Phương pháp xác định tạp chất trong chất chuẩn Cleistonkinensis A từ cây Chà Chôi

Khóa luận trình bày phương pháp xác định tạp chất của Cleistonkinensis A từ cây Chà Chôi bằng HPLC, nhằm thiết lập chất chuẩn và đánh giá độ tinh khiết.

• Tác giả: Bùi Bích Phương
• Người hướng dẫn: Nguyễn Lâm Hồng
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A được phân lập từ quả của cây Chà Chôi
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Cleistonkinensis A và cây Chà Chôi

Cleistonkinensis A là một hợp chất quan trọng được phân lập từ quả của cây Chà Chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Đây là một loài thực vật bản địa Việt Nam có giá trị dược liệu cao. Xác định tạp chất Cleistonkinensis A đòi hỏi các phương pháp phân tích chuyên biệt để đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của chất chuẩn. Quá trình nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Việc thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A là bước quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu dược phẩm và các sản phẩm liên quan.

1.1. Đặc điểm cây Chà Chôi Cleistanthus tonkinensis

Cây Chà Chôi là một loài thực vật có vị trí phân loại rõ ràng trong họ Euphorbiaceae. Tiêu bản cây được xác định qua các đặc điểm hình thái như lá, quả và cấu trúc sinh sản. Quả của cây Chà Chôi chứa các hợp chất hoạt tính, đặc biệt là Cleistonkinensis A - một alkaloid có tiềm năng ứng dụng trong y dược. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây này giúp khai thác tối đa giá trị dược liệu.

1.2. Ý nghĩa của việc xác định tạp chất

Xác định và định lượng tạp chất liên quan trong Cleistonkinensis A là yêu cầu cơ bản của các tiêu chuẩn quốc tế trong công nghiệp dược phẩm. Tạp chất có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và độ an toàn của chất chuẩn. Phương pháp xác định hợp lý giúp đánh giá độ tinh khiết sắc ký, từ đó đảm bảo chất lượng nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng.

II. Phương pháp phân tích HPLC DAD cho xác định tạp chất

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với detector mảng diode (DAD) là phương pháp tối ưu để xác định tạp chất Cleistonkinensis A trong nguyên liệu. Phương pháp này cho phép phân tách và định lượng chính xác các hợp chất có độ phân giải cao. Quá trình khảo sát điều kiện sắc ký bao gồm lựa chọn pha động, pH, nhiệt độ cột và bước sóng phù hợp. Độ tinh khiết sắc ký được xác định bằng cách phân tích dung dịch Cleistonkinensis A 1000 ppm dưới điều kiện chiếu tia UV. Các tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) và Angiosperm Phylogeny Group (APG) được áp dụng trong việc xác thực phương pháp này.

2.1. Nguyên lý hoạt động của HPLC DAD

HPLC/DAD hoạt động dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất dựa vào sự khác biệt về tính chất hóa học và vật lý. Detector DAD có khả năng phát hiện và ghi lại phổ hấp thụ UV-VIS tại mỗi điểm trong sắc ký đồ. Điều này cho phép nhận dạng chính xác các tạp chất liên quan và xác định độ tinh khiết của Cleistonkinensis A một cách đáng tin cậy.

2.2. Quy trình khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát điều kiện sắc ký bao gồm: lựa chọn chương trình gradient thích hợp, xác định bước sóng phù hợp, lựa chọn cột sắc ký và pha động. Các chương trình gradient khác nhau được thử nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu cho phân tách Cleistonkinensis A và các tạp chất liên quan. Kết quả khảo sát giúp thiết lập phương pháp ổn định và lặp lại được.

III. Thẩm định phương pháp xác định tạp chất

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đảm bảo tính tin cậy và hiệu lực của phương pháp xác định tạp chất Cleistonkinensis A. Quá trình này bao gồm các bài kiểm tra như: độ phù hợp hệ thống, độ lặp lại, độ tuyến tính, độ ổn định và độ thu hồi. Các tiêu chuẩn được thiết lập dựa trên hướng dẫn của International Conference on Harmonisation (ICH) và các cơ quan quốc tế như WHO. Limit of Detection (LOD) và Limit of Quantitation (LOQ) được xác định để đảm bảo khả năng phát hiện các tạp chất ở nồng độ thấp. Tỷ lệ Relative Standard Deviation (RSD) được kiểm tra tại các nồng độ khác nhau theo AOAC.

