Khảo sát sự methyl hóa gen p16INK4α trong ung thư vòm họng ở người Việt Nam

Nghiên cứu phân tích tần suất và vai trò của sự methyl hóa promoter gen p16INK4α, một dấu ấn tiềm năng trong ung thư vòm họng ở người Việt Nam.

• Tác giả: Lương Thị Bích Thuận
• Người hướng dẫn: Lao Đức Thuận
• Trường học: Đại học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Vi sinh-Sinh học Phân tử
• Đề tài: Khảo sát thực nghiệm sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen p16INK4α trong bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về ung thư vòm họng và vai trò methyl hóa gen p16INK4α

Ung thư vòm họng là một bệnh lý ác tính phổ biến trong các bệnh ung thư đầu cổ. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng đang gia tăng đáng kể trên toàn thế giới và tại Việt Nam. Methyl hóa gen p16INK4α đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của bệnh này. Gen p16INK4α là một gen ức chế종양 (tumor suppressor gene) có chức năng điều chỉnh chu kỳ tế bào. Khi methyl hóa DNA xảy ra trên vùng promoter của gen này, nó dẫn đến im lặng gen và mất chức năng ức chế khối u. Hiện tượng này được coi là một cơ chế epigenetic quan trọng trong ung thư vòm họng, khác với những thay đổi di truyền cơ bản.

1.1. Định nghĩa ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là bệnh ác tính phát triển từ tế bào biểu mô vòm họng. Vòm họng là vùng giải phẫu nằm ở phía sau mũi, kết nối khoang mũi với h咽tụ. Bệnh thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, dẫn đến tỷ lệ sống sót thấp. Các yếu tố nguy cơ bao gồm nhiễm HPV, hút thuốc lá và uống rượu. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm khó nuốt, ợ chua, và có máu trong dãi nước bọt.

1.2. Vai trò của methyl hóa trong ung thư

Methyl hóa DNA là quá trình thêm nhóm methyl (-CH3) vào cytosine ở các đảo CpG trên DNA promoter. Trong ung thư, methyl hóa bất thường của gen p16INK4α dẫn đến im lặng gen và mất khả năng ức chế khối u. Quá trình này là một cơ chế epigenetic quan trọng, không liên quan đến đột biến DNA mà là thay đổi hoạt động gen. Sự methyl hóa gen p16INK4α được coi là dấu hiệu sớm của ung thư vòm họng và có giá trị chẩn đoán cao.

II. Cơ chế epigenetic và methyl hóa DNA

Epigenetics là lĩnh vực nghiên cứu những thay đổi trong biểu hiện gen mà không liên quan đến sự thay đổi trình tự DNA. Methyl hóa DNA là một cơ chế epigenetic chính, trong đó DNA methyltransferase (DNMT) thêm nhóm methyl vào cytosine tạo thành 5-methylcytosine (5mC). Quá trình này đặc biệt xảy ra ở các đảo CpG trên vùng promoter của gen. Trong tế bào bình thường, methyl hóa điều chỉnh biểu hiện gen một cách cân đối. Tuy nhiên, ở tế bào ung thư, methyl hóa bất thường của những gen ức chế khối u như p16INK4α dẫn đến mất chức năng và tạo điều kiện cho ung thư phát triển.

2.1. Khái niệm epigenetics

Epigenetics (học thuyết về ngoài gen) nghiên cứu những thay đổi hóa học trên DNA và protein histone mà không thay đổi trình tự DNA. Những thay đổi này có thể bị di truyền qua các lần phân chia tế bào. Epigenetic modifications bao gồm methyl hóa DNA, acetyl hóa histone, và thay đổi chromatin. Trong ung thư vòm họng, những thay đổi epigenetic như methyl hóa gen p16INK4α là những tín hiệu sớm để phát hiện bệnh.

