Ứng Dụng Phương Pháp Mã Vạch DNA Trong Kiểm Định Thành Phần Sản Phẩm Thảo Dược Giảo Cổ Lam

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp mã vạch DNA trong kiểm định thành phần chính của sản phẩm thảo dược giảo cổ lam, đảm bảo chất lượng và an toàn.

• Tác giả: Phan Thị My
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Xuân Bình
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Ứng Dụng Phương Pháp Mã Vạch DNA Trong Kiểm Định Thành Phần Chính Của Các Sản Phẩm Thảo Dược Từ Giảo Cổ Lam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA
• 2.2. Các tiêu chí để lựa chọn các trình tự để sử dụng làm DNA mã vạch và các điểm cần lưu ý khi tạo thư viện mã vạch
• 2.3. Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật
• 2.3.1. Mã vạch DNA ở động vật
• 2.3.2. Mã vạch DNA ở thực vật
• 2.4. Các sản phẩm thảo dược và những nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe người tiêu dùng
• 2.5. Các phương pháp chỉ thị sử dụng trong xác định nguyên liệu thảo dược
• 2.5.1. Phương pháp dựa trên chỉ thị phân tích giải phẫu học
• 2.5.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị hóa học
• 2.5.3. Phương pháp dựa vào chỉ thị DNA
• 2.6. Ưu điểm của phương pháp DNA mã vạch so với các phương pháp khác trong xác định nguyên liệu thảo dược
• 2.7. Lựa chọn và sử dụng vùng DNA mã vạch trong xác định các thành phần nguyên liệu thảo dược
• 2.8. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phương pháp DNA mã vạch trong kiểm định, đánh giá chất lượng các sản phẩm thảo dược trong nước và thế giới
• 2.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.8.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.1.3. Phạm vi nghiên cứu
• 3.1.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.1.4.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.1.4.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị, hóa chất nghiên cứu
• 3.2.1. Thiết bị nghiên cứu
• 3.2.2. Hóa chất nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 3.4.2. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 3.4.3. Phương pháp PCR
• 3.4.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.4.5. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide
• 3.4.6. Phương pháp so sánh trình tự gen đã tách được từ các sản phẩm với các trình tự DNA mã vạch
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu trà túi lọc, trà Giảo Cổ Lam khô và thuốc thảo dược dạng viên nén
• 4.2. Kết quả PCR khuếch đại gen rbcLa và ITS2
• 4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
• 4.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen rbcLa và ITS2
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Ứng Dụng Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam Hiện Nay

Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum) là một loại thảo dược quý, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Các sản phẩm từ Giảo Cổ Lam ngày càng phổ biến, từ trà túi lọc đến viên nén. Tuy nhiên, vấn đề kiểm tra chất lượng Giảo Cổ Lam và xác thực nguồn gốc trở nên cấp thiết. Các phương pháp truyền thống như cảm quan hay phân tích hóa học có nhiều hạn chế. Do đó, phương pháp mã vạch DNA nổi lên như một giải pháp hiệu quả, chính xác để xác thực Giảo Cổ Lam và đảm bảo chất lượng sản phẩm. Kỹ thuật này sử dụng các đoạn DNA đặc trưng để phân biệt các loài, kể cả khi chúng đã qua chế biến. Theo tổ chức y tế thế giới, sự pha trộn, thay thế các nguyên liệu thảo dược là một mối đe dọa lớn đến sự an toàn của người tiêu dùng vì họ không thể tự kiểm định được chất lượng của các sản phẩm họ đang dùng cho nên việc mua phải các loại sản phẩm không đảm bảo chất lượng là điều khó tránh được [34].

1.1. Giới Thiệu Về Phương Pháp Mã Vạch DNA Trong Dược Liệu

Mã vạch DNA là một kỹ thuật phân tích di truyền sử dụng các đoạn DNA ngắn, tiêu chuẩn để xác định và phân biệt các loài sinh vật. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong việc kiểm định dược liệu, nơi mà việc xác định chính xác thành phần là vô cùng quan trọng. Ưu điểm của phương pháp mã vạch DNA so với các phương pháp truyền thống là tính chính xác cao, khả năng áp dụng cho cả nguyên liệu đã qua chế biến và yêu cầu lượng mẫu nhỏ. Năm 2003, mã vạch DNA được đề xuất bởi Paul Hebert, đại học Guelph dùng như một đơn vị để phân loại loài [26,49]. Đây là một kỹ thuật sử dụng những vùng gen tiêu chuẩn để phân biệt các loài.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Kiểm Định Giảo Cổ Lam Bằng DNA

Việc kiểm định Giảo Cổ Lam bằng DNA giúp đảm bảo tính xác thực của sản phẩm, tránh tình trạng hàng giả, hàng kém chất lượng. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam được sử dụng cho mục đích sức khỏe. Ứng dụng mã vạch DNA trong dược liệu giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và nâng cao uy tín của các nhà sản xuất chân chính. Các sản phẩm thảo dược bày bán sẵn trên thị trường có thể bị nhiễm, bị thay thế bằng các loài cây khác hoặc có chứa các chất độn không được liệt kê trên nhãn của sản phẩm do sự nhầm lẫn hoặc cố ý.

