ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế Thể giới (WHO), ung thƣ là nguyên nhân dẫn đến tử vong đứng thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu ngƣời chết trong năm 2015 [22]. Nhiều liệu trình điều trị đã đƣợc áp dụng nhƣ: hóa trị, xạ trị, can thiệp xâm lấn. tuy nhiên kết quả thu đƣợc vẫn chƣa nhƣ mong đợi. Điều đó càng thúc đẩy các nhà khoa học tìm tòi nghiên cứu ra các phƣơng pháp, các loại thuốc mới để chống lại căn bệnh này.
Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, một hƣớng nghiên cứu đang rất đƣợc quan tâm đó là phát triển các thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc từ dƣợc liệu. Năm 2009, dự án "Phòng thí nghiệm hợp tác Pháp - Việt, nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam" đã đƣợc khởi động, dịch chiết ethyl acetat của hơn 2500 loài thực vật ở Việt Nam đã đƣợc đem thử sàng lọc hoạt tính kháng tế bào ung thƣ trên dòng ung thƣ biểu mô KB. Một trong những kết quả nổi bật nhất đó là dịch chiết từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) và cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indochinensis) đã cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB đạt từ 88,40 - 95,17%. Từ dịch chiết này, nhóm nghiên cứu đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc đƣợc 9 hợp chất tinh khiết nhóm aryltetralin lignan, trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM (tƣơng đƣơng với khoảng 0,006 - 0,014 μg/ml) [4].
Bên cạnh đó, các hợp chất glycosid của cleistantoxin phân lập đƣợc từ quả của cây Chà chôi có cấu trúc hóa học gần nhƣ tƣơng tự etoposid và teniposid là hai dẫn chất của podophyllotoxin đang đƣợc sử dụng làm thuốc điều trị ung thƣ phổi. Dựa trên các kết quả này, nhóm tác giả đang nghiên cứu chế tạo cao định chuẩn phân đoạn giàu cleistantoxin và các aryltetralin lignan đƣợc chiết xuất từ quả của cây Chà chôi để phát triển thành nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thƣ. Nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao định chuẩn đang đƣợc nghiên cứu điều trị ung thƣ, các chất chuẩn rất cần đƣợc thiết lập để tiến hành định tính và định lƣợng các chất có mặt trong cao, trong đó chất chuẩn cleistonkinensis A đƣợc sử dụng làm dung dịch phân giải khi định lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistantoxin trong nguyên liệu thiết lập chất chuẩn. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan trong 1 nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Cleistonkinensis A được phân lập từ quả của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis)” với mục tiêu: - Xây dựn và thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tạp chất liên quan và độ tinh khiết sắc ký của cleistonkinensis A bằng HPLC/DAD.
Tổng quan về thực vật của cây Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl. Vị trí phân loại Theo APG III [18], họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) đƣợc phân loại nhƣ sau: Thực vật có hoa (Angiosperms) Thực vật hai lá mầm thật sự (Eudicots) Nhánh Hoa hồng (Rosids) Bộ Sơ-ri (Malpighiales) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 1. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại Kích là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Trƣớc đây chia thành 5 phân họ bao gồm Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae.
Ba phân họ đầu tiên là các phân họ một lá mầm trong khi hai phân họ sau là hai lá mầm[19]. Phần lớn là thân cây thảo, ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới [5]. Đặc điểm thực vật Cleistanthus (do chữ Latin cleisto, bắt nguồn từ chữ Hy Lạp kleistos: đóng, không mở và anthos: hoa kết hợp thành) đƣợc dịch sang Tiếng Việt là cách hoa hoặc cọc rào. Là cây gỗ nhỏ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên.
Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thƣờng ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thƣờng là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thƣờng nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi.
Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lƣng; hạt hình trứng - 3 góc [19]. 3 Chi Cleistanthus gồm khoảng 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia. Ở nƣớc ta, theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi Cleistanthus có 14 loài, phân bố khắp cả nƣớc, từ Hà Giang tới Phú Quốc [2].
Tình hình nghiên cứu chi Cleistanthus Trên thế giới Yixi Liu và các cộng sự thuộc trung tâm công nghệ Virginia, Mỹ đã nghiên cứu các hợp chất có tác dụng chống tăng sinh tế bào trong dịch chiết Ethanol của lá Cleistanthus boivinianus đƣợc thu hái từ khu vực rừng khô Madagascar. Trong đó các hợp chất 3α - O - (β - D - glucopyranosyl) desoxypodophyllotoxin; (±) - β - apopicropodophyllin và (-) - desoxypodophyllotoxin cho thấy có tác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thƣ buồng trứng A2780 mạnh, với giá trị IC50 tƣơng ứng là 33,0 ± 3,6; 63,1 ± 6,7 và 230 ± 1 nM [24]. Một nghiên cứu khác trên loài Cleistanthus collius đã đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học Ấn Độ. Phân tích phytochemical đã đƣợc thực hiện để chứng minh sự có mặt của các thành phần nhƣ terpenoids, đƣờng, steroid, flavonoid,.
