Khóa luận: Xác định hàm lượng acid béo chuyển hóa trong sữa bằng GC-FID

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ nghiên cứu xác định hàm lượng acid béo chuyển hóa (trans fat) trong sữa bằng phương pháp phân tích sắc ký khí GC-FID.

• Tác giả: Trịnh Thị Tố Uyên
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thị Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Xác định hàm lượng acid béo chuyển hóa trong sữa bằng GC-FID
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Acid Béo Chuyển Hóa Trong Sữa

Acid béo chuyển hóa (trans fatty acids) là những axit béo không bão hòa có cấu trúc hình học đặc biệt, được hình thành thông qua quá trình chuyển hóa tự nhiên trong dạ dày của động vật nhai lại hoặc từ quá trình công nghiệp hóa dầu thực vật. Trong sữa và các sản phẩm từ sữa, acid béo chuyển hóa xuất hiện chủ yếu từ quá trình lên men của vi khuẩn trong dạ dày của bò sữa. Hàm lượng acid béo trans trong sữa thường dao động từ 0,5-5% tổng acid béo, tùy thuộc vào chế độ ăn và điều kiện nuôi dưỡng của động vật. Việc xác định và kiểm soát hàm lượng acid béo chuyển hóa trong sữa đã trở thành yêu cầu cấp thiết để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là nhóm trẻ em và phụ nữ mang thai.

1.1. Định Nghĩa và Phân Loại Acid Béo Trans

Acid béo trans là những axit béo không bão hòa có liên kết kép ở cấu hình cis-trans isomerism. Chúng được phân loại thành hai nhóm chính: (1) trans béo tự nhiên được sinh ra từ quá trình lên men trong rumen của gia súc nhai lại, chủ yếu là axit béo Vaccenic acid (VA) và conjugated linoleic acid (CLA); (2) trans béo công nghiệp được tạo ra từ quá trình hydrogenation từng phần của dầu thực vật. Trong sữa tươi, acid béo chuyển hóa tự nhiên chiếm tỷ lệ cao hơn, trong khi sản phẩm sữa chế biến có thể chứa cả hai loại.

1.2. Tính Chất Vật Lý và Hóa Học

Acid béo trans sở hữu điểm nóng chảy cao hơn acid béo cis do cấu trúc hình học thẳng hơn. Tính chất này làm cho chúng ít lỏng hơn ở nhiệt độ phòng và ổn định hơn trong thời gian bảo quản. Về mặt hóa học, acid béo chuyển hóa tương tự như acid béo bão hòa trong khả năng tăng cholesterol máu và lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL), nhưng không mang lại các lợi ích sức khỏe như một số acid béo không bão hòa khác.

II. Phương Pháp GC FID Trong Xác Định Acid Béo Chuyển Hóa

Sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) là phương pháp tiêu chuẩn vàng được Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức (AOAC) khuyến nghị cho việc xác định hàm lượng acid béo trans trong sữa. Phương pháp này cho phép phân tách và định lượng chính xác từng loại acid béo dựa trên thời gian lưu trữ (retention time) của chúng trên cột chiết pha. GC-FID cung cấp độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt, và kết quả định lượng đáng tin cậy, với giới hạn phát hiện thấp cho phép đo lường những nồng độ acid béo trans nhỏ trong sữa. Đây là lý do tại sao phương pháp này được ưu tiên sử dụng trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm trên toàn thế giới.

2.1. Nguyên Lý Hoạt Động Của GC FID

Sắc ký khí (GC) sử dụng pha động khí (thường là nitơ hay helium) để vận chuyển mẫu vào cột chiết pha mao quản. Tại đây, các acid béo được phân tách dựa trên điểm sôi và sự hấp phụ trên pha tĩnh. Sau đó, các molecular đã phân tách đi vào đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID), nơi chúng được đốt cháy tạo ra ion được phát hiện và tạo ra tín hiệu điện tương ứng với nồng độ.