2.2. Quá trình methyl hóa DNA

Quá trình methyl hóa DNA bắt đầu khi enzyme DNA methyltransferase (DNMT) sử dụng S-adenosyl-L-methionine (SAM) làm nguồn nhân tố methyl. SAM chuyển nhóm methyl (-CH3) lên cytosine, biến nó thành 5-methylcytosine (5mC). Phản ứng này xảy ra ở các dị hợp tử CpG trên DNA promoter. Các đảo CpG là những vùng DNA giàu cặp cytosin-guanin. Ở tế bào bình thường, hiếp hàng đảo CpG ở promoter gen không bị methyl hóa, cho phép gen biểu hiện bình thường.

III. Gen p16INK4α Chức năng và tầm quan trọng

Gen p16INK4α là một gen ức chế khối u quan trọng, nằm trên nhiễm sắc thể 9. Gen này mã hóa protein p16, một inhibitor của cyclin-dependent kinase (CDK) 4 và 6. Protein p16 điều chỉnh chu kỳ tế bào bằng cách ngăn chặn CDK4/6 phosphoryl hóa protein retinoblastoma (pRb), từ đó duy trì tế bào ở pha G1. Chức năng này rất quan trọng để ngăn chặn sự phân chia tế bào không kiểm soát. Khi methyl hóa xảy ra trên vùng promoter gen p16INK4α, nó dẫn đến im lặng gen và mất khả năng sản xuất protein p16. Kết quả là tế bào mất kiểm soát chu kỳ, tạo điều kiện cho ung thư phát triển. Sự methyl hóa gen p16INK4α được phát hiện trong nhiều loại ung thư, đặc biệt là ung thư vòm họng.

3.1. Chức năng sinh học của gen p16INK4α

Gen p16INK4α mã hóa protein p16 có kích thước 16 kDa. Protein này hoạt động như một CDK inhibitor, ức chế CDK4/6-cyclin D. Bằng cách ngăn chặn phosphoryl hóa pRb, protein p16 cho phép tế bào duy trì ở pha G1 của chu kỳ tế bào. Chức năng này giúp ngăn chặn sự chuyển dịch từ pha G1 sang pha S (phân tổng hợp DNA). Gen p16INK4α hoạt động như một tumor suppressor, bảo vệ cơ thể khỏi sự phân chia tế bào không kiểm soát.

3.2. Ảnh hưởng của methyl hóa p16INK4α

Khi methyl hóa xảy ra trên vùng promoter gen p16INK4α, nó dẫn đến im lặng gen (gene silencing). Methyl hóa bất thường của CpG islands trên promoter ngăn chặn các yếu tố phiên mã liên kết với DNA, dẫn đến giảm biểu hiện gen. Kết quả là sản xuất protein p16 giảm hoặc hoàn toàn mất. Tế bào mất đi cơ chế ức chế chu kỳ quan trọng, cho phép CDK4/6 hoạt động không kiểm soát. Điều này tạo điều kiện cho sự phân chia tế bào bất thường và phát triển ung thư.

IV. Phương pháp phát hiện methyl hóa gen p16INK4α

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện methyl hóa gen p16INK4α trong mô ung thư. Phương pháp Methylation-Specific PCR (MSP) là một kỹ thuật phổ biến, sử dụng bisulfite để chuyển đổi unmethylated cytosine thành uracil, trong khi methylated cytosine vẫn giữ nguyên. Sau đó, các mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại chỉ methylated hoặc unmethylated DNA. Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing PCR) cung cấp thông tin chi tiết hơn về vị trí các vị trí methyl hóa. Các phương pháp này rất quan trọng trong nghiên cứu lâm sàng để phát hiện methyl hóa gen p16INK4α ở bệnh nhân ung thư vòm họng, giúp chẩn đoán sớm và đánh giá tiên lượng bệnh.

