu [66], [72]. Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) được biết đến như một loại dược liệu với nhiều công dụng quý. Trong dân gian nước sắc Cỏ nhọ nồi để chữa các bệnh chảy máu trong và ngoài, phối hợp với một số loại dược liệu khác như ngó sen, lá trắc bá, bách hợp,… để cầm máu.

Một bài thuốc cầm máu gồm Cỏ nhọ nồi và cóc kèn đã được nghiên cứu dược lý và áp dụng trên lâm sàng [1]. Bên cạnh đó, Cỏ nhọ nồi còn có mặt trong một số bài thuốc để điều trị sốt xuất huyết, viêm gan virus, sỏi tiết niệu [1]. Liên quan đến tác dụng cầm máu, đã có một số nghiên cứu in-vivo được thực hiện, tuy nhiên, ảnh hưởng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên các yếu tố đông máu chưa được đánh giá một cách đầy đủ. Hiện đã có tiêu chuẩn dược liệu Cỏ nhọ nồi trong dược điển Việt Nam, dược điển Trung Quốc và dược điển châu Âu.

Tuy nhiên, chưa có tiêu chuẩn cho cao khô Cỏ nhọ nồi, một sản phẩm trung gian để sản xuất các chế phẩm từ Cỏ nhọ nồi cũng như để phát triển các bài thuốc có thành phần Cỏ nhọ nồi với các dạng bào chế hiện đại. Để góp phần đảm bảo chất lượng các chế phẩm từ Cỏ nhọ nồi, đồng thời đánh giá được ảnh hưởng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên các yếu tố đông máu nhằm tìm hiểu sâu hơn về cơ chế cầm máu của Nhọ nồi, đề tài “ Xây dựng một số chỉ tiêu chất lƣợng và đánh giá ảnh hƣởng đến thời gian PT và APTT của quá trình đông máu in-vitro của cao khô Nhọ nồi” được thực hiện với hai mục tiêu sau đây: 1. Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô Cỏ nhọ nồi. Đánh giá sơ bộ tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian PT và APTT của quá trình đông máu in-vitro.

Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L. Vị trí phân loại Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là Cỏ mực, hạn liên thảo có tên khoa học là Eclipta prostrata L. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [53], vị trí phân loại của cây Cỏ nhọ nồi được tóm tắt như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Lớp: Ngọc Lan (Magnolipsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Eclipta 1. Đặc điểm thực vật Cây thảo, mọc đứng, đôi khi bò rồi vươn thẳng, cao 30 – 40 cm, có khi hơn.

Thân tròn, có lông cứng áp sát, màu lục hoặc đỏ tía. Mủ trong rồi đen khi ra ngoài không khí. Lá mọc đối, hình mác, dài 2 – 8 cm, rộng 0,5 – 1,5 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, mép khía răng rất nhỏ, hai mặt có lông nháp, cuống lá rất ngắn. Cây rất đa dạng.

Thân có thể thắt lại ở mấu và phình ra ở dóng. Lá có khi to bản, hình bầu dục hoặc hình trứng. Mùa hoa tháng 2 – 5. Cụm hoa mọc ở ngọn thân hoặc kẽ lá thành đầu, cuống dài 1 – 4 cm, có lông thô áp sát; đầu có đường kính 0,8 – 1,2 cm; lá bắc thuôn nhọn, có lông; hoa màu trắng, hoa cái ở ngoài, hình lưỡi, xếp thành một hàng, hoa lưỡng tính hình ống, mào lông giảm thành vảy nhỏ và ngắn, tràng hoa cái có lưỡi nguyên hoặc xẻ 2 răng, tràng hoa lưỡng tính có 4 thùy hình trái xoan nhị 4.

Quả bế, dài 3 mm, rộng 1,5 mm, có 3 cạnh, hơi dẹt, đầu bẹt, có 2 sừng nhỏ [1], [2]. Đặc điểm phân bố Chi Eclipta L. ở Việt Nam chỉ có một loài là Eclipta prostrata L.) Cỏ nhọ nồi (E.) ở nước ta rất phổ biến, phân bố rộng khắp các tỉnh vùng đồng bằng, trung du và miền núi, đến độ cao 1500 m (ở các tỉnh phía Nam), như: Yên Bái, Hà Giang (Vị Xuyên), Tuyên Quang, Lạng Sơn (Chi Lăng), Bắc Giang (Hiệp 2 Hoà), Hà Nội, Kon Tum (Đắk Glêi), Đắk Lắk (Đắk Nông), Bà Rịa-Vũng Tàu và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long [2]. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn với các cây Cỏ thấp, trên bãi sông, ruộng trồng hoa màu, ven đường đi, bãi hoang quanh làng bản…Ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt.