2.2. Điều Kiện Phân Tích Tối Ưu

Điều kiện GC-FID tối ưu cho xác định acid béo chuyển hóa bao gồm: nhiệt độ lò ngoại từ 50-230°C với tốc độ tăng nhiệt độ 2-4°C/phút, cột mao quản thường dùng là CP-SIL hoặc BPX có chiều dài 100m và đường kính trong 0,25mm. Nhiệt độ dò FID thường ở 250°C, lưu lượng khí điều chỉnh để đảm bảo phân tách tốt giữa các peak acid béo và thời gian phân tích hợp lý.

III. Quy Trình Xử Lý Mẫu và Chuẩn Bị

Quy trình xử lý mẫu là giai đoạn vô cùng quan trọng quyết định đến chất lượng kết quả phân tích khi xác định acid béo chuyển hóa trong sữa. Đầu tiên, mẫu sữa phải được bảo quản đúng cách ở nhiệt độ -20°C để ngăn chặn sự thay đổi thành phần acid béo. Tiếp theo, chất béo được chiết xuất từ mẫu bằng các dung môi hữu cơ như ethanol hoặc methanol, sau đó chất béo được esterification (chuyển thành este methyl acid béo - FAME) bằng tác nhân methylation (thường dùng sodium methoxide). Quá trình chuyển đổi này rất cần thiết vì FAME dễ dàng bay hơi hơn acid béo tự do và tạo ra peak rõ ràng trên sắc ký đồ GC-FID.

3.1. Chiết Xuất Chất Béo Từ Mẫu Sữa

Chiết xuất chất béo từ sữa thường sử dụng phương pháp AOAC 2012 với dung dịch ethanol-acetone hoặc methanol. Mẫu sữa được thêm dung dịch hóa chất và hỗn hợp được khuấy mạnh để phá vỡ các hạt fat globules. Sau đó, hỗn hợp được để yên để phân tầng, lớp trên chứa chất béo được cath ra và làm sạch bằng rửa nhiều lần với nước. Chất béo chiết xuất được làm khô hoàn toàn bằng hệ thống sấy hoặc dưới chân không.

3.2. Quá Trình Methylation của Acid Béo

Methylation là bước chuyển đổi acid béo thành este methyl (FAME) để phù hợp với phương pháp GC-FID. Chất béo chiết xuất được hòa tan trong dung dịch có chứa sodium methoxide hoặc potassium hydroxide trong methanol. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng hoặc 40-50°C trong 15-30 phút. Nước ngưng tụ được loại bỏ, dung dịch FAME được tách lớp và làm sạch trước khi đưa vào GC-FID để phân tích.

IV. Thẩm Định Phương Pháp và Ứng Dụng Thực Tiễn

Thẩm định phương pháp phân tích là bước thiết yếu để đảm bảo độ tin cậy và độ chính xác của kết quả xác định acid béo chuyển hóa. Các tiêu chí thẩm định bao gồm: độ tuyến tính (linearity) với hệ số tương quan R² > 0,99, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định qua ratio tín hiệu/nhiễu 3:1 và 10:1, độ lặp lại (repeatability) và độ tái lặp nội bộ (intermediate precision) với RSD < 5%, cùng độ không đảm bảo đo (measurement uncertainty). Sau khi thẩm định thành công, phương pháp được áp dụng để phân tích các mẫu sữa từ thị trường, giúp kiểm soát chất lượng sữa và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng khỏi tác hại của acid béo trans.

4.1. Độ Tuyến Tính và Đường Chuẩn

Độ tuyến tính được xác định bằng cách tiêm các nồng độ khác nhau của chuẩn acid béo trans (thường từ 5-100 mg/100g) vào GC-FID và vẽ đường chuẩn. Phương trình tuyến tính y = ax + b được tính toán với R² phải ≥ 0,99. Độ tuyến tính tốt đảm bảo rằng kết quả phân tích có mối liên hệ trực tiếp với nồng độ acid béo chuyển hóa trong mẫu, từ đó cho phép định lượng chính xác.

