Khóa luận: Xây dựng phương pháp xác định Fumonisin B1,2,3 bằng LC-MS/MS

Khóa luận trình bày phương pháp xác định Fumonisin B1, B2, B3 trong thức ăn chăn nuôi, thủy sản bằng kỹ thuật LC-MS/MS, kèm quy trình và kết quả.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Thùy Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thị Ngọc Lan
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp xác định Fumonisin B1,2,3 trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Fumonisin Và Tầm Quan Trọng Của Xác Định

Fumonisin là một độc tố sinh học được sản sinh bởi các loài nấm mốc Fusarium, đặc biệt là Fusarium verticillioides và Fusarium proliferatum. Những độc tố này thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp như ngô, lúa mì và các loại hạt khác. Xác định Fumonisin B1, B2, B3 là một nhiệm vụ quan trọng trong kiểm soát chất lượng thực phẩm vì những độc tố này có khả năng gây ra các bệnh nguy hiểm cho động vật và con người. Theo quy định của FDA và EU, hàm lượng fumonisin trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản cần được giám sát nghiêm ngặt. Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng - Khối phổ khối phổ) đã trở thành công cụ tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện và định lượng các chất ô nhiễm này với độ chính xác cao.

1.1. Định Nghĩa Và Nguồn Gốc Fumonisin

Fumonisin là một nhóm độc tố mycotoxin được sản sinh bởi các loài nấm Fusarium trong điều kiện ẩm ướt và nhiệt độ thích hợp. Chúng xuất hiện tự nhiên trong thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản và sản phẩm nông sản. Fumonisin B1 (FB1), Fumonisin B2 (FB2), và Fumonisin B3 (FB3) là ba dạng chính gây hại nhất. Các độc tố này có cấu trúc hóa học độc đáo chứa một xương sống amino hóa amonium và các nhóm hóa học phức tạp, cho phép chúng tương tác với các thành phần sinh học.

1.2. Tác Hại Của Fumonisin Đối Với Động Vật Và Con Người

Fumonisin gây ra các bệnh lâm sàng nghiêm trọng như fumonisosis ở ngựa (equine leukoencephalomalacia) và độc tính gan thận ở lợn. Ở con người, fumonisin được cho là có liên quan đến ung thư thực quản và các rối loạn thần kinh. Do đó, xác định chính xác hàm lượng fumonisin trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản là cần thiết để bảo vệ sức khỏe động vật và con người, đồng thời tuân thủ các quy định quốc tế về an toàn thực phẩm.

II. Phương Pháp LC MS MS Nguyên Tắc Và Ứng Dụng

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng - Khối phổ khối phổ) là một công nghệ phân tích hiện đại cho phép xác định đồng thời Fumonisin B1, B2, B3 với độ nhạy và độ chọn lọc cao. Phương pháp này kết hợp hai kỹ thuật mạnh mẽ: sắc ký lỏng tách chiết các hợp chất dựa trên tính chất hóa học, và khối phổ ion kép xác nhận và định lượng các phân tử mục tiêu. LC-MS/MS vượt trội hơn các phương pháp truyền thống như miễn dịch hoặc sắc ký mỏng lớp vì nó cho phép phát hiện đa chất trong một lần phân tích. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong các viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia để kiểm soát hàm lượng fumonisin trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản theo các tiêu chuẩn AOAC và EU.

2.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Sắc Ký Lỏng LC

Sắc ký lỏng tách chiết các Fumonisin B1, B2, B3 dựa trên sự khác biệt về tính chất ưa nước và ưa dầu của chúng. Mẫu được bơm qua một cột chứa chất hấp phụ, và các compound khác nhau sẽ lưu giữ các thời gian khác nhau (retention time). Pha động thường bao gồm acetonitril (ACN) và nước có chứa acid hoặc base để tối ưu hóa sự phân tách và độ phân giải.

2.2. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Khối Phổ Khối Phổ MS MS

Sau khi tách chiết bằng LC, các phân tử Fumonisin được ion hóa (thường bằng ESI - Electrospray Ionization) tạo thành các ion mẹ. Những ion mẹ này được đưa vào Q1, sau đó qua Q2 (collision cell) để tách mảnh, tạo thành các ion con đặc trưng. MS/MS giám sát các ion chuyển đổi (m/z) này, cho phép định lượng và xác nhận cấu trúc với độ chính xác cao.