Bên cạnh đó với khả năng mọc chồi gốc và phân cành nhiều, cây dễ dàng phát triển, tạo thành đám bò lan trên mặt đất [1]. Ngoài ra, Cỏ nhọ nồi còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia [2]. Thành phần hóa học Đã có rất nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi, các nhóm chất được tìm thấy trong cây bao gồm: alcaloid, coumarin, saponin, tanin, chất đắng, tinh dầu, acid hữu cơ, thiophen, flavonoid, acid phenolic, triterpenoid, các sterol [15], [23], [63].  Coumarin  Các coumarin có trong cây Cỏ nhọ nồi chủ yếu thuộc dẫn chất của coumestan và là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong cây, bao gồm một số chất như wedelolacton (1), demethylwedelolacton (2), demethylwedelolacton-7-glucoside (3).

 Tinh dầu Tinh dầu trong Cỏ nhọ nồi có thể thu được từ lá và thân cây, các phân tích GC- MS cho thấy các chất có trong tinh dầu chủ yếu thuộc nhóm sesquiterpen, trong đó thành phần chính được tìm ra là α-humulen; 6,9-heptadecadien; (E)-β-farnesen; và α- phellandren [14], [40]. 3  Alcaloid  Nghiên cứu về các alcaloid có trong cây Cỏ nhọ nồi, đã xác định được hai chất đó là nicotin (0,078 %) và ecliptin [1].  Năm 1998, từ dịch chiết methaol, MS Abdel-Kader và cộng sự đã phân lập được 8 alcaloid có khung steroid, lần lượt là: (20S)(25S)-22,26-imino-cholesta-5,22(N)- dien-3β-ol (verazin) (4); (20R)-verazin (5); 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro- 4,5-dehydroverazin (6); ecliptalbin [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (7), (20R)-4β-hydroxyverazin (8); 4β-hydroxyverazin (9); (20R)-25β-hydroxyverazin (10) và 25β-hydroxyverazin (11) [10].  Gần đây đã xác định được thêm công thức của bốn alcaloid mới thuộc nhóm guanidin được đặt tên là eclitamin A, B, C, D (12 - 15) [52].

 Flavonoid  Các flavonoid được tìm thấy có trong cây chủ yếu thuộc 3 nhóm: flavon, isoflavon, flavonol. + Nhóm flavon: luteolin (16) [22], [25], [28], [29], [34], [76], luteolin-7-O-glucoside (17) [22], [29], apigenin (18) [22], [34], [76] , acacetin (19) [28], acacetin-7-O- rutinoside (20) [28], [76], diosmetin (21) [27]. + Nhóm isoflavon: pratensein (22) [19], [22], pratensein-7-O-β-D-glucopyranosid (23) [22], 7-O-methylorobol-4′-O-β-D-glucopyranosid (24) [19], 3′-O-methylorobol (25) [27], orobol (26) [54], orobosid (27) [20] + Nhóm flavonol: quercetin (28) [22], [28], [77], kaemferol (29) [28], kaemferid (30) [28]  Saponin Các saponin được tìm thấy trong cây thuộc nhóm saponin triterpenoid, phần lớn thuộc nhóm oleanan:  Năm 1994, Yahara và cộng sự đã xác định được cấu trúc của 6 saponin và đặt tên là eclalbasaponin từ I đến VI (31-36) [49]. Năm 2013, Han đã phân lập được echinocystic acid-28-O-β-D-glucopyranosid (37) [19].