II. Thách Thức Trong Xác Thực Giảo Cổ Lam Truyền Thống

Các phương pháp xác thực Giảo Cổ Lam truyền thống, như sử dụng các giác quan (vị, thị, khứu, xúc giác) hoặc phân tích hóa học (TLC, HPLC), đối mặt với nhiều thách thức. Sự khác biệt về hình thái giữa các loài Giảo Cổ Lam có thể rất nhỏ, gây khó khăn cho việc phân biệt. Hơn nữa, các yếu tố môi trường và quy trình chế biến có thể ảnh hưởng đến thành phần hóa học của dược liệu, dẫn đến kết quả không chính xác. Các phương pháp truyền thống dùng để nhận diện cây thuốc bao gồm các phương pháp cảm quan (xác định bằng các giác quan: Vị giác, thị giác, khứu giác, xúc giác) và phương pháp hóa học ví dụ như TLC, HPLC-UV, HPLC-MS [9, 49]. Mặc dù các phương pháp xác định bằng cảm quan có ưu điểm là đơn giản, song độ chính xác lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các thanh tra viên [45] hơn nữa sự khác biệt giữa các loài có liên quan hoặc các sản phẩm chế biến đôi khi không rõ ràng [28].

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Cảm Quan Trong Kiểm Tra Chất Lượng

Phương pháp cảm quan dựa trên kinh nghiệm và kỹ năng của người kiểm tra, do đó, tính chủ quan cao. Sự khác biệt nhỏ về màu sắc, mùi vị hoặc hình dạng giữa các loại Giảo Cổ Lam có thể bị bỏ qua. Ngoài ra, phương pháp này không thể áp dụng cho các sản phẩm đã qua chế biến sâu. Mặc dù các phương pháp xác định bằng cảm quan có ưu điểm là đơn giản, song độ chính xác lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các thanh tra viên [45] hơn nữa sự khác biệt giữa các loài có liên quan hoặc các sản phẩm chế biến đôi khi không rõ ràng [28].

2.2. Rào Cản Của Phân Tích Hóa Học Trong Xác Định Giảo Cổ Lam

Phân tích hóa học có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm điều kiện sinh trưởng của cây, thời điểm thu hoạch và quy trình chế biến. Các loài Giảo Cổ Lam khác nhau có thể chứa các thành phần hóa học tương tự, gây khó khăn cho việc phân biệt. Hơn nữa, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ cao. Phân tích hóa học có độ tin cậy cao hơn nhưng kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi các điều kiện sinh lý và sinh hóa của các loại thảo mộc. Các loài có chứa các thành phần hóa học tương đồng nên có thể nhầm lẫn .

III. Phương Pháp Mã Vạch DNA Giải Pháp Xác Thực Giảo Cổ Lam

Phương pháp mã vạch DNA cung cấp một giải pháp chính xác và đáng tin cậy để xác thực Giảo Cổ Lam. Kỹ thuật này dựa trên việc phân tích các đoạn DNA đặc trưng của loài, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường hay quy trình chế biến. Ứng dụng công nghệ sinh học trong kiểm định dược liệu giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng. Với sự tiến bộ của kĩ thuật di truyền, DNA marker trở thành một phương tiện thuận lợi cho việc nhận dạng các loài ở cấp độ nghiên cứu phân tử. DNA là một đại phân tử ổn định, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài, độ tuổi, điều kiện thu hoạch và được tìm thấy trong tất cả các mô của một cá thể, việc phân tích cũng chỉ cần một lượng mẫu nhỏ.

3.1. Quy Trình Phân Tích Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam Chi Tiết

Quy trình phân tích mã vạch DNA Giảo Cổ Lam bao gồm các bước chính: thu thập mẫu, chiết xuất DNA, khuếch đại đoạn DNA mục tiêu (ví dụ: rbcLa, ITS2) bằng PCR, giải trình tự DNA và so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu mã vạch DNA chuẩn. Kết quả so sánh sẽ cho biết mẫu có phải là Giảo Cổ Lam thật hay không và thuộc loài nào. Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự đoạn DNA mã vạch. Đầu tiên, một mẫu vật phải được thu gom và xác định bởi các nhà phân loại. Sau đó, một mẫu mô được lấy từ mẫu và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR và được giải trình tự để tạo ra một mã vạch.

3.2. Lựa Chọn Vùng DNA Mã Vạch Phù Hợp Cho Giảo Cổ Lam

Việc lựa chọn vùng DNA mã vạch phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác của kết quả. Các vùng gen như rbcLa và ITS2 thường được sử dụng trong kiểm định dược liệu vì chúng có độ biến đổi cao giữa các loài nhưng vẫn đủ ổn định để khuếch đại bằng PCR. Hai bên của các trình tự này là các vùng bảo tồn tiến hóa tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng các cặp...

3.3. Ưu Điểm Vượt Trội Của Mã Vạch DNA So Với Phương Pháp Khác

Mã vạch DNA có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, bao gồm tính chính xác cao, khả năng áp dụng cho cả nguyên liệu đã qua chế biến, yêu cầu lượng mẫu nhỏ và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Kỹ thuật này cũng cho phép phân biệt các loài Giảo Cổ Lam có quan hệ gần gũi. So với các phương pháp truyền thống, kỹ thuật mã vạch DNA cho kết chính xác hơn rất nhiều, mã vạch DNA cung cấp công cụ hữu ích và độc lập để bổ sung cho các phân tích hóa học trong việc xác định và đảm bảo chất lượng dược liệu [27].