3.1. Các tiêu chí thẩm định chính

Phương pháp xác định tạp chất phải đáp ứng các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống (N ≥ 2000, RS ≥ 1.5, T = 0.8-1.2), độ lặp lại tối đa chấp nhận, độ tuyến tính từ 50-150% nồng độ công bố. Các bài kiểm tra này được thực hiện với Cleistonkinensis A ở các nồng độ khác nhau để đảm bảo phương pháp hoạt động chính xác.

3.2. Đánh giá độ ổn định và độ thu hồi

Độ ổn định của dung dịch Cleistonkinensis A được đánh giá qua các thời điểm khác nhau (0, 4, 8, 24 giờ). Tỷ lệ thu hồi được xác định ở các nồng độ 80%, 100% và 120%, theo yêu cầu AOAC. Kết quả thu hồi chấp nhận nằm trong khoảng 95-105%. Những số liệu này xác nhận phương pháp đáng tin cậy cho xác định tạp chất liên quan.

IV. Ứng dụng và ý nghĩa của chất chuẩn Cleistonkinensis A

Chất chuẩn Cleistonkinensis A được thiết lập từ quả cây Chà Chôi đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát chất lượng dược phẩm. Chất chuẩn này được sử dụng để phát triển các phương pháp phân tích mới và xác thực các phương pháp hiện có trong các quy trình sản xuất dược phẩm. Độ tinh khiết sắc ký của chất chuẩn là tiêu chí quan trọng đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích. Ứng dụng phương pháp HPLC/DAD giúp xác định nhanh chóng hàm lượng tạp chất liên quan trong các mẫu nguyên liệu. Việc thiết lập và phê duyệt chất chuẩn Cleistonkinensis A theo tiêu chuẩn quốc tế mở ra cơ hội ứng dụng trong nghiên cứu về các tính chất dược lý và độc tính. Kết quả nghiên cứu này góp phần nâng cao chất lượng nguyên liệu dược phẩm tại Việt Nam.

4.1. Tiêu chuẩn quốc tế và quy định áp dụng

Phương pháp xác định tạp chất Cleistonkinensis A tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế như ICH, WHO, AOAC, NIST và USPRS. Độ tinh khiết được yêu cầu tối thiểu 98% để chất chuẩn được công nhận. Các hướng dẫn từ ASEAN Reference Standards (ARS) cũng được tham khảo. Tuân thủ các tiêu chuẩn này đảm bảo chất chuẩn có thể được sử dụng trong các phòng thí nghiệm quốc tế.

4.2. Triển vọng phát triển và nghiên cứu tiếp theo

Chất chuẩn Cleistonkinensis A mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới về hoạt tính dược lý, độc tính và cơ chế tác dụng. Phương pháp này có thể được áp dụng để xác định tạp chất trong các sản phẩm phytopharmaceutical từ cây Chà Chôi. Tiếp tục phát triển các phương pháp phân tích đơn giản, nhanh chóng sẽ hỗ trợ công nghiệp dược phẩm Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [22]. Nhiều liệu trình điều trị đã đƣợc áp dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn. tuy nhiên kết quả thu đƣợc vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều đó càng thúc đẩy các nhà khoa học tìm tòi nghiên cứu ra các phƣơng pháp, các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này.

Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, một hƣớng nghiên cứu đang rất đƣợc quan tâm đó là phát triển các thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô KB. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) và cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indochinensis) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tƣơng đƣơng với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [4].

Bên cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập đƣợc từ quả của cây Chà chôi có cấu trúc hóa học gần nhƣ tƣơng tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả đang nghiên cứu chế tạo cao định chuẩn phân đoạn giàu cleistantoxin và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ. Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao định chuẩn đang đƣợc nghiên cứu điều trị ung thƣ, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các chất có mặt trong cao, trong đó chất chuẩn cleistonkinensis A đƣợc sử dụng làm dung dịch phân giải khi định lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong 1 nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A được phân lập từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis)” với mục tiêu: - Xây dựn và thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD.

Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Vị trí phân loại Theo APG III [18], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) đƣợc phân loại nhƣ sau: Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 1. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trƣớc đây chia thành 5 phân họ bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae.

Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân họ sau là hai lá mầm[19]. Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [5]. Đặc điểm thực vật Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không mở và anthos: hoa kết hợp thành) đƣợc dịch sang Tiếng Việt là cách hoa hoặc cọc rào. Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên.

Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi.

Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng - 3 góc [19]. 3 Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia. Ở nƣớc ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc [2].