4.2. Ứng Dụng Trong Kiểm Nghiệm Sữa Thị Trường

Phương pháp GC-FID được áp dụng rộng rãi để kiểm kiểm sữa và các sản phẩm từ sữa bán trên thị trường. Các mẫu sữa từ các nhà sản xuất khác nhau được thu thập và phân tích để xác định hàm lượng acid béo trans và so sánh với tiêu chuẩn cho phép. Kết quả phân tích không chỉ giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm mà còn cung cấp dữ liệu cho các nhà hoạch định chính sách về sức khỏe công cộng và an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1. Tổng quan về acid béo trans 1. Định nghĩa và phân loại Acid béo chuyển hóa, acid béo trans hoặc chất béo trans (tên tiếng Anh: trans fat hoặc trans fatty acid) là acid béo không bão hòa có chứa ít nhất một liên kết đôi trong cấu hình trans. Cấu trúc ba chiều của acid béo trans giống với acid béo bão hòa hơn là acid béo không bão hòa thông thường, có liên kết đôi trong cấu hình cis.

Cấu hình trans làm cho phân tử acid béo có cấu trúc thẳng hơn, khiến chúng có tính chất vật lý và hóa học gần giống acid béo bão hòa [6]. Ví dụ về cấu trúc hóa học của acid béo trans C18 Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO): Chất béo trans, hay acid béo trans (TFA), là acid béo không bão hòa có nguồn gốc từ công nghiệp hoặc tự nhiên - Acid béo trans tự nhiên: hình thành qua quá trình lên men bởi vi khuẩn hệ tiêu hóa trong dạ cỏ của động vật nhai lại như bò, cừu và có mặt trong các sản phẩm như sữa, thịt. [7-8] - Acid béo trans công nghiệp: sinh ra trong quá trình hydro hóa một phần dầu thực vật để tạo ra chất béo rắn hoặc bán rắn [9-11] và qua quá trình xử lí nhiệt thường có trong các sản phẩm chế biến như bánh kẹo, đồ ăn nhanh. Cấu trúc hóa học Acid béo trans có cấu trúc gồm một chuỗi hydrocarbon dài với một nhóm carboxyl (-COOH) ở đầu chuỗi (Hình 1.

Tuy nhiên, khác biệt của acid béo trans so với các acid béo không bão hòa khác là liên kết đôi giữa các nguyên tử carbon ở dạng trans, tức là nguyên tử hydro gắn với chuỗi carbon trong liên kết đôi nằm ở hai phía đối diện, ảnh hưởng đến tính chất vật lý và hóa học của acid béo. Cấu trúc của các đồng phân hình học của acid béo C18 1. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của acid béo trans 1. Tính chất vật lý Acid béo trans thường tồn tại dưới dạng rắn hoặc bán rắn ở nhiệt độ phòng, trong khi acid béo chưa bão hòa dạng cis thường ở dạng lỏng [9], [14].

Nhiệt độ nóng chảy cao hơn so với acid béo dạng cis do cấu trúc thẳng [14]. Bên cạnh đó, các acid béo trans có tính chất chung của acid béo như không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ. Tính chất hóa học Dễ bị oxy hóa, đặc biệt khi tiếp xúc với không khí và ánh sáng. Tham gia các phản ứng ester hóa, xà phòng hóa và hydro hóa.

Chúng ổn định hơn về mặt hóa học so với acid béo dạng cis, do cấu trúc thẳng giúp giảm khả năng bị biến đổi cấu trúc. Vai trò và ứng dụng của acid béo trans Acid béo trans được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm nhờ khả năng cải thiện kết cấu, hương vị tốt hơn và thời hạn sử dụng được kéo dài [15-17]. Vì lý do này mà acid béo trans thường có mặt trong các loại bánh quy, bánh ngọt, bơ thực vật và đồ ăn nhanh.2 mô tả lượng acid béo trans hấp thụ trong chế độ ăn uống của người dân Mỹ và Anh [18-19]. Hàm lượng acid béo trans trong một số thực phẩm tại Mỹ Lượng acid Tỉ lệ acid béo béo trans trans so với tổng Loại thực phẩm Số lượng trong thực chất béo trong phẩm (g) thực phẩm (%) Bơ thực vật dạng que 1 muỗng canh 3,9 17 Bơ thực vật dạng ống 1 muỗng canh 1,4 10 Dầu đậu nành 1 muỗng canh 0,5 2 Bánh quy socola 1 cái lớn 12,1 6 Bánh ngọt 1 miếng 28,1 5 Khoai tây chiên lát mỏng 1 oz 8,9 11 1 đĩa cỡ trung Khoai tây chiên que 41,9 5 bình 10 cái cỡ trung Bánh quy ăn vặt 39,7 8 bình Bảng 1.