IV. Ứng Dụng Mã Vạch DNA Trong Kiểm Định Sản Phẩm Giảo Cổ Lam

Ứng dụng mã vạch DNA trong kiểm định sản phẩm Giảo Cổ Lam mang lại nhiều lợi ích thiết thực. Kỹ thuật này giúp kiểm tra chất lượng Giảo Cổ Lam, xác định nguồn gốc xuất xứ, phát hiện hàng giả, hàng kém chất lượng và đảm bảo tính an toàn cho người tiêu dùng. Các sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam được kiểm định bằng mã vạch DNA sẽ có uy tín cao hơn trên thị trường. Hiện nay, đã có nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới ứng dụng phương pháp mã vạch DNA để xác định thành phần trong các sản phẩm thảo dược.

4.1. Nghiên Cứu Về Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam Trên Thế Giới

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh hiệu quả của mã vạch DNA trong việc xác thực Giảo Cổ Lam. Các nghiên cứu này đã sử dụng các vùng gen khác nhau để phân biệt các loài Giảo Cổ Lam và phát hiện các sản phẩm giả mạo. Các kết quả cho thấy mã vạch DNA là một công cụ mạnh mẽ để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .

4.2. Tình Hình Ứng Dụng Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, việc ứng dụng mã vạch DNA trong dược liệu còn khá mới mẻ. Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu bước đầu về mã vạch DNA Giảo Cổ Lam. Cần đẩy mạnh các nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật này để nâng cao chất lượng sản phẩm thảo dược và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về DNA mã vạch chủ yếu tập trung vào đánh giá đa dạng di truyền, nhận diện ở một số loài. Các ứng dụng của DNA mã vạch trong lĩnh vực dược phẩm chưa phát triển.

V. Kết Luận Tiềm Năng Phát Triển Của Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam

Phương pháp mã vạch DNA có tiềm năng lớn trong việc kiểm định sản phẩm Giảo Cổ Lam và các loại dược liệu khác. Việc áp dụng rộng rãi kỹ thuật này sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và thúc đẩy sự phát triển của ngành dược liệu Việt Nam. Cần có sự đầu tư và hỗ trợ từ các cơ quan chức năng để phát triển công nghệ mã vạch DNA và ứng dụng nó vào thực tiễn. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là kỹ thuật di truyền trong phân tích, đánh giá chất lượng các sản phẩm thảo dược để có thể tìm ra các loại sản phẩm kém chất lượng góp phần đảm bảo lợi ích cho người tiêu dùng là rất cần thiết.

5.1. Đề Xuất Giải Pháp Phát Triển Mã Vạch DNA Trong Dược Liệu

Để phát triển mã vạch DNA trong dược liệu, cần xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA chuẩn cho các loài dược liệu Việt Nam, đào tạo nguồn nhân lực có trình độ chuyên môn cao và đầu tư trang thiết bị hiện đại cho các phòng thí nghiệm. Đồng thời, cần có sự phối hợp chặt chẽ giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất và cơ quan quản lý để đảm bảo tính hiệu quả và bền vững của việc ứng dụng mã vạch DNA.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Mở Rộng Về Mã Vạch DNA Giảo Cổ Lam

Các hướng nghiên cứu mở rộng về mã vạch DNA Giảo Cổ Lam bao gồm việc tìm kiếm các vùng gen mã vạch mới có độ phân giải cao hơn, phát triển các phương pháp phân tích mã vạch DNA nhanh chóng và hiệu quả hơn, và ứng dụng mã vạch DNA để đánh giá chất lượng Giảo Cổ Lam trong các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong y học cổ truyền và hệ thống chăm sóc sức khỏe hiện đại, nhu cầu sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đang gia tăng nhanh chóng. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số thế giới dựa vào các sản phẩm thảo dược để bảo vệ sức khỏe và điều trị bệnh tật. Tại Việt Nam, nguồn tài nguyên thực vật phong phú cung cấp từ 30 đến 50 tấn nguyên liệu thảo dược mỗi năm cho tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, tuy nhiên mới chỉ có khoảng 200 loài cây dược liệu được khai thác và thương mại hóa. Trong số các loài được thương mại hóa phổ biến, Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), còn được gọi là "Jiao Gu Lan", "Nhân Sâm Năm Lá" hoặc "cây Bổ Đắng", giữ vai trò quan trọng. Dược liệu này đã được ghi chép trong cuốn "Compendium of Materia Medica" của tác giả Li Shi-Zhen xuất bản năm 1578 để trị đái ra máu, phù nề, khối u và các bệnh truyền nhiễm. Các phân tích hóa thực vật chỉ ra rằng trong Giảo Cổ Lam có hơn 165 saponin triterpene dammarane, flavonoid (vitamin P), chlorophyll và carotenoids, có hoạt tính hỗ trợ điều trị ung thư gan, đại trực tràng, tuyến tiền liệt, phổi và hỗ trợ tích cực trong điều trị đái tháo đường.

Tuy nhiên, thị trường các sản phẩm thảo dược chế biến sẵn (dưới dạng trà khô, trà túi lọc, viên nén) đang đối mặt với thực trạng gian lận thương mại, pha trộn nguyên liệu kém chất lượng hoặc thay thế bằng các loài thực vật khác không được kê khai trên nhãn. Các phương pháp giám định truyền thống dựa trên cảm quan (thị giác, khứu giác, vị giác) hoặc phân tích giải phẫu hình thái học bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng khi mẫu đã bị sấy khô, băm nhỏ, nghiền bột hoặc phối trộn phụ gia. Bên cạnh đó, các phương pháp chỉ thị hóa học như sắc ký lớp mỏng (TLC) hay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV, HPLC-MS) thường bị chi phối bởi điều kiện sinh thái, độ tuổi thu hái, quá trình sơ chế bảo quản, và khó phân biệt được các loài có quan hệ di truyền gần gũi sở hữu thành phần chuyển hóa tương đồng.