Tình hình nghiên cứu chi Cleistanthus  Trên thế giới Yixi Liu và các cộng sự thuộc trung tâm công nghệ Virginia, Mỹ đã nghiên cứu các hợp chất có tác dụng chống tăng sinh tế bào trong dịch chiết Ethanol của lá Cleistanthus boivinianus đƣợc thu hái từ khu vực rừng khô Madagascar. Trong đó các hợp chất 3α - O - (β - D - glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin; (±) - β - apopicropodophyllin và (-) - desoxypodophyllotoxin cho thấy có tác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thƣ buồng trứng A2780 mạnh, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 33,0 ± 3,6; 63,1 ± 6,7 và 230 ± 1 nM [24]. Một nghiên cứu khác trên loài Cleistanthus collius đã đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học Ấn Độ. Phân tích phytochemical đã đƣợc thực hiện để chứng minh sự có mặt của các thành phần nhƣ terpenoids, đƣờng, steroid, flavonoid,.

Kết quả phân tích GC-MS dịch chiết aceton cho thấy sự có mặt của hợp chất mới dioctyl phthalat (cleistanthin A và cleistanthin B), chƣa đƣợc phân lập trƣớc đó. Dioctyl phthalat thể hiện khả năng liên kết với thụ thể p53 (còn đƣợc gọi là protein 53 hoặc protein khối u 53), là một loại protein ức chế khối u ở ngƣời đƣợc mã hóa bởi gen TP53 [16]. Trong đó, cleistanthin B đã đƣợc chứng minh có tác dụng chống ung thƣ trên dòng tế bào biểu mô và bạch huyết trên cơ thê chuột bạch Thụy Sĩ [20]. Các nghiên cứu trên chi Cleistanthus đã mở ra hƣớng nghiên cứu và phát triển dịch chiết thành cao định chuẩn làm thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc tự nhiên.

 Ở Việt Nam Một số cây thuộc chi cleistanthus: C.eberhardtii là các loài đặc thù ở Việt Nam. Các hợp chất đƣợc phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể đƣợc phân loại nhƣ sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác. Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indokinensis) và xác định đƣợc cấu trúc 4 của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới là: cleistantoxin, demethoxycleistantoxin, podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid C, cleindosid D, cleindosid E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là axit gallic và amentoflavon. Trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM.

Vì thế, dịch chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang đƣợc nghiên cứu, phát triển thành cao định chuẩn chứa hàm lƣợng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều trị ung thƣ trong pha tiền lâm sàng [4]. Loài Cleistanthus tonkinensis Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis Quả xanh Quả chín Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis 1.

Đặc điểm thực vật Loài Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen. Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, 5 gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.

Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh [2]. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Từ các kết quả nghiên cứu trên cây Cách hoa đông dƣơng (C.indokinensis) các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên cây Chà Chôi (C. Kết quả cho thấy dịch chiết ethyl acetat của quả cây Chà chôi Cleistanthus tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB lên tới 88,40 - 95,17%. Từ cao cồn khô chiết từ quả cây Chà Chôi các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam đã phân lập đƣợc các hợp chất: cleistantoxin, cleisindosid D, cleisindosid A, cleistonkinensis A,.

Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A Cleistonkinensis A là một hợp chất toàn toàn mới, trên thế giới có một số nghiên cứu về các cây thuộc chi Cleistanthus, nhƣng chƣa có nghiên cứu nào công bố về hoạt chất cleistonkinensis A. Sau đây là một số thông tin về hợp chất cleistonkinensis A: Danh pháp IUPAC: (8aR, 9R) - 5(benzo[d][1,3]dioxol - 5 - yl) - 9 - hydroxyl - 10 methoxy - 8a,9 - dihydrofuro[3’,4’:6,7]naphtho[2,3 - d][1,3]dioxol - 6(8H) - one. Công thức phân tử: C21H16O8 Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN, kém tan trong MeOH.

pKa dự kiến bằng phần mềm ChemBioDraw: 12,934. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn 1. Khái quát về chất chuẩn  Khái niệm: Theo Dƣợc điển Việt Nam V [1], chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với 6 các tính chất của chất cần thử.

Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.  Phân loại chất chuẩn: [23] - Chuẩn gốc: Chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất lƣợng đo lƣờng cao nhất và giá trị của nó đƣợc chấp nhận mà không quy chiếu về các chất chuẩn khác của cùng đại lƣợng, trong tình huống cụ thể. Một số chất chuẩn đƣợc coi là chuẩn gốc nhƣ chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn Dƣợc điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dƣợc điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập. Ngoài ra, đối với các hoạt chất mới, chất chuẩn gốc theo TCCS của nhà phát minh cũng đƣợc xếp vào nhóm này.