Đến năm 2014, Feng-Min Xi đã tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của 8 chất (38-45) là: 3-O-(2-O-acetyl-β-D- glucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(β-D-glucopyranosyl) este; 3-O-(6-O-acetyl-β- Dglucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(β-D-glucopyranosyl) este; 3-O-(β-D- glucopyranosyl) oleanolic acid-28-O-(6-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl) este; [23] 4 3β,16β,29-trihydroxy oleanan-12-en-3-O-β-D-glucopyranosid, 3,28-di-O-β-D- glucopyranosyl-3β,16β-dihydroxy oleanan-12-en-28-oleanlic acid; Silphiosid B; Silphiosid E; 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl oleanlic-18-en acid-28-O-β-D-glucopyranosid [58].  Năm 1997, Yahara tiếp tục phân lập được các saponin thuộc phân nhóm taraxasteran, đặt tên là eclalbasaponin từ VII đến X (46-49) [60].  Phân nhóm lupan mới xác định được 1 chất là 28-O-β-D-glucopyranosyl betulinic acid 3β-O-β-D-glucopyranosid (50) [58]. Công thức các chất được phân lập từ Cỏ nhọ nồi được trình bày trong Phụ lục 2.

Công dụng và tác dụng dược lý 1. Công dụng Dựa theo kinh nghiệm dân gian, Cỏ nhọ nồi được sử dụng để chữa nhiều bệnh. Trong một nghiên cứu về việc sử dụng cây cỏ làm thuốc của người dân địa phương tại quần đảo Hải Nam, Trung Quốc cho thấy nước sắc Cỏ nhọ nồi có giá trị sử dụng cao, có thể sử dụng để điều trị các bệnh về gan, chống viêm, dùng để cầm máu, chữa rắn cắn [17]. Ở Ấn Độ, Cỏ nhọ nồi được dùng làm thuốc bổ và chữa ứ tắc trong các bệnh phì đại gan và lách, điều trị xổ mũi ở trẻ nhỏ [1].

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Cỏ nhọ nồi có trong thành phần thuốc mỡ để điều trị một số bệnh ngoài da [1], nước sắc Cỏ nhọ nồi có chứa các thành phần được xem là có tác dụng trong việc thúc đẩy quá trình melanogenesis, bảo vệ da dưới tác động của ánh sáng [69]. Tại Việt Nam, Trung Quốc, Cỏ nhọ nồi thường được dùng làm thuốc bổ máu, cầm máu bên trong và bên ngoài, chữa ho ra máu, lỵ ra máu, rong kinh, băng huyết, chảy máu cam, trĩ ra máu, nôn ra máu, đái ra máu, bị thương chảy máu. Còn dùng chữa bệnh ban sởi, ho hen viêm họng, bỏng, lao phổi, di tinh, mộng tinh, bệnh nấm da, làm thuốc mọc tóc và nhuộm tóc. Cỏ nhọ nồi có mặt trong một số bài thuốc điều trị viêm gan virus, sốt xuất huyết, sỏi tiết niệu [1].

Tác dụng dược lý  Tác dụng bảo vệ gan: Trên mô hình gây độc gan cấp ở chuột bằng các tác nhân như CCl4 [32], [62], [74], hay paracetamol [44], [45], [51] đều cho kết quả ở nhóm chuột thử (nhóm chuột được sử dụng Cỏ nhọ nồi trước khi gây độc gan) có sự giảm đáng kể về tỷ lệ tử vong, nồng độ các enzim aminotransferase (ASAT, ALAT), phosphatase kiềm, hình ảnh mô bệnh 5 học cho thấy tình trạng tổn thương hoại tử tế bào gan ít hơn so với nhóm chuột không dùng thuốc. Trên mô hình gây tăng lipid máu chuột bằng chế độ ăn giàu chất béo cho thấy so với nhóm chứng (không được sử dụng Cỏ nhọ nồi), nhóm chuột thử cho kết quả bảo vệ rõ rệt, thể hiện ở việc làm giảm lắng đọng mỡ ở gan, giảm sự giãn mạch máu trong gan, giảm hoại tử tế bào gan và kích thích tái tạo tế bào gan [36]. Cơ chế bảo vệ gan của Cỏ nhọ nồi vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các coumestan (wedelolacton và demethylwedelolacton) có thể là thành phần chính liên quan đến tác dụng này [57], [30], [64]. Tác dụng ức chế virus viêm gan C đã được báo cáo cho dịch chiết nước Cỏ nhọ nồi.

Phân tích các thành phần hóa học có trong dịch chiết cho thấy sự hiện diện của ba hợp chất có thể có tác dụng, đó là wedelolacton, luteolin và apigenin. Trên mô hình in- vitro, các hợp chất này thể hiện sự ức chế sao chép của virus thông qua ức chế enzym NS5B và tác dụng này là phụ thuộc liều [16][41].