Hàm lượng acid béo trans trong một số thực phẩm tại Anh Tỷ lệ acid béo trans có trong thực Nguồn gốc Loại thực phẩm phẩm (%) Sữa và phô mai 18,8 Bơ 5,9 Nguồn tự nhiên Trứng 0,9 Thịt và các sản phẩm 10,3 từ thịt Dầu và chất béo 35,5 Bánh quy và bánh 16,5 Nguồn công ngọt nghiệp Bánh mặn 3,5 Khoai tây chiên 4,5 Thực phẩm khác 4,1 Tổng 100 1. Tác động của acid béo trans đối với sức khỏe Chính nhờ những lợi ích về kinh tế nên tại các cơ sở chế biến công nghiệp, việc sử dụng và tiêu thụ các sản phẩm chứa acid béo trans dần tăng, tuy nhiên các nhà nghiên cứu lo lắng rằng vấn đề sức khỏe có được đảm bảo khi sử dụng các sản phẩm chứa TFA. 5 Vì vậy, đã có rất nhiều nghiên cứu đưa ra và chỉ rõ mối liên hệ giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các sản phẩm chứa acid béo trans với hàm lượng cao. Các bệnh lý tim mạch, rối loạn chuyển hóa và viêm nhiễm mãn tính là các vấn đề về sức khỏe bị ảnh hưởng nghiêm trọng và nặng nề nhất, ngoài ra còn một số các bệnh lý khác cũng được nêu ra như nguy cơ ung thư, béo phì, gan nhiễm mỡ không do rượu [20-21].

Ảnh hưởng đến hệ tim mạch: các chuyên gia đã nêu rằng việc tiêu thụ TFA làm nhiễu loạn khả năng chuyển hóa các acid béo thiết yếu của cơ thể (bao gồm cả acid béo omega-3) dẫn đến những thay đổi trong thành phần acid béo phospholipid trong động mạch chủ, do đó làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch[22]. Ngoài ra, việc tiêu thụ acid béo trans có tác động xấu đến lipid huyết tương, cụ thể là làm tăng cholesterol LDL (cholesterol xấu) và giảm HDL (cholesterol tốt), dẫn đến mất cân bằng lipid máu. Nồng độ chelesterol toàn phần và HDL trong huyết thanh khi hấp thu cùng phần trăm năng lượng hàng ngày của acid béo trans và cis Phần Cholesterol tổng Cholesterol HDL Tỷ lệ cholesterol trăm (mmol/L) (mmol/L) tổng/HDL năng lượng chất TLTK Acid béo Acid Acid béo Acid Acid béo Acid béo trans béo cis trans béo cis trans béo cis đóng góp (%) 3,0 5,46 5,26 1,40 1,42 3,90 3,96 [23] 3,7 5,30 5,02 1,11 1,14 4,77 4,40 [24] 4,2 5,92 5,56 0,98 0,98 6. Ngoài ra, các nghiên cứu khác giải thích cơ chế phân tử đằng sau tình trạng dung nạp glucose bị suy yếu do TFA gây ra và một số mối tương quan đã được tìm thấy với sự chuyển vị GLUT4 phụ thuộc insulin bị suy yếu [28], sự suy yếu của con đường IR1-PI3-AKT liên quan đến sự chuyển vị GLUT4 [29] và sự căng thẳng ER và ức chế thụ thể insulin [30].

6 Tác động gây viêm mạn tính: chất béo trans gây ra tình trạng viêm vô trùng, tức là xảy ra tình trạng viêm nhưng không có nhiễm trùng. Điều này được giải thích trong tình trạng bệnh xơ vữa động mạch, ngoài việc do lipid thúc đẩy, xơ vữa động mạch đặc trưng bởi sự tích tụ các tế bào bọt đại thực bào trong thành mạch. Từ đấy, kích hoạt quá trình tiết nhiều chất trung gian gây viêm như CRP (C-reactive protein), TNF-α, IL-1, IL-6, IL-1β và kéo theo nhiều tế bào miễn dịch khác [4]. Trong một thử nghiệm có đối chứng ngẫu nhiên ở những người đàn ông khỏe mạnh, chế độ ăn chứa 8% năng lượng hàng ngày từ acid béo trans công nghiệp đã gây ra sự gia tăng gấp 3,4 lần nồng độ CRP trong huyết tương sau 5 tuần tiêu thụ so với chế độ ăn đối chứng không có acid béo trans [31].

