MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cà chua (Solanum lycopersicum) là một phần quan trọng trong sự đa dạng và cân bằng mỗi bữa ăn hàng ngày của con người. Nó đứng đầu trong số các loại trái cây và rau quả như một nguồn cung cấp vitamin A, C, khoáng chất cần thiết và các chất dinh dưỡng khác. Ngoài ra, cà chua tươi và đã qua chế biến có thể bảo vệ tế bào khỏi các chất oxy hóa có liên quan đến ung thư (Foolad, 2007).
Do đó, chọn tạo giống nhằm tăng năng suất và chất lượng cà chua là một trong những vấn đề được quan tâm từ lâu đời. Hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) lần đầu tiên được quan sát vào năm 1987 (Liu et al., 2017), cho đến nay, nó giúp các nhà nghiên cứu gia tăng khả năng thiết kế và thay đổi bộ gen là mục tiêu cho các nghiên cứu gen chức năng cũng như các yếu tố di truyền. Hệ thống này ngày càng được sử dụng rộng rãi đã chứng minh lợi ích của nó trong việc tạo ra sự thay đổi và khả năng giải quyết các vấn đề cơ bản về sinh học, y học và các kĩ thuật có liên quan đến nông nghiệp khác (Bassett and Liu, 2014). Với bộ máy hoạt động đơn giản thích hợp cho các phòng thí nghiệm nghiên cứu cơ bản, công nghệ này giúp giảm tới 90% chi phí và thời gian, hơn nữa còn đem lại hiệu quả cao, tạo ra những thay đổi có thể dự đoán và quản lý.
Có được điều này là nhờ hai thành phần chính của hệ thống bao gồm RNA dẫn đường và enzyme Cas9, RNA dẫn đường Cas9 đi tới gen đích và tiến hành chỉnh sửa tạo đột biến ngẫu nhiên (Bassett and Liu, 2014; Lee et al., 2018; Liu et al. Cho đến nay, nhiều loại cây trồng quan trọng trong nông nghiệp đã được thử nghiệm và thành công trong việc tạo đột biến mục tiêu như lúa gạo (Endo et al., 2016; Mikami et al., 2015), cây ngô (Char et al., 2017), khoai tây (Wang et al., 2015), cây bông (Chen et al. Trong đó, cà chua cũng là một loại cây tiềm năng cho ứng dụng này (Yu et al. Tuy nhiên, những năm gần đây, rất nhiều nghiên cứu tập trung vào thử nghiệm hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen ở các tiểu bào tử là các tế bào đơn bội bởi nhiều lợi thế đáng kể mà chúng có thể đem lại.
Chúng có khả năng tạo thể lưỡng bội và tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp (Pankaj Bhowmik 1, 2018). Chúng không yêu cầu việc tái sinh qua nhiều thế hệ, từ đó có thể tiết kiệm thời gian và chi phí (Woo et al. Đặc biệt, thông qua các tiểu bào tử có thể tránh sản sinh cây chimeric - cây mang các mô chứa hai hay nhiều quần thể tế bào khác biệt về mặt di truyền, từ đó tạo ra các đột biến không pha trộn. Nó còn có thể được ứng dụng để tạo cây mang những tính trạng tối ưu nhưng không phải là cây chuyển gen và thích hợp cho các loài thực vật có sinh sản vô tính.
Hơn nữa, sinh sản là một quá trình quan trọng trong chu kì sống của thực vật, là kết quả trong việc kết tinh hạt, hình thành quả (Sato et al., 2006) và duy trì nòi giống. Trong quá trình này, hạt phấn đóng vai trò không thể thiếu đối với thực vật hạt kín nói chung cũng như cà chua nói riêng. Để cải thiện chất lượng cà chua bằng phương pháp chỉnh sửa gen mà không ảnh hưởng đến toàn bộ bộ gen cây trồng, chúng tôi tập trung nghiên cứu và xây dựng vector hoạt động đặc thù ở hạt phấn. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến trên phấn hoa cà chua”.