Trước thực tế đó, kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcoding) – phương pháp phân loại phân tử do Paul Hebert đề xuất năm 2003 sử dụng các đoạn trình tự nucleotide chuẩn, ngắn và bảo tồn – nổi lên như một công cụ giám định có độ đặc hiệu cao, không phụ thuộc vào trạng thái sinh lý hay hình thái của mẫu. Tại Việt Nam, phần lớn nghiên cứu mã vạch DNA trước đây chỉ tập trung vào đánh giá đa dạng di truyền học hoặc định danh loài hoang dã quý hiếm, chưa đi sâu vào kiểm định dược liệu thương phẩm. Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phan Thị My tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên tập trung giải quyết vấn đề này với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Tách chiết thu DNA tổng số từ các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô, mẫu trà túi lọc Giảo Cổ Lam và thuốc thảo dược dạng viên nén thương phẩm.
2. Thực hiện phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại thành công hai vùng gen mã vạch rbcLa và ITS2 từ DNA khuôn đã thu nhận.
3. Giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR, sử dụng dữ liệu trình tự thu được để phân tích tin sinh học, từ đó kiểm định thành phần chính và đánh giá mức độ tạp nhiễm của các sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam trên thị trường.

• Đối tượng nghiên cứu: 12 mẫu sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam, bao gồm:
  • 05 mẫu trà túi lọc thương phẩm có nhãn hiệu: Trà Giảo Cổ Lam Tuệ Linh (TL1), Giảo Cổ Lam Tân Cương - Hoàng Bình (TL2), Trà thảo dược Giảo Cổ Lam SaPa (TL3), Trà dưỡng sinh Tin Tin Tea-One (TL4), Trà Giảo Cổ Lam Extra (TL5).
  • 01 mẫu trà Giảo Cổ Lam sấy khô thương phẩm đóng túi hút chân không 300g của Công ty TNHH Tuệ Linh (TK1).
  • 01 mẫu thuốc thảo dược dạng viên bao phim Giảo Cổ Lam Extra của Công ty TNHH Tuệ Linh (30 viên/hộp).
  • 05 mẫu trà Giảo Cổ Lam khô không có nhãn mác, xuất xứ (TK2 đến TK6), được băm nhỏ đóng gói trong bao bì nilon, thu mua tại các hiệu thuốc đông y, tây y trên địa bàn thành phố Thái Nguyên (Hiệu thuốc Thành Lịch, Hải Mai, 642, và các điểm kinh doanh tại phường Trưng Vương).
• Phạm vi và thời gian nghiên cứu: Đề tài thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Kỹ thuật Di truyền – Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, trong thời gian từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và lựa chọn chỉ thị mã vạch DNA

Mã vạch DNA là chuỗi nucleotide ngắn (khoảng 400–800 bp) nằm ở vị trí xác định trong hệ gen. Tiêu chí chọn vùng mã vạch bao gồm: hiện diện phổ biến ở nhóm phân loại lớn, tỷ lệ tương đồng giữa các loài đạt khoảng 70% song chứa khoảng 30% sai khác để khuếch biệt các loài thân thuộc, và hai đầu là các vùng bảo tồn cao cho phép gắn các cặp mồi phổ thông.

Đối với thực vật bậc cao, do hệ gen ty thể có tốc độ đột biến quá thấp nên không áp dụng được đoạn gen CO1 như ở động vật. Do đó, nghiên cứu phối hợp một locus thuộc hệ gen lục lạp (cpDNA) và một locus thuộc hệ gen nhân:

• Gen rbcL (rbcLa): Nằm trên DNA lục lạp mã hóa cho tiểu đơn vị lớn của enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. Vùng này có tính phổ biến cao, dễ khuếch đại thành công trên nhiều nhóm thực vật và cho phép phân biệt nguyên liệu chính thức với các chất thay thế giả mạo.
• Vùng ITS2: Đoạn phiên mã nội bộ thứ hai (Internal Transcribed Spacer 2) của DNA ribosome hạt nhân, nằm liền kề vùng bảo tồn 5.8S rRNA và được bao bọc bởi vùng bảo tồn của gen 18S và 26S rRNA. Vùng này có tốc độ tiến hóa nhanh, mức độ biến dị cao giữa các loài thực vật có quan hệ gần, phù hợp để phân tích các mẫu dược liệu bị pha tạp.

Thông tin về các cặp mồi được tác giả sử dụng như sau:

Tên mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Nhiệt độ nóng chảy Tm (°C)	Kích thước dự kiến (bp)	Tài liệu thiết kế
ITS2-S2F	ATGCGATACTTGGTGTGAAT	51,9	273 – 659	Shilin Chen et al.
ITS2-S3R	GACGCTTCTCCAGACTACAAT	54,2	273 – 659	Shilin Chen et al.
rbcLa-F	ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC	57,2	273 – 659	Levin, Kress & Erickson
rbcLa-R	GTAAAATCAAGTCCACCRCG	52,8	273 – 659	Levin, Kress & Erickson

(Ghi chú: Ký tự R đại diện cho nucleotide thoái hóa A hoặc G).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Khóa luận sử dụng các phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực:

• Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Dựa trên phương pháp đệm CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium Bromide) truyền thống của Dellaporta et al. (1983) và Doyle (1987, 1990), kết hợp biến tính protein bằng dung dịch CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol tỉ lệ 24:1), kết tủa bằng Isopropanol và rửa tủa bằng Ethanol. Tác giả đã tiến hành thử nghiệm và sửa đổi các thông số kỹ thuật (thời gian ủ, lực ly tâm, nhiệt độ kết tủa, hút chân không) đối với từng dạng mẫu thảo dược.
• Phương pháp quang phổ và điện di kiểm tra DNA: Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được đánh giá bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 qua tỷ số độ hấp thụ $OD_{260}/OD_{280}$ (chuẩn tinh sạch đạt 1,8 – 2,0). Chất lượng và tính toàn vẹn của DNA được kiểm tra qua điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TBE 0,5X, nhuộm Ethidium Bromide và chụp ảnh huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống Gel Logic 1500 (Kodak).
• Phương pháp PCR khuếch đại gen: Phản ứng PCR thực hiện với thể tích 15 µl, thành phần gồm: 7,5 µl PCR Mastermix 2X; 1 µl DNA khuôn; 0,75 µl DMSO (hỗ trợ mở chuỗi); 2 µl primer (F+R); 3,75 µl $dH_2O$. Chu trình nhiệt được cài đặt riêng cho từng locus trên máy PCR Applied Biosystems.
• Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng bộ kit chuyên dụng PCR quick-Spin™ thông qua cột silica để loại bỏ mồi dư, enzyme và dNTPs trước khi đọc trình tự.
• Phương pháp giải trình tự nucleotide và phân tích tin sinh: Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo nguyên lý ngắt chuỗi Sanger (dideoxynucleotide - ddNTPs gắn huỳnh quang) trên hệ thống điện di mao quản tự động tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự nucleotide sau đó được kiểm tra giá trị chất lượng (Quality Value - QV), căn chỉnh qua phần mềm Vector NTI và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI bằng công cụ BLAST.

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ việc bảo vệ quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng trước nguy cơ dược liệu bị làm giả, pha tạp chất độn. Xác định mục tiêu trọng tâm là ứng dụng mã vạch DNA (rbcLa, ITS2) để kiểm tra sự hiện diện của Giảo Cổ Lam trong các sản phẩm đã qua chế biến, khẳng định ý nghĩa khoa học trong việc đặt nền móng ứng dụng sinh học phân tử vào kiểm định dược liệu tại Việt Nam.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện các công trình lý thuyết và thực tiễn liên quan:

• Lịch sử hình thành công nghệ mã vạch DNA từ đề xuất năm 2003 của Paul Hebert với gen CO1 ở động vật, phân tích nguyên nhân CO1 không phù hợp với thực vật và sự thống nhất của Plant Working Group (PWG) trong việc phối hợp các locus rbcL, matK, ITS/ITS2, psbA-trnH.
• Đánh giá ưu thế vượt trội của DNA barcoding so với phân tích giải phẫu thực vật và các chỉ thị hóa sinh (protein, enzyme, TLC, HPLC).
• Đánh giá các chỉ thị DNA khác (RAPD, SSR, RFLP, AFLP) và chỉ ra hạn chế của chúng trong phân tích mẫu dược liệu thương phẩm đã suy biến.
• Khảo cứu các công trình quốc tế về kiểm định thảo dược: nghiên cứu của Stoeckle (2011) trên các sản phẩm trà thương phẩm (phát hiện 59% mẫu chứa DNA loài không ghi trên nhãn); nghiên cứu của Newmaster et al. (2012) tại Bắc Mỹ trên 44 sản phẩm thảo dược thuộc 12 công ty (phát hiện hiện tượng thay thế nguyên liệu xảy ra ở 30/44 sản phẩm, chỉ có 2/12 công ty đạt chuẩn); nghiên cứu năm 2013 kiểm định sản phẩm viên nang, viên nén từ cây Hypericum perforatum.
• Tổng quan các nghiên cứu mã vạch DNA tại Việt Nam: các công bố của Trần Hoàng Dũng et al. (2014) về chi củ mài (Dioscorea), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis), lan hài, nấm Linh chi (Ganoderma), chó Phú Quốc (CO1), và nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) trên chi Đảng Sâm (Codonopsis).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết 12 mẫu nghiên cứu với đầy đủ thông tin xuất xứ, nhà sản xuất và địa chỉ thu mua. Trình bày chi tiết danh mục thiết bị, công thức dung dịch hóa chất tách chiết (đệm CTAB, dung dịch ly trích đồng nhất mẫu viên nén, đệm TE 10:0.1, đệm TBE 0,5X). Quy định 4 nội dung nghiên cứu logic và mô tả tường minh quy trình kỹ thuật từ tách chiết mẫu thô đến phân tích bioinformatic.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Đây là chương thực nghiệm trọng tâm, bao gồm:

• Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ các dạng mẫu phức tạp (trà khô, trà túi lọc, viên nén).
• Phân tích hiệu quả khuếch đại gen bằng PCR với hai cặp mồi rbcLa và ITS2.
• Đánh giá sản phẩm sau tinh sạch và kết quả điện di kiểm tra.
• Phân tích chất lượng đồ thị giải trình tự Sanger (dựa trên giá trị Quality Value - QV), phát hiện các đoạn tín hiệu nhiễu, hiện tượng chồng đỉnh do tạp nhiễm DNA từ các loài có quan hệ gần hoặc các loài thực vật ngoại lai.
• So sánh tỷ lệ tương đồng chuỗi nucleotide với ngân hàng gen NCBI qua công cụ BLAST để đưa ra kết luận về thành phần loài của từng sản phẩm.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả kỹ thuật đạt được về quy trình tách chiết, khả năng nhân bản phân tử của hai đoạn gen mã vạch, đưa ra kết luận về mức độ trung thực của nhãn mác sản phẩm và đề xuất các giải pháp hoàn thiện quy trình kiểm định dược liệu thương phẩm bằng công nghệ gen.