Tình hình sử dụng và kiểm soát acid béo trans trên thế giới và Việt Nam 1. Tình hình trên thế giới Với những lợi ích về kinh tế và giá trị thương mại, acid béo trans đang ngày càng được các công ty thực phẩm sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây. Tuy nhiên, đối mặt với những công bố về nguy cơ sức khỏe mà acid béo trans mang lại, chính phủ các nước đã có những biện pháp nhằm giảm thiểu tối đa hoặc loại bỏ hoàn toàn acid béo trans hoặc thay thế bằng các chất béo lành mạnh hơn.4 trình bày các chính sách của một vài quốc gia: Bảng 1. Tình hình kiểm soát acid béo trans trên thế giới Quốc Cơ quan ban gia/Tổ Thời gian Chính sách hành chức Công nhận acid béo trans công nghiệp 2015 Cục quản lý không an toàn với mọi loại thực phẩm Thực phẩm và Hoa Kì Dược phẩm Hoa Cấm dầu hydro hóa một phần trong thực 6/2018 Kỳ (FDA) phẩm, trừ thực phẩm ngắn hạn Cấm sử dụng dầu hydro hóa một phần Canada 2018 Bộ Y tế Canada trong tất cả thực phẩm trong và ngoài nước Quy định Hàm lượng acid béo trans tối đa 2 gam số trên 100 gam chất béo có trong thực 1925/2006 phẩm EU Hàm lượng acid béo trans không vượt Quy định quá 3% tổng hàm lượng chất béo trong 2016/127 sữa bột và sữa công thức trẻ em Hàm lượng acid béo trans không được Bộ Thực phẩm, vượt quá 2 gam trên 100 gam chất béo.

Đan Nông nghiệp và Các sản phẩm quảng cáo “không chứa 2003 Mạch Thủy sản Đan acid béo trans”, hàm lượng phải ít hơn 1 Mạch gam trên 100 gam chất béo trong thành phần 7 Hàm lượng acid béo trans trong thực Nam Phi 2011 Bộ Y tế Nam Phi phẩm không được vượt quá 2 gam trên 100 gam chất béo Cơ quan Tiêu Acid béo trans có trong thực phẩm chuẩn và An toàn không được quá 2% tổng lượng chất Ấn Độ 2022 Thực phẩm Ấn béo có trong sản phẩm Độ Cấm các loại thực phẩm chứa dầu hydro Bộ Y tế Công hóa một phần và dầu đã hydro hóa một Thái Lan 2018 cộng Thái Lan phần cho thực phẩm trong nước và nhập khẩu Hành động REPLACE để loại bỏ acid 2018 béo trans WHO Hơn 50 quốc gia có chính sách loại bỏ 2025 hoàn toàn hoặc giới hạn chặt chẽ acid béo trans công nghiệp 1. Tình hình tại Việt Nam Tại Việt Nam, việc kiểm soát hàm lượng acid béo trans chỉ dừng ở mức cảnh báo và ghi nhãn thành phần dinh dưỡng, chưa có quy định hay khuyến cáo về hàm lượng chất béo trans hoặc acid béo trans trong thực phẩm như các quốc gia khác. Tuy nhiên, với những nguy cơ sức khỏe của acid béo trans được công bố, Chính phủ và Bộ Y tế bước đầu đã quan tâm và triển khai hoạt động liên quan đến vấn đề này. Hội thảo “Hiểm họa Transfat – người tiêu dùng Việt Nam cần được bảo vệ” được tổ chức vào tháng 2/2011, nhằm thông tin về chất béo trans và những ảnh hưởng tới sức khỏe tim mạch, từ đó có những nhận định ban đầu về nguy cơ của acid béo trans đối với cộng đồng.

Năm 2023, Bộ Y tế ban hành Thông tư số 29/2023/TT-BYT, yêu cầu ghi nhãn hàm lượng chất béo tổng, được tính bằng gam [32].