III. Quy Trình Xác Định Fumonisin B1 B2 B3 Bằng LC MS MS

Quy trình xác định Fumonisin bằng LC-MS/MS bao gồm nhiều bước quan trọng từ chuẩn bị mẫu đến phân tích. Đầu tiên, mẫu thức ăn chăn nuôi hoặc thức ăn thủy sản được xử lý bằng cách trích chiết bằng dung dịch chiết (thường là acetonitril/nước) và làm sạch qua các cột quản lý pha rắn (SPE) hoặc màng lọc để loại bỏ các tạp chất. Dung dịch mẫu sau đó được bơm vào thiết bị LC-MS/MS, nơi các Fumonisin B1, B2, B3 được tách chiết, ion hóa và phát hiện. Phương pháp này đạt độ nhạy cao với giới hạn định lượng thấp (thường dưới 50 μg/kg), cho phép xác định chính xác các fumonisin ở nồng độ vết dù rất thấp. Việc sử dụng dung dịch chuẩn bên ngoài và xây dựng đường chuẩn tuyến tính giúp định lượng với độ chính xác ±15-20%.

3.1. Bước Xử Lý Và Chiết Xuất Mẫu

Mẫu thức ăn được nghiền nhỏ và cân chính xác, sau đó thêm dung dịch chiết (ACN 70% hoặc đệm acid). Hỗn hợp được lắc hoặc siêu âm để tối ưu hóa chiết xuất Fumonisin B1, B2, B3. Dịch chiết sau đó được lọc qua giấy lọc hoặc màng PTFE, rồi tinh sạch qua SPE (Solid Phase Extraction) để loại bỏ các tạp chất có thể gây nhiễu phân tích.

3.2. Phân Tích LC MS MS Và Xác Nhận Kết Quả

Dung dịch mẫu được tiêm vào hệ thống LC-MS/MS với điều kiện sắc ký được tối ưu hóa (cột C18, pha động gradient, tốc độ dòng 0.3 mL/phút). Các Fumonisin B1, B2, B3 được phát hiện bằng cách giám sát các ion chuyển đổi đặc trưng (MRM - Multiple Reaction Monitoring). Kết quả được so sánh với đường chuẩn để định lượng hàm lượng, với yêu cầu độ thu hồi 70-120% và độ lặp lại RSD < 15%.

IV. Thẩm Định Phương Pháp Và Ứng Dụng Thực Tiễn

Thẩm định phương pháp LC-MS/MS để xác định Fumonisin B1, B2, B3 theo AOAC 2016 và hướng dẫn của Hội đồng Châu Âu là bước thiết yếu đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy. Phương pháp được thẩm định bao gồm các tiêu chí như tính chọn lọc (selectivity), giới hạn phát hiện (LOD) thường từ 20-30 μg/kg, giới hạn định lượng (LOQ) từ 50-100 μg/kg, khoảng tuyến tính từ LOQ đến 2000 μg/kg, và độ chính xác với độ thu hồi 80-110%. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp này rất quan trọng đối với các viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia trong kiểm soát chất lượng thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản. Phương pháp được sử dụng để screen các mẫu thuyễn nghi, giám sát các trang trại và nhà sản xuất, đồng thời đảm bảo tuân thủ các quy định của FDA (giới hạn 2.5-4 ppm) và EU (giới hạn 0.2-1.2 ppm).

4.1. Các Chỉ Tiêu Thẩm Định Chính

Tính chọn lọc (Selectivity) kiểm tra khả năng phân biệt Fumonisin khỏi các compound khác. Tính phù hợp hệ thống đảm bảo độ phân giải đỉnh chuẩn ≥ 2.0. Độ lặp lại (Repeatability) với RSD ≤ 15% cho thấy độ ổn định của phương pháp. Độ đúng (Accuracy) thể hiện qua độ thu hồi 80-120% ở các nồng độ khác nhau, xác nhận phương pháp không bị thiên lệch.

