Đặt vấn đề Các cây thuốc thảo dƣợc đã đƣợc sử dụng từ rất lâu đời trong nền y học cổ truyền. Hiện nay, thuốc thảo dƣợc vẫn đƣợc sử dụng nhiều trong việc chữa trị bệnh. Với xu hƣớng của cuộc sống ngày càng hài hòa cùng thiên nhiên, việc sử dụng các nguyên liệu thảo dƣợc để bảo vệ sức khỏe và điều trị bệnh ngày càng gia tăng. Hàng ngàn loài thực vật và động vật có đặc tính dƣợc lý đƣợc dùng làm nguyên liệu thuốc [28].
Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. Theo thống kê của Bộ y tế mỗi năm Việt Nam tiêu thụ khoảng 30 - 50 tấn nguyên liệu thảo dƣợc để sử dụng trong y học cổ truyền và xuất khẩu ra nƣớc ngoài. Các loài cây thảo dƣợc có thể dùng trực tiếp làm tác nhân điều trị hoặc làm nguyên liệu ban đầu cho quá trình tổng hợp các loại thuốc. Hiện nay, ở Việt Nam mới chỉ khai thác sử dụng khoảng 200 loại cây dƣợc liệu [1], trong đó có một số loài đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng các sản phẩm thảo dƣợc nhƣ Sâm Ngọc Linh, trà Tam Thất Xạ Đen, trà Giảo Cổ Lam, trà Nấm Linh Chi.Các sản phẩm thảo dƣợc ngày càng đa dạng với các hình thức mẫu mã, nhãn hiệu khác nhau và có thể chứa duy nhất một thành phần hoặc là sự kết hợp của nhiều thành phần.
Việc liệt kê chính xác các thành phần của các sản phẩm thảo dƣợc là rất quan trọng đối với ngƣời tiêu dùng, song các thành phần đó không thể dễ dàng xác định bằng hình thức trực quan [32]. Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại cây thuốc dân gian và trà thảo dƣợc ở các nƣớc châu Á bao gồm Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [50]. Giảo Cổ Lam còn có nhiều tên gọi khác, trong tiếng Trung gọi là "Jiao Gu Lan", trong tiếng anh đƣợc gọi là Nhân Sâm Năm Lá, ở Việt Nam thƣờng gọi là Giảo Cổ Lam hoặc cây Bổ Đắng. Trong cuốn "Compendium of Materia Media" của tác giả Li Shi – Zhen xuất bản năm 1578 đã nói đến Giảo Cổ Lam đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh 2 nhƣ đái ra máu, phù nề ở họng và cổ, khối u, các chấn thƣơng…Ngƣời ta cũng sử dụng Giảo Cổ Lam để điều trị các bệnh cảm lạnh thông thƣờng và các bệnh truyền nhiễm khác [38].
Hình ảnh Giảo Cổ Lam mọc ngoài tự nhiên và quả Giảo Cổ Lam ( Nguồn ảnh : NaturalyPure.com) Trong cây Giảo Cổ Lam có chứa nhiều hoạt chất quý bao gồm saponin, flavonoid, chlorophyll, và carotenoids. Trong đó, saponin và flavonoid đƣợc cho là chịu trách nhiệm chính cho tính chất của Giảo Cổ Lam. Hơn 165 saponin triterpene dammarane đã đƣợc xác định từ Giảo Cổ Lam. Flavonoids, còn đƣợc gọi là vitamin P.
Saponin và flavonoids từ Giảo Cổ Lam có vai trò quan trọng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thƣ, bao gồm ung thƣ gan, đại trực tràng, tuyến tiền liệt và ung thƣ phổi, điều trị các bệnh bạch cầu, glioma, miệng, lƣỡi, thực quản [50], ngoài ra Giảo Cổ Lam còn có tác dụng rất tích cực trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đƣờng [23]. Phần lớn các báo cáo chủ yếu tập trung vào hiệu quả của các saponin hơn là các flavonoid [50]. Hiện nay, Giảo Cổ Lam đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng trà thảo dƣợc ở Hoa Kỳ và nhiều nƣớc Châu Á khác nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [23, 50]. Các sản phẩm thảo dƣợc bày bán sẵn trên thị trƣờng có thể bị nhiễm, bị thay thế bằng các loài cây khác hoặc có chứa các chất độn không đƣợc liệt kê trên nhãn của sản phẩm do sự nhầm lẫn hoặc cố ý.