---

Kết quả và đóng góp thực tiễn

Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu thảo dược đã chế biến

Nguyên liệu thảo dược chế biến (sấy khô, ủ lên men, nghiền nát, phối trộn tá dược) thường làm DNA bị đứt gãy mạnh và tích tụ nhiều hợp chất thứ cấp gây ức chế phản ứng sinh hóa (polysaccharides, polyphenol, hợp chất màu). Khi áp dụng quy trình CTAB gốc của Dellaporta và Doyle, tác giả chỉ tách được DNA ở 3/6 mẫu trà khô với băng điện di mờ nhạt và đứt gãy nhiều. Tác giả đã tiến hành điều chỉnh đồng bộ các thông số kỹ thuật:

Thông số kỹ thuật	Quy trình chưa sửa đổi	Quy trình sửa đổi, bổ sung của tác giả
Thời gian ủ mẫu với đệm	1 giờ	1 giờ 30 phút
Số lần ly tâm thu pha trên	1 lần	2 lần
Thời gian ly tâm thu pha trên	10 phút	20 phút (lần 1), 10 phút (lần 2)
Nhiệt độ và thời gian ủ kết tủa	-20°C trong 1 giờ	-50°C trong 2 giờ
Thời gian ly tâm thu kết tủa	6 phút	15 phút
Điều kiện làm khô kết tủa	Để khô ở nhiệt độ phòng	Làm khô trong máy hút chân không

Sau khi sửa đổi, kết quả điện di cho thấy các băng DNA tổng số sáng rõ ở toàn bộ các đường chạy (mẫu 1' đến 6'), lượng DNA thu hồi tăng vượt bậc, đáp ứng yêu cầu làm khuôn cho phản ứng PCR dù vẫn còn hiện tượng đứt gãy sinh học do quá trình chế biến nhiệt trước đó.

Hiệu quả khuếch đại PCR và giải trình tự gen mã vạch

• Khuếch đại phân tử: Hai cặp mồi rbcLa và ITS2 đều khuếch đại thành công các đoạn gen mục tiêu với kích thước nằm trong khoảng dự kiến (273 – 659 bp). Cả mẫu trà khô và mẫu trà túi lọc đều cho sản phẩm PCR đặc hiệu sau khi tinh sạch bằng cột silica PCR quick-Spin™. Đối với mẫu thuốc viên nén bao phim, mức độ thu hồi DNA và khuếch đại gen gặp khó khăn hơn do mẫu chứa nhiều tá dược bao phim và chất độn công nghiệp.
• Kết quả giải trình tự và kiểm tra tín hiệu (QV): Tín hiệu giải trình tự từ Macrogen phản ánh sự khác biệt rõ rệt giữa các dạng sản phẩm:
  • Mẫu trà túi lọc số 1 (Tuệ Linh) cho tín hiệu đồ thị giải trình tự sắc nét, giá trị QV cao, kết quả BLAST đoạn rbcLa đạt độ tương đồng tuyệt đối với trình tự Gynostemma pentaphyllum chuẩn trên GenBank.
  • Mẫu trà túi lọc số 2 xuất hiện nhiều vùng tín hiệu bị nhiễu do chất lượng khuôn suy giảm hoặc có sự can thiệp của chất ức chế.
  • Mẫu trà túi lọc số 4 (Tin Tin Tea-One) và mẫu trà khô số 6 bộc lộ hiện tượng chồng đỉnh huỳnh quang rõ rệt trên biểu đồ điện di mao quản. Phân tích tin sinh học chỉ ra mẫu trà khô số 6 bị tạp nhiễm bởi DNA của các loài thực vật có quan hệ gần gũi, trong khi mẫu túi lọc số 4 xuất hiện sự hiện diện của các chuỗi DNA thuộc về các loài thực vật hoàn toàn khác không được công bố trên thành phần bao bì.