GIẢ THIẾT KHOA HỌC Hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng chỉnh sửa thông tin di truyền trên gen mục tiêu Alcohol dehydroganase đặc hiệu ở phấn hoa cà chua. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạo hệ thống chỉnh sửa genome trên phấn hoa cà chua sử dụng công cụ CRISPR/Cas9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng vật liệu là dòng cà chua CLN1621, các dòng vi khuẩn E. Coli và Agrobacterium tumefaciens liên quan đến biến nạp thực vật.
Quy mô phòng thí nghiệm là phòng nuôi cấy mô và sinh học phân tử tại Trung tâm Rau Thế giới. Ý NGHĨA KHOA HỌC Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được thiết kế và thử nghiệm thành công trên cà chua nói chung cũng như trên gen Alcohol dehydrogenase nói riêng chứng minh tính hiệu quả trong chỉnh sửa genome của hệ thống này. Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để áp dụng công cụ này trong công cuộc cải cách hệ gen cây trồng, tạo thế hệ cây trồng mới mang tính trạng tối ưu nhưng không phải là cây chuyển gen. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CÀ CHUA 2. Nguồn gốc Bằng chứng di truyền cho thấy cà chua được tiến hóa từ một loài cây nhỏ, quả màu xanh, phổ biến ở vùng cao nguyên Peru (Cox, 2000). Loài cà chua được thuần hóa đầu tiên là trái cây màu vàng, được trồng bởi người Aztec tại miền Trung Mexico. Sau đó, cây cà chua được trồng và sử dụng phổ biến ở miền Nam Mexico.
Do đó, cà chua được kết luận có nguồn gốc từ Châu Mỹ. Phân loại Hệ thống phân loại thực vật của cây cà chua Giới Plantae Thực vật Ngành Eudicots Thực vật hai lá mầm Nhánh Asterids Nhánh Cúc Bộ Solanales Bộ Cà Họ Solanaceae Họ Cà Phân họ Solanoideae Solanoideae Chi Solanum Chi Cà Loài S. lycopersicum Cà chua Nguồn: http://plants. Giá trị dinh dưỡng Cà chua chứa nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho cơ thể như vitamin, carotene, lycopene và kali.
Đặc biệt, vitamin B, vitamin C và beta-carotene giúp cơ thể chống lại quá trình lão hóa, giảm thiểu nguy cơ tử vong do các bệnh liên quan tới tim mạch và ung thư. Cụ thể, cà chua cung cấp khoảng 40% nhu cầu vitamin C hàng ngày. Đây là một chất chống oxy hóa tự nhiên, ngăn ngừa các gốc tự do gây ung thư làm hư hại hệ thống của cơ thể. Kali đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức khỏe hệ thần kinh (Bugel, 2003; Caroline Bolton-Smith et al., 2007), cần thiết cho kiểm 3 soát sự đông máu (Palomo et al.
Vitamin A, có trong cà chua, giúp cải thiện thị lực, phòng ngừa thoái hóa điểm vàng. Vitamin A cũng là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ được hình thành từ sự dư thừa của beta-carotene trong cơ thể. Nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu quả của cà chua đối với các bệnh mãn tính, ung thư liên quan tới tuyến tiền liệt, ung thư vú, phổi và dạ dày (Giovannucci, 1999, 2002; Sato et al. Ngoài ra, cà chua đem lại hiệu quả trong việc duy trì sức khỏe răng, xương, tóc và da.