4.2. Ứng Dụng Trong Kiểm Soát Chất Lượng Thức Ăn

Phương pháp LC-MS/MS xác định Fumonisin được áp dụng rộng rãi tại các viện kiểm nghiệm để kiểm soát thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản. Nó giúp phát hiện sớm các mẫu nhiễm fumonisin, cảnh báo rủi ro sức khỏe động vật, và đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn quốc tế, bảo vệ chuỗi cung ứng thực phẩm khỏi nguy hiểm sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, thủy sản là một trong những vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu, đặc biệt trong bối cảnh ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản ngày càng phát triển mạnh mẽ. Sự hiện diện của các độc tố vi nấm trong nguyên liệu sản xuất thức ăn và sản phẩm tiêu dùng không chỉ gây thiệt hại về kinh tế mà còn tiềm ẩn nguy cơ đe dọa đến sức khỏe vật nuôi và gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe con người thông qua chuỗi thực phẩm. Trong số đó fumonisin là một trong các độc tố vi nấm được quan tâm nhiều nhất hiện nay, đặc biệt là fumonisin B1 (FB1), B2 (FB2) và B3 (FB3), thường gặp trong các loại ngũ cốc như ngô, nguyên liệu phổ biến trong sản xuất thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản. Fumonisin là độc tố thứ cấp do nấm Fusarium spp.

sản sinh, có khả năng gây nhiều tác động xấu đến sức khỏe như rối loạn chuyển hóa lipid, gây bệnh não mềm ở ngựa, bệnh phù phổi cấp ở heo và nghi ngờ là chất gây ung thư ở người. Các nghiên cứu cho thấy fumonisin có thể tồn dư và tích lũy trong cơ thể vật nuôi, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi, từ đó ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng. Tại Việt Nam, việc kiểm soát dư lượng fumonisin trong nguyên liệu và sản phẩm thức ăn chăn nuôi, thủy sản vẫn còn hạn chế. Các quy định, tiêu chuẩn hiện hành về hàm lượng cho phép còn chưa đầy đủ và đồng bộ, trong khi các phương pháp phân tích và giám sát vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi.

Đặc biệt, chưa có phương pháp phân tích đa độc tố fumonisin (FB1, FB2, FB3) có độ nhạy và độ chính xác cao được áp dụng phổ biến trong nước. Trong bối cảnh hội nhập và xuất khẩu sản phẩm chăn nuôi ra thị trường quốc tế, yêu cầu về kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố vi nấm trong chuỗi sản xuất đang trở thành một tiêu chuẩn bắt buộc. Do đó, đề tài “Xây dựng phương pháp xác định Fumonisin B1, 2, 3 trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản bằng LC-MS/MS” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời FB1, FB2, FB3 trong mẫu thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản bằng sắc ký lỏng khối phổ song song (LC-MS/MS).

Ứng dụng phương pháp nhằm đánh giá mức độ ô nhiễm Fumonisin trong các mẫu thực tế. Tổng quan về fumonisin 1. Giới thiệu chung Độc tố vi nấm (mycotoxin) là các hợp chất có độc tính được sinh ra trong tự nhiên bởi một số chủng vi nấm có khả năng sinh độc tố. Phần lớn các nấm mốc có khả năng sinh độc tố thuộc 3 chi Aspergillus, Penicillium, và Fusarium.

Các nấm thuộc chi Aspergillus, Penicillium thường có tính chất hoại sinh và tấn công, gây hại cho thực phẩm trong quá trình bảo quản, tuy vậy một số chủng Aspergilli cũng có thể phát triển trong quá trình canh tác nông sản. Chi Fusarium bao gồm các loài cây gây hại cho cây trồng, đồng thời có thể gây hoại sinh cho thực phẩm. Fumonisins là một nhóm các mycotoxins cấu trúc tương tự nhau, chủ yếu được tạo ra bởi hai loại nấm chính là Fusarium verticillioides và Fusarium proliferatum. Tuy nhiên một số loài có họ hàng gần khác như F.

nygamai, Aspergillus welwitschiae cũng có khả năng sản sản sinh ra fumonisin với mức độ thấp hơn. Khả năng tạo fumonisin cũng đã được ghi nhận ở loài Aspergillus niger ở đậu phộng, ngô và nho [1]. Loại độc tố vi nấm này được phân bố rộng rãi trên toàn cầu với 4 nhóm chính: A, B, C và P. Kể từ năm 1988 đã có 28 đồng phân của FB đã được xác định, trong số này, nhóm fumonisin B (FB) được xem là phổ biến nhất và có độc tính cao nhất với các dạng chính gồm fumonisin B₁ (FB₁), fumonisin B₂ (FB₂) và fumonisin B₃ (FB₃), chúng là các chất gây ô nhiễm thực phẩm phổ biến nhất trong các nhóm fumonisin.