Kết quả phân tích GC-MS dịch chiết aceton cho thấy sự có mặt của hợp chất mới dioctyl phthalat (cleistanthin A và cleistanthin B), chƣa đƣợc phân lập trƣớc đó. Dioctyl phthalat thể hiện khả năng liên kết với thụ thể p53 (còn đƣợc gọi là protein 53 hoặc protein khối u 53), là một loại protein ức chế khối u ở ngƣời đƣợc mã hóa bởi gen TP53 [16]. Trong đó, cleistanthin B đã đƣợc chứng minh có tác dụng chống ung thƣ trên dòng tế bào biểu mô và bạch huyết trên cơ thê chuột bạch Thụy Sĩ [20]. Các nghiên cứu trên chi Cleistanthus đã mở ra hƣớng nghiên cứu và phát triển dịch chiết thành cao định chuẩn làm thuốc điều trị ung thƣ có nguồn gốc tự nhiên.
Ở Việt Nam Một số cây thuộc chi cleistanthus: C.eberhardtii là các loài đặc thù ở Việt Nam. Các hợp chất đƣợc phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể đƣợc phân loại nhƣ sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác. Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và cộng sự đã tiến hành phân lập dịch chiết quả của cây Cách Hoa Đông Dƣơng (Cleistanthus indokinensis) và xác định đƣợc cấu trúc 4 của 11 hợp chất, trong đó có 9 hợp chất mới là: cleistantoxin, demethoxycleistantoxin, podocleistantoxin, cleindosid A, cleindosid B, cleindosid C, cleindosid D, cleindosid E, cleindosid F, và hai hợp chất đã biết là axit gallic và amentoflavon. Trong đó cleistantoxin có hoạt tính ức chế mạnh nhất trên các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, MCF7, MCF7R, HT29) với giá trị IC50 trong khoảng 14 - 36 nM.
Vì thế, dịch chiết từ quả cây thuộc chi cleistanthus đang đƣợc nghiên cứu, phát triển thành cao định chuẩn chứa hàm lƣợng cleistantoxin trên 50% làm nguyên liệu thuốc điều trị ung thƣ trong pha tiền lâm sàng [4]. Loài Cleistanthus tonkinensis Hình 1. 1: Tiêu bản cây Cleistanthus tonkinensis Quả xanh Quả chín Hình 1. 2: Quả của cây Cleistanthus tonkinensis 1.
Đặc điểm thực vật Loài Cleistanthus tonkinensis có tên Tiếng Việt là Chà chôi, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), đƣợc miêu tả nhƣ sau: Cây gỗ nhỏ cao 1 - 3 m; nhánh láng, đen. Phiến lá tròn dài, to 7 - 13 x 2 - 5 cm, chót có mũi nhọn, đáy tròn, mỏng, cứng, láng, 5 gân phụ 7 - 8 cặp; cuống 1 cm, lá bẹ 2 - 3 mm. Chùm hoa cao 1 - 1,5 cm; hoa nhỏ, không cọng; cánh hoa 5, to 1 mm, tiểu nhụy 5, nhụy cái lép; hoa cái không cọng, cánh hoa 2 mm, đĩa mật quanh noãn sào có ít lông. Nang (quả) xoan, cao 1,3 cm, nở làm 3 mảnh; hột hoe, cao 7 mm.
Cây phân bố ở khu vực rừng trên đá vôi từ Cao Bằng, Lạng Sơn đến Nghệ An, Hà Tĩnh [2]. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Từ các kết quả nghiên cứu trên cây Cách hoa đông dƣơng (C.indokinensis) các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên cây Chà Chôi (C. Kết quả cho thấy dịch chiết ethyl acetat của quả cây Chà chôi Cleistanthus tonkinensis thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thƣ, cụ thể, nó cho phần trăm ức chế dòng tế bào ung thƣ biểu mô KB lên tới 88,40 - 95,17%. Từ cao cồn khô chiết từ quả cây Chà Chôi các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam đã phân lập đƣợc các hợp chất: cleistantoxin, cleisindosid D, cleisindosid A, cleistonkinensis A,.
Sơ lƣợc về hợp chất cleistonkinensis A Cleistonkinensis A là một hợp chất toàn toàn mới, trên thế giới có một số nghiên cứu về các cây thuộc chi Cleistanthus, nhƣng chƣa có nghiên cứu nào công bố về hoạt chất cleistonkinensis A. Sau đây là một số thông tin về hợp chất cleistonkinensis A: Danh pháp IUPAC: (8aR, 9R) - 5(benzo[d][1,3]dioxol - 5 - yl) - 9 - hydroxyl - 10 methoxy - 8a,9 - dihydrofuro[3’,4’:6,7]naphtho[2,3 - d][1,3]dioxol - 6(8H) - one. Công thức phân tử: C21H16O8 Tính chất: Tinh thể rắn, màu trắng. Tan tốt trong dicloromethan, aceton và ACN, kém tan trong MeOH.
pKa dự kiến bằng phần mềm ChemBioDraw: 12,934. Chất chuẩn và quy trình thiết lập chất chuẩn 1. Khái quát về chất chuẩn Khái niệm: Theo Dƣợc điển Việt Nam V [1], chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã đƣợc xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã đƣợc quy định về hóa học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu đƣợc so sánh với 6 các tính chất của chất cần thử.
Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Phân loại chất chuẩn: [23] - Chuẩn gốc: Chất chuẩn đƣợc xác định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất lƣợng đo lƣờng cao nhất và giá trị của nó đƣợc chấp nhận mà không quy chiếu về các chất chuẩn khác của cùng đại lƣợng, trong tình huống cụ thể. Một số chất chuẩn đƣợc coi là chuẩn gốc nhƣ chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn Dƣợc điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dƣợc điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn do Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập. Ngoài ra, đối với các hoạt chất mới, chất chuẩn gốc theo TCCS của nhà phát minh cũng đƣợc xếp vào nhóm này.