Theo tổ chức y tế thế giới, sự pha trộn, 3 thay thế các nguyên liệu thảo dƣợc là một mối đe dọa lớn đến sự an toàn của ngƣời tiêu dùng vì họ không thể tự kiểm định đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm họ đang dùng cho nên việc mua phải các loại sản phẩm không đảm bảo chất lƣợng là điều khó tránh đƣợc [34]. Sự thay thế, pha trộn các nguyên liệu thảo dƣợc có thể làm giảm tác dụng của thuốc, trong một số trƣờng hợp còn gây chết ngƣời nếu nguyên liệu dùng để thay thế có chứa các chất độc hại. Do đó, việc xác định chính xác các thành phần nguyên liệu làm thuốc là vô cùng quan trọng [49]. Các phƣơng pháp truyền thống dùng để nhận diện cây thuốc bao gồm các phƣơng pháp cảm quan (xác định bằng các giác quan: Vị giác, thị giác, khứu giác, xúc giác) và phƣơng pháp hóa học ví dụ nhƣ TLC, HPLC-UV, HPLC-MS [9, 49].
Mặc dù các phƣơng pháp xác định bằng cảm quan có ƣu điểm là đơn giản, song độ chính xác lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các thanh tra viên [45] hơn nữa sự khác biệt giữa các loài có liên quan hoặc các sản phẩm chế biến đôi khi không rõ ràng [28]. Phân tích hóa học có độ tin cậy cao hơn nhƣng kết quả có thể bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện sinh lý và sinh hóa của các loại thảo mộc. Các loài có chứa các thành phần hóa học tƣơng đồng nên có thể nhầm lẫn. Vì vậy, để xác định các thành phần của các sản phẩm thảo dƣợc là rất khó khăn, đặc biệt là đối với những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc chế biến một phần hoặc ở dạng nghiền thành mảnh nhỏ [36, 45, 49].
Với sự tiến bộ của kĩ thuật di truyền, DNA marker trở thành một phƣơng tiện thuận lợi cho việc nhận dạng các loài ở cấp độ nghiên cứu phân tử. DNA là một đại phân tử ổn định, không bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên ngoài, độ tuổi, điều kiện thu hoạch và đƣợc tìm thấy trong tất cả các mô của một cá thể, việc phân tích cũng chỉ cần một lƣơng mẫu nhỏ. Vì vậy, việc lựa chọn nghiên cứu DNA ở các sinh vật để xác định loài là một phƣơng pháp hiệu quả, điều này có ý nghĩa lớn trong việc nghiên cứu DNA ở các mẫu khô hoặc đã qua sơ chế. Các kỹ thuật mới dùng trong xác định các mẫu vật sinh học sử dụng các trình tự DNA ngắn của hệ gen sinh vật gọi là mã vạch DNA.
Năm 2003, mã vạch DNA đƣợc đề xuất bởi Paul Hebert, đại học Guelph dùng nhƣ một đơn vị để phân loại loài [26,49]. Đây là một kỹ thuật sử dụng những vùng gen tiêu chuẩn để phân biệt các loài. So với 4 các phƣơng pháp truyền thống, kỹ thuật mã vạch DNA cho kết chính xác hơn rất nhiều, mã vạch DNA cung cấp công cụ hữu ích và độc lập để bổ sung cho các phân tích hóa học trong việc xác định và đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu [27]. Hiện nay, đã có nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới ứng dụng phƣơng pháp mã vạch DNA để xác định thành phần trong các sản phẩm thảo dƣợc.
Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về DNA mã vạch chủ yếu tập trung vào đánh giá đa dạng di truyền, nhận diện ở một số loài. Các ứng dụng của DNA mã vạch trong lĩnh vực dƣợc phẩm chƣa phát triển. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là kỹ thuật di truyền trong phân tích, đánh giá chất lƣợng các sản phẩm thảo dƣợc để có thể tìm ra các loại sản phẩm kém chất lƣợng góp phần đảm bảo lợi ích cho ngƣời tiêu dùng là rất cần thiết. Nắm bắt đƣợc tầm quan trọng và nhu cầu thực tế trên, tôi thực hiện để tài ―Ứng dụng phương pháp mã vạch DNA trong kiểm định thành phần chính của các sản phẩm thảo dược từ Giảo Cổ Lam‖.
Mục đích của đề tài - Tách chiết thu DNA tổng số từ các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô, mẫu trà túi lọc Giảo Cổ Lam và thuốc thảo dƣợc dạng viên nén. - Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại thành công vùng gen rbcLa và ITS2 từ DNA thu ở các mẫu trên. - Giải trình tự các sản phẩm PCR, từ các dữ liệu trình tự thu đƣợc sẽ dùng để đánh giá chất lƣợng các mẫu trà và thuốc thảo dƣợc. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Ứng dụng phƣơng pháp mã vạch DNA để kiểm định thành phần chính trong các sản phẩm trà thảo dƣợc làm cơ sở cho đánh giá chất lƣợng của các sản phẩm thảo dƣợc khác.
- Ý nghĩa thực tiễn: Xác định, đánh giá đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm trà thảo dƣợc, giúp ngƣời tiêu dùng có những lựa chọn hợp lí nhất. 5 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA Sự đa dạng loài là nền tảng cho tất cả các nghiên cứu sinh học, nhƣng nó cũng là một thách thức lớn, vấn đề phân loại và xác định các loài là một nhiệm vụ không dễ dàng. Trong thực tế, mới chỉ xác định đƣợc khoảng 1,7 triệu loài trong hàng chục triệu loài sinh vật có trên trái đất [31].
Trong đó, có rất nhiều loài đƣợc xác định căn cứ vào nhận dạng các đặc điểm và chẩn đoán hình thái. Tuy nhiên, phƣơng pháp xác định đựa vào hình thái bên ngoài của sinh vật có rất nhiều hạn chế. Đầu tiên là sự mềm dẻo về kiểu hình và biến dị di truyền ở các loài sinh vật nên nhiều khi sẽ cho kết quả không chính xác. Thứ hai, quan sát đặc điểm hình thái của các loài có quan hệ gần gũi, đặc điểm bên ngoài giống nhau dễ dẫn tới nhầm lẫn.
Các đặc điểm hình thái thƣờng thay đổi theo từng giai đoạn phát triển, từng môi trƣờng và điều kiện sống dẫn đến khó xác định đƣợc loài. Cuối cùng, việc nhận diện và định danh loài yêu cầu chuyên môn cao trong lĩnh vực phân loại học [38, 53]. Hơn nữa, trứng và các loài sinh vật khi còn non không thể phân biệt dựa vào các đặc điểm nhƣ cá thể trƣởng thành. Đối với thực vật, một mẫu vật có thể dễ dàng xác định từ đặc điểm của hoa, trong khi rễ và các bộ phận thực vật khác không thể phân biệt.
Qua các nghiên cứu cho thấy số lƣợng các loài bị tuyệt chủng hàng năm đang tăng cao. Điều này có nghĩa rằng có rất nhiều loài thực vật và động vật bị mất mỗi năm, rất nhiều loài trong số này chƣa đƣợc xác định. Từ thực trạng trên cho thấy cần phải tạo ra một danh mục đa dạng sinh học cho các loài trƣớc khi chúng bị tuyệt chủng để phục cho các nghiên cứu đa dạng sinh học [25].