Việc sử dụng nước ép cà chua còn được biết đến để chữa cháy nắng nghiêm trọng và chống lại ảnh hưởng của tia UV (Aust et al., 2005; Stahl et al. NGHIÊN CỨU VỀ CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG Chọn giống cây trồng là một phần quan trọng của nông nghiệp với mục đích nâng cao năng suất cũng như cải tiến chất lượng cây trồng, giúp cây trồng chống chịu lại những điều kiện bất lợi của môi trường như nhiệt độ, úng, hạn hay sâu bệnh. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, sự thay đổi của môi trường và sự tiến hóa của sâu bệnh côn trùng, cây trồng cũng đã có những cải tiến thích hợp được hình thành nhờ thực tiễn trồng trọt qua hàng ngàn năm. Phương pháp lai Lai là phương pháp nhằm kết hợp những đặc trưng, đặc tính của bố mẹ vào cơ thể mới, là phương pháp quan trọng để tái tổ hợp các kiểu gen của bố mẹ nhằm tạo ra tổ hợp mới, từ đó lựa chọn, bồi dưỡng để tạo ra giống cây trồng mang tính trạng tối ưu.
Theo Darwin, lai là sự giao phối giữa các loài khác nhau nhưng theo trường phái Mendel – Morgan cho rằng lai giống là phương tiện để tạo nên tổ hợp mới, là sự giao phối giữa hai cơ thể có kiểu gen khác nhau, còn giao phối giữa hai cá thể khác nhau trong hệ thuần không phải là lai vì kiểu gen của các cơ thể tham gia là đồng nhất về mặt di truyền, tạo ra cá thể mới không thay đổi so với bố mẹ. Học phái Mendel – Morgan chỉ công nhận có giống lai hữu tính mà không công nhận có giống lai vô tính. Tuy vậy, học phái Mitsurin công nhận có cả lai hữu tính và lai vô tính. Ngày nay, nhiều hiện tượng di truyền mới đã được khám phá, đặc biệt là hiện tượng di truyền tế bào chất làm sáng tỏ thêm cơ sở lý luận của lai vô tính.
Một trong những ứng dụng thành công của phương pháp lai tạo là sử dụng 4 ưu thế lai, là hiện tượng cơ thể lai F1 có sức sống cao hơn, sinh trưởng nhanh hơn, phải triển mạnh hơn, chống chịu tốt hơn, các tính trạng năng suất cao hơn trung bình giữa hai bố mẹ hoặc vượt trội cả bố mẹ. Ở cây cà chua, phương pháp lai cũng được sử dụng khá phổ biến. Hoa cà chua cấu tạo thành chùm và thuộc dạng lưỡng tính. Nhị đực bao gồm các bao phấn liên kết nhau tạo thành hình nón bao quanh nhụy cái (Wei and Giovannucci, 2012).
Khi cánh hoa mở từ 1 đến 2 ngày, bao phấn mở theo chiều dọc phía trong và tự thụ sẽ xảy ra. Vì vậy, khử đực ở cây mẹ cần thực hiện trước khi bao phấn mở. Hoa ở trạng thái nụ, cánh hoa chuyển màu chuẩn bị mở hoặc mới hé mở là thời điểm khử đực. Sau khi khử đực, hoa được bao lại để cách ly.
Phấn của cây bố được thu từ bao phấn khi cánh hoa đã mở toàn bộ, màu vàng tươi. Cuối cùng, phấn hoa của cây bố được tiến hành lai với nhụy cái của cây mẹ, tạo thế hệ con có thể mang những đặc tính vượt trội hơn. Tuy nhiên, phương pháp lai vẫn còn một số những hạn chế nhất định. Do kết hợp đặc tính của bố mẹ nên cây lai có tính di truyền giao động và phức tạp.
Tuy vượt trội hơn hẳn bố mẹ thông qua ưu thế lai, nhưng do mẫn cảm cao với môi trường và biến dị không ngừng nên cây lai thường thoái hóa nhanh, vì vậy chúng cần được lựa chọn và bồi dưỡng thường xuyên. Hiện tượng tái tổ hợp gen và phân ly ở cây lai là những biến đổi về di truyền dẫn đến phát sinh vô số kiểu gen và kiểu hình, sự liên kết giữa các gen có lợi và có hại là một bất lợi cho chọn giống cây trồng (Bakker and Winfridus, 2006).