4.1. Phương pháp MSP Methylation Specific PCR

Phương pháp MSP là một kỹ thuật nhạy cảm và cụ thể để phát hiện methyl hóa DNA. Quy trình bắt đầu bằng xử lý sodium bisulfite, chuyển đổi cytosine không methyl hóa thành uracil. Các mồi methyl được thiết kế để liên kết với methylated DNA, trong khi mồi unmethyl liên kết với unmethylated DNA. Phản ứng PCR khuếch đại các sản phẩm đặc hiệu, sau đó được phân tích bằng điện di. Kết quả cho thấy sự có mặt hoặc vắng mặt của methyl hóa ở vùng promoter gen p16INK4α trong mẫu ung thư.

4.2. Các phương pháp khác và ứng dụng lâm sàng

Ngoài MSP, các phương pháp như BSP (Bisulfite sequencing PCR) cung cấp thông tin chi tiết về các vị trí methyl hóa cụ thể. Phương pháp Real-time PCR cho phép định lượng mức độ methyl hóa. Các công nghệ hiện đại như next-generation sequencing cũng được sử dụng. Trong lâm sàng, phát hiện methyl hóa gen p16INK4α có giá trị chẩn đoán cao trong ung thư vòm họng. Nó giúp xác định bệnh nhân có nguy cơ cao, hỗ trợ quyết định điều trị, và theo dõi tiên lượng bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), ung thư là một thuật ngữ gọi chung cho một nhóm lớn của các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể, là một trong những nguyên nhân gây nên tử vong cao trên thế giới. Trong đó, ung thư vòm họng được biết đến chiếm tỉ lệ cao người mắc bệnh ở khu vực Châu Á như ở Trung Quốc, các nước Đông và Nam Châu Á…. Theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer), tính đến năm 2012, trên thế giới có đến 86.691 mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm đến 0,6% tỉ lệ trong số các bệnh ung thư, trong đó có đến hơn 50.000 tử vong chiếm tỉ lệ khoảng 0,6%. Ở Việt Nam, có gần 5.000 người mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 3,9% trong số các bệnh ung thư, trong đó có hơn 2.800 người tử vong chiếm tỷ lệ khoảng 3%.

Trong những năm gần đây, bệnh ung thư vòm họng liên quan đến hiện tượng biến đổi di truyền epigenetics đang được các nhà khoa học quan tâm. Mà hiện tượng epigenetics chính là sự methyl hóa vượt mức (hypermethylation) trên các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes), cụ thể được biết đến là gen p16 INK4 α , methyl hóa vượt mức tại đảo CpG của vùng promoter của gen ức chế khối u, sự biến đổi bất thường này làm bất hoạt chức năng của gen ức chế khối u, dẫn đến sự tăng sinh vượt mức của tế bào dẫn đến sinh u. Gen p16 INK4α là gen ức chế khối u quan trọng, nằm ở vị trí 9p21 của nhiễm sắc thể. Chức năng chính của p16 INK4α là kết hợp với yếu tố phiên mã nhằm kìm hãm sự tăng sinh tế bào.

Nhưng khi gen p16 INK4α bị methyl hóa tại vùng đảo CpG của vùng promoter, thì việc kết hợp yếu tố phiên mã không còn, giải phóng ra yếu tố phiên mã kích thích tế bào pha G1và pha S làm tế bào tăng sinh không kiểm soát. Trong đó, sự methyl hóa vùng promoter của gen p16 INK4α chiếm tần số khá cao trong ung thư vòm họng khoảng từ 35-66% đã được nhiều công trình nghiên cứu công bố như công trình của Ayadi và các cộng sự năm 2008, Fangyun Tian và các cộng sự năm 2013, Yang Shao và các cộng sự năm 2014.Chính sự methyl hóa trên của gen p16 INK4α đã được ứng dụng như một dấu ấn phân tử trong việc chuẩn đoán và tiên lượng phát hiện sớm ung thư. SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang x Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Tứ những cơ sở trên cho thấy rằng sự phát triển dấu chứng sinh học phân tử (Biomarker), là cần thiết trong việc phát hiện sớm tiền ung thư rất cần thiết cho việc hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng. Do đó, đề tài “Khảo sát thực nghiệm sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen p16 INK4 α trong bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người Việt Nam”, được thực hiện với mong muốn xây dựng cơ sở lý thuyết khoa học nhằm khẳng định sự methyl hóa ở p16 INK4 α được xem là một dấu chứng sinh học hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm giai đoạn tiền ung thư hỗ trợ cho chẩn đoán lâm sàng cho bệnh nhân ung thư vòm họng Việt Nam.

SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang xi Báo cáo khóa luận tốt nghiệp 1.1 Tổng quan về ung thư Theo định nghĩa của Viện Y học Quốc gia (NIH), ung thư là một thuật ngữ gọi chung cho một nhóm lớn của các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể. Ung thư là sự tăng sinh vượt mức không kiểm soát của tế bào dẫn đến hình thành khối u, sau đó xâm lấn vào các mô ở gần hay ở xa, còn được gọi là di căn. Di căn là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư [64]. Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lẻ bị tổn thương.

Việc chuyển đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường là một sự tiến triển từ một tế bào bị tổn thương tiền ung thư đến các khối u ác tính. Bệnh nhân ung thư có thể do yếu tố di truyền từ bố mẹ hoặc các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý (tia tử ngoại hoặc ion hóa), tác nhân hóa học (khói độc, aflatoxin), tác nhân sinh học (virus, vi khuẩn, kí sinh trùng) [59].1 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đã thống kê tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới vào năm 2012, số người mắc bệnh ung thư có khoảng 14,1 triệu ca mới, khoảng 8,2 triệu ca tử vong và đến 2015 thì có số người mắc ung thư tăng lên khá cáo hơn 15 triệu người mắc bệnh ung thư, trong đó có hơn 8,8 triệu người tử vong [59]. SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 1 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Hình 1. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trong ung thư trên thế giới Ở Việt Nam, theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) vào năm 2015, số người mắc phải bệnh ung thư có hơn 139.000 người tử vong [63].2 Tình hình ung thư vòm họng Ung thư vòm họng là một trong những dạng ung thư hiếm gặp ở hầu hết các nơi trên thế giới nhưng lại rất phổ biến ở Trung Quốc, các quốc gia phía Đông và Nam châu Á, một số nước Bắc Phi và châu Âu.

Theo thống kê của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer) tính đến năm 2012, trên thế giới có đến 86.691 mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm đến 0,6% tỉ lệ trong số các bệnh ung thư, trong đó có đến hơn 50.000 tử vong chiếm tỉ lệ khoảng 0,6%. Ở Việt Nam, có gần 5.000 người mắc bệnh ung thư vòm họng chiếm 3,9% trong số các bệnh ung thư, trong đó có hơn 2.800 người tử vong chiếm tỷ lệ khoảng 3% [63].2 Tổng quan về ung thư vòm họng 1.1 Ung thư vòm họng Ung thư vòm họng là bệnh ung thư bắt đầu từ vòm mũi họng, phần trên của họng phía sau mũi và gần đáy của hộp sọ [60]. SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 2 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Hình 1. Giải phẩu về vùng vòm họng Ung thư vòm họng do các nguyên nhân có tác động qua lại với nhau gây ra, gồm sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr virus), sự methyl hóa vượt mức trên các đảo CpG ở vùng promoter của một số gen như p16 INK4 α, DAPK, E-cadherin, RASSF1A, p14, RARß2…, yếu tố môi trường và chế độ ăn uống [60][29].2 Phân loại ung thư vòm họng [61] Theo Ủy ban Liên Hợp Mỹ về ung thư (AJCC) phân ra các giai đoạn của ung thư vòm họng: Giai đoạn 0: các tế bào ung thư tại chỗ (in situ) Giai đoạn I: các khối u ở vòm mũi họng và có thể đã lây lan đến các mô mềm của khoang mũi và/ hoặc vùng hầu họng.