Đặc biệt, FB₁ được báo cáo là chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng lượng fumonisin B, với mức độ phân bố vượt quá 70% và thường tồn tại đồng thời với FB2 và FB3 [2], [3]. Nguồn gốc và sự hình thành Fumonisins Fumonisins là những chất chuyển hóa thứ cấp do một số loài nấm gây bệnh trên ngũ cốc sản sinh ra, chủ yếu thuộc chi Fusarium (họ Nectriaceae), là nấm hoại sinh phân bố rộng rãi trong đất và thực vật trên toàn thế giới. Chúng có khả năng xâm nhập vào vùng rễ (rhizosphere) của cây và sau đó xâm nhập vào hệ thống bên trong của cây, từ đó ảnh hưởng đến cả phần thân trên lẫn rễ dưới của thực vật. Fumonisin hình thành chủ yếu trước thu hoạch, một số trường hợp cũng xuất hiện sau thu hoạch.

Trong số các loại ngũ cốc, ngô là đối tượng phổ biến nhất bị nhiễm loại độc tố này. Tổn thương do côn trùng đối với các bắp ngô đang trong giai đoạn đang chín khiến các chủng của sinh vật có sẵn trong môi trường xâm nhập vào bắp và hạt ngô. Điều kiện thời tiết ẩm ướt trước khi thu hoạch cũng là yếu tố thúc đẩy quá trình nhiễm nấm và tích lũy fumonisin. Đôi khi trong một vài trường hợp, fumonisin được tìm thấy trong các hạt ngô không có triệu chứng nhiễm bệnh.

Phần phế liệu sau khi sàng lọc ngô (corn 2 screenings) bao gồm mảnh vỡ hạt ngô, hạt ngô bị hỏng, vỏ, bụi, tạp chất.đươc loại bỏ sau khi thu hoạch sẽ chứa mức độc tố cao nhất và là nguyên nhân gây bệnh nếu được dùng làm nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi mà không qua xử lý đúng cách. Tỷ lệ giữa các dạng fumonisin chính trong ngô thường là FB₁/FB₂ = 3:1 và FB₁/FB₃ = 12:1. Tuy nhiên, hàm lượng tổng fumonisin (FB₁ + FB₂ + FB₃) trong các sản phẩm chế biến từ ngô đạt chuẩn thực phẩm thường dao động từ 3–5 µg/g. Không có bằng chứng rõ ràng cho mối tương giữa mức độ nhiễm nấm Fusarium với hàm lượng fumonisin.

Nhiều loại ngũ cốc khác được ghi nhận có chứa độc tố này như gạo, lúa mì, yến mạch, lúa mạch đen, kê. Trong lúa, fumonisin đã được phát hiện khi có bệnh thối bẹ (sheath rot disease). Bên cạnh đó, các sản phẩm từ ngô như tortilla, ngũ cốc ăn sáng, bánh mì Bồ Đào Nha và thậm chí trà đen, trà thảo mộc cũng từng được ghi nhận có chứa fumonisin. Sự nhiễm fumonisin bị ảnh hưởng bởi điều kiện canh tác, khí hậu nông nghiệp, mức độ nhiễm nấm và các loài nấm khác nhau.

Các điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất fumonisin bao gồm hạn hán trong mùa sinh trưởng, sau đó chuyển sang mát mẻ ẩm ướt trong quá trình thụ phấn và hình thành hạt. Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho thấy biến đổi khí hậu đang ngày càng thúc đẩy mở rộng tình trạng sản sinh loài fusarium và khu vực có nguy cơ nhiễm độc tố, trước đây phổ biến ở vùng nhiệt đới, nhưng gần đây đã lan đến vùng ôn đới. Những thay đổi trong mô hình lượng mưa và độ ẩm không khí thúc đẩy sự phát triển nấm và sản sinh độc tố. Đối với từng loài nấm khác nhau, điều kiện sinh độc tố của chúng được trình bày ở Bảng 1.