Đóng góp thực tiễn

Khóa luận đã chứng minh phương pháp mã vạch DNA kết hợp hai locus rbcLa và ITS2 có khả năng ứng dụng thực tế để phát hiện gian lận thương mại và tạp nhiễm thực vật trong các sản phẩm trà Giảo Cổ Lam tại Việt Nam. Nghiên cứu cung cấp quy trình tách chiết CTAB cải tiến phù hợp với mẫu mô thực vật khô đã qua chế biến, đóng góp dẫn liệu thực nghiệm quan trọng cho việc xây dựng quy chuẩn kiểm định chất lượng thảo dược bằng kỹ thuật di truyền.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Phạm vi thu thập mẫu khảo sát còn hẹp, chủ yếu tập trung tại các điểm kinh doanh dược liệu trên địa bàn thành phố Thái Nguyên, chưa đại diện cho toàn bộ các sản phẩm Giảo Cổ Lam trên phạm vi cả nước.
  • Phương pháp giải trình tự chuỗi trực tiếp Sanger bộc lộ nhược điểm cố hữu khi phân tích các mẫu hỗn hợp phức tạp: khi mẫu bị phối trộn nhiều loài thực vật (như trà túi lọc nhiều thành phần hoặc mẫu tạp nhiễm nặng), phản ứng giải trình tự trực tiếp sẽ tạo ra các đỉnh tín hiệu chồng chéo, gây khó khăn cho việc định danh chính xác từng loài nếu không tiến hành tách dòng (cloning) trước đó.
  • Hiệu suất thu hồi DNA từ dạng bào chế viên nén bao phim còn thấp do tác động của nhiệt độ nén viên và hệ tá dược phức tạp.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS / DNA metabarcoding) để có thể đọc đồng thời hàng triệu đoạn mã vạch, giúp định danh định lượng chính xác toàn bộ các thành phần loài có trong một túi trà hỗn hợp mà không cần tách dòng.
  • Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện dung dịch ly giải và quy trình loại bỏ tá dược để nâng cao hiệu suất thu nhận DNA từ các dạng bào chế sâu như cao khô, viên nén, viên nang thảo dược.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị tham khảo cao đối với:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Dược học, Công nghệ Thực phẩm: Nắm bắt được quy trình thực nghiệm từ khâu xử lý mẫu mô chế biến, kỹ thuật tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến, tối ưu hóa thông số PCR đến các thao tác xử lý dữ liệu tin sinh học (BLAST, Vector NTI).
• Các phòng kiểm nghiệm dược liệu và quản lý thị trường: Tham khảo phương pháp luận khoa học và các điều kiện kỹ thuật của cặp mồi rbcLa và ITS2 để áp dụng vào thực tế kiểm tra tính xác thực của các sản phẩm thảo dược lưu thông thương mại, phân biệt dược liệu thật và các loài giả mạo, tạp nhiễm.
• Phần giá trị nhất: Quy trình cải tiến các bước tách chiết CTAB (Bảng các thông số thay đổi) và chu trình nhiệt chuẩn của phản ứng PCR khuếch đại hai locus rbcLa và ITS2 được trình bày chi tiết, có thể tái lập trực tiếp trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác giả sử dụng những cặp mồi nào để khuếch đại các vùng gen mã vạch trong nghiên cứu này?
Tác giả sử dụng hai cặp mồi: mồi nhân bản đoạn gen nhân ITS2 gồm ITS2-S2F (5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3', Tm 51,9°C) và ITS2-S3R (5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3', Tm 54,2°C) dựa theo thiết kế của Shilin Chen et al.; mồi nhân bản đoạn gen lục lạp rbcLa gồm rbcLa-F (5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3', Tm 57,2°C) và rbcLa-R (5'-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3', Tm 52,8°C) dựa theo nghiên cứu của Levin, Kress & Erickson. Kích thước sản phẩm khuếch đại nằm trong khoảng 273 – 659 bp.

2. Tác giả đã thực hiện những thay đổi kỹ thuật cụ thể nào trong quy trình CTAB để tách chiết thành công DNA từ mẫu trà khô?
Tác giả đã nâng thời gian ủ mẫu với đệm CTAB từ 1 giờ lên 1 giờ 30 phút; tăng số lần ly tâm thu pha trên từ 1 lần (10 phút) lên 2 lần (lần 1 ly tâm 20 phút, lần 2 ly tâm 10 phút); hạ nhiệt độ và kéo dài thời gian ủ kết tủa từ -20°C trong 1 giờ xuống -50°C trong 2 giờ; tăng thời gian ly tâm thu tủa từ 6 phút lên 15 phút; và chuyển từ làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng sang làm khô bằng máy hút chân không.

3. Nghiên cứu đã khảo sát những nhóm sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam nào và thu thập từ đâu?
Nghiên cứu khảo sát 12 mẫu thuộc 3 nhóm: 05 mẫu trà túi lọc thương mại (Tuệ Linh, Tân Cương - Hoàng Bình, SaPa, Tin Tin Tea-One, Extra); 01 mẫu trà sấy khô đóng gói hút chân không 300g của Tuệ Linh; 01 mẫu thuốc viên bao phim Giảo Cổ Lam Extra; và 05 mẫu trà Giảo Cổ Lam khô băm nhỏ không nhãn mác đóng gói nilon (TK2 đến TK6). Các mẫu được thu thập tại các hiệu thuốc đông y, tây y và cửa hàng dược liệu tại thành phố Thái Nguyên (đường Lương Ngọc Quyến, Dương Tự Minh, Trưng Vương, Tân Lập, Tân Thịnh).

4. Dữ liệu giải trình tự Sanger đã ghi nhận những hiện tượng bất thường nào về chất lượng các mẫu trà trên thị trường?
Phân tích đồ thị giải trình tự qua giá trị QV và đối chiếu BLAST cho thấy: trong khi mẫu trà túi lọc Tuệ Linh (TL1) đạt độ tương đồng chuẩn xác với trình tự Gynostemma pentaphyllum trên ngân hàng gen, thì mẫu trà túi lọc số 2 bị nhiễu tín hiệu mạnh; mẫu trà túi lọc số 4 (Tin Tin Tea-One) xuất hiện hiện tượng chồng đỉnh huỳnh quang do tạp nhiễm DNA từ các loài thực vật khác nhau; và mẫu trà Giảo Cổ Lam khô không nhãn mác số 6 bị lẫn tạp DNA của các loài thực vật có quan hệ phân loại gần gũi.