Giai đoạn IIA: các khối u đã phát triển thành các mô ở bên trái hoặc bên phải của phần trên cổ họng. Giai đoạn IIB: các khối u vẫn bị giới hạn trong vòng mũi họng hoặc có thể mở rộng đến các mô mềm của khoang mũi hoặc vùng hầu họng. Khối u lan rộng ra một hay nhiều hạch bạch huyết lân cận. SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 3 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Giai đoạn IIIA: khối u đã lan rộng đến các xoang hoặc các xương gần vùng mũi họng, khối u có thể hoặc không thể đã lan đến các hạch bạch huyết ở cổ hoặc phía sau cổ họng.

Giai đoạn IIIB: các khối u vẫn có thể được giới hạn ở vòm mũi họng, nó có thể phát triển thành các mô mềm của khoang mũi hoặc vùng hầu họng, bên trái hoặc bên phải của phần trên của họng. Các khối u đã di căn vào hạch bạch huyết cổ lân cận trên cả hai bên. Giai đoạn IVA: khối u đã phát triển trong sọ hoặc dây thần kinh xương sọ, các hầu dưới (phần dưới của cổ họng), mắt, hoặc các mô lân cận của khối u. Khối u có thể hoặc không có thể đã lan đến các hạch bạch huyết lân cận ở cổ.

Giai đoạn IVB: các khối u có thể hoặc không có thể đã mở rộng sang các mô mềm lân cận hoặc xương, đã lan đến các hạch bạch huyết hoặc đang nằm trong vùng vai trên xương đòn. Giai đoạn IVC: khối u có thể hoặc không có thể đã mở rộng sang các mô mềm lân cận hoặc xương. Khối u có thể hoặc không có thể đã lan đến các hạch bạch huyết gần đó. Khối u đã lan rộng đến các vị trí ở xa.1 Định nghĩa Epigenetics là sự thay đổi di truyền trong biểu hiện gen mà không đi kèm với những thay đổi trình tự DNA và được di truyền ổn định qua nhiều thế hệ [25].2 Hiện tượng epigenetics Hiện tượng epigenetics tham gia vào chu trình điều hòa biểu hiện gen, đặc biệt liên quan đến các gen ức chế khối u [61].

Biến đổi epigenetics bao gồm methyl hóa DNA, biến đổi histone (phosphoryl hóa, acetyl hóa, methyl hóa) và các phân tử RNA nhỏ (như microRNA, RNAi,…) [61]. SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 4 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp Hình 1.3 Đảo CpG Đảo CpG là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước khoảng 0,5 - 4,0 kb, bao gồm các cystosine và guanine nằm kề nhau được liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester, phần trăm GC > 50%. Đảo CpG thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc thuộc vùng trình tự promoter, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo CpG không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm riêng biệt bắt đầu từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen thì bị methyl hóa [19] [61].1 Định nghĩa Methyl hóa DNA là quá trình gắn gốc methyl (-CH3) vào carbon vị trí số 5 của vòng cytosine (C) đứng trước guanines của đảo dinucleotide CpG (cystosine- phosphate-guanine-CpG) hình thành hình thành 5-methylcytosine (5mc) [54]. Methyl hóa DNA là một hiện tượng biến đổi epigenetics.

Methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra trong quá trình phát triển của tế bào, chúng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen cho nhiều loại tế bào gồm sự phát SVTH: Lương Thị Bích Thuận Trang 5 Báo cáo khóa luận tốt nghiệp phát triển phôi thai, quá trình phiên mã, cấu trúc NST, bất hoạt NST số X và đánh dấu bộ gen [10] [19]. Giống như sửa đổi histone, methyl hóa DNA không ảnh hưởng đến trình tự DNA [54].