Các điều kiện của nấm mốc sinh độc tố [5],[7] Tên nấm mốc Nhiệt độ Nhiệt độ Nhiệt độ pH Hoạt tối thiểu thích hợp tối đa (°C) độ (°C) nhất (°C) nước (aw) Fusarium -3 25 31 5 0. niger 6-8 35-37 42-45 Fusarium 24-30 5,5 0,994 proliferatum Một trong những bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp fumonisin là quá trình ngưng tụ một chuỗi polyketide mạch thẳng với alanine. Sau đó là quá trình khử cacbonyl và este hóa với axit propane-1,2,3-tricarboxylic. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng lượng fumonisin sinh ra bị ảnh hưởng bởi điều kiện như nguồn cacbon, độ pH môi trường, hoạt độ nước, và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy.

3 Quá trình tổng hợp FB ở nấm là một quá trình phức tạp được quyết định bởi các cụm gen FUM, trong những năm gần đây, các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện của các gen này ngày càng được quan tâm nghiên cứu. Cụm gen này gồm 17 gen, được xác định và đặc trưng hóa ở các loài F. Trong đó FUM1, FUM6, FUM8 và FUM21 đóng vai trò chính, trong đó FUM1 mã hóa polyketide synthase, enzyme chủ chốt trong tổng hợp khung carbon của FB, FUM8 tham gia amin hóa, FUM6 và FUM10 đóng vai trò hydroxyl hóa, FUM 19 mã hóa một protein vận chuyển ATP giúp giải phóng FB ra khỏi tế bào, FUM5 mã hóa enzyme acyltransferase, xúc tác tổng hợp phân tử FB1 có hoạt tính sinh học. Nghiên cứu của Lazzaro cho thấy biểu hiện FUM1 tăng mạnh trong điều kiện mất nước, đặc biệt khi kết hợp với FUM3 và FUM14, và điều này liên quan tới việc tăng sản xuất fumonisin.

Tốc độ tích lũy độc tố và biểu hiện của FUM 1 trong bắp khô chứng minh cho việc nấm tăng sản xuất FB môi trường khô hạn. Khác biệt giữa ba loại fumonisin B chủ yếu đến từ mẫu hydroxyl hóa, được điều khiển bởi các gen FUM2 và FUM3. FUM3 còn tham gia vào quá trình hydroxyl hóa từ FB₁ thành FB₂ và FB₃. Nếu FUM2 hoạt động, quá trình hydroxyl hóa xảy ra ở vị trí C-10, tạo ra FB₁ và FB₃; nếu không hoạt động, sản phẩm chính là FB₂ (thiếu nhóm hydroxyl tại vị trí C-10) [7].

niger cũng có cụm gen tương đồng, tuy nhiên, mặc dù có chứa gen FUM2, A. niger không thực hiện hydroxyl hóa ở C-10, phù hợp với việc không biểu hiện gen FUM2. Tính chất lý hóa và độc tính 1. Tính chất lý hóa Câu trúc hóa học của nhóm FB được trình bày ở Hình 1.

Cấu trúc hóa học của FB1, FB2, FB3 Cấu trúc đặc trưng bởi một chuỗi alkyl aminopolyhydroxy 20 carbon được diester hóa với axit propane-1,2,3-tricarboxylic (axit tricarballylic, TCA) tại vị trí C-14 và C- 15; một nhóm amin tại C-2; các nhóm methyl tại C-12 và C-16 [3]. FB2 và FB3 là các dạng dehydroxy của FB1 tại vị trí C-5 và C-10, tương ứng. Dưới đây là một số đặc điểm cơ bản của ba loại fumonisin B. Các đặc điểm cơ bản của ba loại FB FB1 FB2 FB3 Công thức phân tử C34H59O15 C34H59O14 C34H59O14 Trọng lượng phân 721,8 g/mol 705,8 g/mol 705,8 g/mol tử Log P 1,84 1,2 0,8 Thể chất Bột rắn trắng/trắng Bột rắn trắng/trắng Bột rắn trắng/trắng ngà ngà ngà Fumonisin là các hợp chất phân cực cao do chứa nhiều nhóm chức carboxylic (- COOH) và hydroxyl (-OH), dễ hòa tan trong nước và acetonitrile/ H2O hoặc methanol/ H2O, không tan trong dung môi không phân cực.