5. Vì sao nghiên cứu lại phối hợp cả hai vùng gen rbcLa và ITS2 thay vì chỉ sử dụng một locus đơn lẻ?
Theo các nghiên cứu của Nhóm Công tác Cây trồng (PWG) và các tác giả đi trước, ở thực vật không tồn tại một locus mã vạch đơn lẻ nào đáp ứng toàn diện mọi tiêu chí định danh như gen CO1 ở động vật. Do đó, việc kết hợp đa locus là bắt buộc: vùng rbcLa thuộc hệ gen lục lạp có tính phổ biến cao, chuỗi bảo tồn giúp dễ dàng khuếch đại thành công để phân biệt dược liệu với loài giả mạo; trong khi vùng ITS2 thuộc hệ gen nhân có tốc độ biến dị cao, cung cấp độ phân giải phân tử sâu để khuếch biệt các loài thân thuộc và đánh giá mức độ tạp nhiễm.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Phan Thị My đã ứng dụng thành công kỹ thuật mã vạch DNA trên hai đoạn gen rbcLa và ITS2 để kiểm định chất lượng các sản phẩm thảo dược Giảo Cổ Lam thương phẩm. Nghiên cứu đã tối ưu hóa hiệu quả quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB cải tiến đối với các dạng mẫu dược liệu đã qua chế biến phức tạp. Kết quả giải trình tự và phân tích tin sinh học đã chứng minh khả năng phát hiện chính xác thành phần loài chuẩn thức cũng như vạch trần các hiện tượng tạp nhiễm thực vật trong các sản phẩm lưu thông trên thị trường, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm tin cậy cho công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu bằng công nghệ sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Các cây thuốc thảo dƣợc đã đƣợc sử dụng từ rất lâu đời trong nền y học cổ truyền. Hiện nay, thuốc thảo dƣợc vẫn đƣợc sử dụng nhiều trong việc chữa trị bệnh. Với xu hƣớng của cuộc sống ngày càng hài hòa cùng thiên nhiên, việc sử dụng các nguyên liệu thảo dƣợc để bảo vệ sức khỏe và điều trị bệnh ngày càng gia tăng. Hàng ngàn loài thực vật và động vật có đặc tính dƣợc lý đƣợc dùng làm nguyên liệu thuốc [28].

Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. Theo thống kê của Bộ y tế mỗi năm Việt Nam tiêu thụ khoảng 30 - 50 tấn nguyên liệu thảo dƣợc để sử dụng trong y học cổ truyền và xuất khẩu ra nƣớc ngoài. Các loài cây thảo dƣợc có thể dùng trực tiếp làm tác nhân điều trị hoặc làm nguyên liệu ban đầu cho quá trình tổng hợp các loại thuốc. Hiện nay, ở Việt Nam mới chỉ khai thác sử dụng khoảng 200 loại cây dƣợc liệu [1], trong đó có một số loài đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng các sản phẩm thảo dƣợc nhƣ Sâm Ngọc Linh, trà Tam Thất Xạ Đen, trà Giảo Cổ Lam, trà Nấm Linh Chi.Các sản phẩm thảo dƣợc ngày càng đa dạng với các hình thức mẫu mã, nhãn hiệu khác nhau và có thể chứa duy nhất một thành phần hoặc là sự kết hợp của nhiều thành phần.

Việc liệt kê chính xác các thành phần của các sản phẩm thảo dƣợc là rất quan trọng đối với ngƣời tiêu dùng, song các thành phần đó không thể dễ dàng xác định bằng hình thức trực quan [32]. Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại cây thuốc dân gian và trà thảo dƣợc ở các nƣớc châu Á bao gồm Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [50]. Giảo Cổ Lam còn có nhiều tên gọi khác, trong tiếng Trung gọi là "Jiao Gu Lan", trong tiếng anh đƣợc gọi là Nhân Sâm Năm Lá, ở Việt Nam thƣờng gọi là Giảo Cổ Lam hoặc cây Bổ Đắng. Trong cuốn "Compendium of Materia Media" của tác giả Li Shi – Zhen xuất bản năm 1578 đã nói đến Giảo Cổ Lam đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh 2 nhƣ đái ra máu, phù nề ở họng và cổ, khối u, các chấn thƣơng…Ngƣời ta cũng sử dụng Giảo Cổ Lam để điều trị các bệnh cảm lạnh thông thƣờng và các bệnh truyền nhiễm khác [38].

Hình ảnh Giảo Cổ Lam mọc ngoài tự nhiên và quả Giảo Cổ Lam ( Nguồn ảnh : NaturalyPure.com) Trong cây Giảo Cổ Lam có chứa nhiều hoạt chất quý bao gồm saponin, flavonoid, chlorophyll, và carotenoids. Trong đó, saponin và flavonoid đƣợc cho là chịu trách nhiệm chính cho tính chất của Giảo Cổ Lam. Hơn 165 saponin triterpene dammarane đã đƣợc xác định từ Giảo Cổ Lam. Flavonoids, còn đƣợc gọi là vitamin P.

Saponin và flavonoids từ Giảo Cổ Lam có vai trò quan trọng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thƣ, bao gồm ung thƣ gan, đại trực tràng, tuyến tiền liệt và ung thƣ phổi, điều trị các bệnh bạch cầu, glioma, miệng, lƣỡi, thực quản [50], ngoài ra Giảo Cổ Lam còn có tác dụng rất tích cực trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đƣờng [23]. Phần lớn các báo cáo chủ yếu tập trung vào hiệu quả của các saponin hơn là các flavonoid [50]. Hiện nay, Giảo Cổ Lam đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng trà thảo dƣợc ở Hoa Kỳ và nhiều nƣớc Châu Á khác nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [23, 50]. Các sản phẩm thảo dƣợc bày bán sẵn trên thị trƣờng có thể bị nhiễm, bị thay thế bằng các loài cây khác hoặc có chứa các chất độn không đƣợc liệt kê trên nhãn của sản phẩm do sự nhầm lẫn hoặc cố ý.