Luận văn ứng dụng chế tạo thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae pasteurella multocida và streptococcus suis

Luận văn nghiên cứu ứng dụng chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis.

• Tác giả: Hoàng Văn Minh
• Người hướng dẫn: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Ứng Dụng Chế Tạo Vaccine Đa Giá Nhũ Dầu Phòng Bệnh Viêm Phổi Do Actinobacillus Pleuropneumoniae, Pasteurella Multocida Và Streptococcus Suis
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn
• 1.2. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae
• 1.3. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P. multocida gây ra
• 1.4. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P. suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra
• 1.5. Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Nguyên vật liệu
• 2.6. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu phòng viêm phổi ở lợn
• 2.7. Động vật thí nghiệm
• 2.8. Máy móc, dụng cụ thí nghiệm
• 2.9. Phương pháp nghiên cứu
• 2.10. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
• 2.11. Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn
• 2.12. Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn lợn sau tiêm phòng vaccin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A.
• 2.13. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.14. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ
• 2.15. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ GHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo vaccine thử nghiệm
• 3.2. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được
• 3.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
• 3.4. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được
• 3.5. Kết quả chế tạo vaccine thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn
• 3.6. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vaccine thử nghiệm. Kết quả chế tạo vaccine thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn
• 3.7. Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của vaccine thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang
• 3.8. Kết quả xác định độ dài miễn dịch của vaccine thử nghiệm
• 3.9. Kết quả xác định hiệu lực của vaccine thử nghiệm ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang
• KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vaccine đa giá và bệnh viêm phổi

Nghiên cứu tập trung vào việc chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu để phòng bệnh viêm phổi do ba loại vi khuẩn chính: Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, và Streptococcus suis. Bệnh viêm phổi gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt tại tỉnh Bắc Giang. Vaccine đa giá được kỳ vọng sẽ tăng hiệu lực phòng bệnh và kéo dài thời gian miễn dịch.

1.1. Bệnh viêm phổi và tác nhân gây bệnh

Bệnh viêm phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, và Streptococcus suis là nguyên nhân chính gây tử vong ở lợn. Các vi khuẩn này gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như viêm phổi, viêm màng phổi, và bại huyết. Việc phòng ngừa bệnh này là cấp thiết để giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

1.2. Vaccine đa giá nhũ dầu và ứng dụng

Vaccine đa giá nhũ dầu là giải pháp tiềm năng để phòng bệnh viêm phổi. Nhũ dầu giúp tăng cường hiệu lực và kéo dài thời gian miễn dịch. Nghiên cứu này nhằm chế tạo và thử nghiệm loại vaccine này, đánh giá hiệu quả trong việc phòng bệnh cho đàn lợn tại Bắc Giang.

II. Phương pháp nghiên cứu và chế tạo vaccine

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp khoa học để phân lập, xác định độc lực của các chủng vi khuẩn và chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu. Quy trình bao gồm việc nuôi cấy vi khuẩn, kiểm tra độc lực, và thử nghiệm vaccine trên động vật.

2.1. Phân lập và xác định độc lực vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, và Streptococcus suis được phân lập từ lợn bệnh. Độc lực của chúng được xác định thông qua các thí nghiệm trên chuột bạch và lợn. Kết quả cho thấy các chủng này có độc lực cao, phù hợp để sử dụng trong chế tạo vaccine.

2.2. Quy trình chế tạo vaccine nhũ dầu

Vaccine được chế tạo bằng cách vô hoạt các chủng vi khuẩn và kết hợp với chất bổ trợ nhũ dầu. Quy trình này đảm bảo vaccine an toàn và hiệu quả. Các lô vaccine được kiểm tra về độ thuần khiết, vô trùng, và an toàn trước khi thử nghiệm trên động vật.

III. Kết quả nghiên cứu và hiệu lực của vaccine đa giá

Kết quả nghiên cứu cho thấy vaccine đa giá nhũ dầu có hiệu lực cao trong việc phòng bệnh viêm phổi. Vaccine kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu, giúp bảo vệ lợn khỏi các tác nhân gây bệnh.

3.1. Hiệu lực vaccine trên chuột bạch

Vaccine được thử nghiệm trên chuột bạch để đánh giá hiệu lực. Kết quả cho thấy chuột được tiêm vaccine có tỷ lệ sống sót cao hơn so với nhóm đối chứng khi tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh. Điều này chứng minh hiệu quả bảo vệ của vaccine đa giá.

3.2. Hiệu lực vaccine trên lợn tại Bắc Giang

Vaccine được thử nghiệm trên đàn lợn tại tỉnh Bắc Giang. Kết quả cho thấy tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm phổi giảm đáng kể ở nhóm được tiêm vaccine so với nhóm không tiêm. Hiệu giá kháng thể trong máu lợn được duy trì ở mức cao trong thời gian dài, chứng tỏ hiệu quả lâu dài của vaccine.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để ứng dụng vaccine trong thực tế, góp phần giảm thiểu thiệt hại do bệnh viêm phổi gây ra.

4.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã chế tạo thành công vaccine đa giá nhũ dầu từ các chủng vi khuẩn phân lập. Đây là cơ sở để phát triển các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh bệnh viêm phổi đang diễn biến phức tạp.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Việc ứng dụng vaccine đa giá nhũ dầu trong chăn nuôi lợn tại Bắc Giang giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh, tăng năng suất và thu nhập cho người chăn nuôi. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm ở động vật.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi lợn tại tỉnh Bắc Giang đã phát triển mạnh mẽ, đóng góp quan trọng vào kinh tế địa phương và xuất khẩu sản phẩm chăn nuôi. Tuy nhiên, bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra đã trở thành một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Theo ước tính, tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm phổi do các vi khuẩn như Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida và Streptococcus suis có thể lên đến 60-70% trong các ổ dịch, gây giảm năng suất và tăng tỷ lệ chết. Mục tiêu nghiên cứu là ứng dụng công nghệ chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu nhằm phòng bệnh viêm phổi do ba loại vi khuẩn trên gây ra ở lợn tại Bắc Giang trong giai đoạn từ tháng 8/2016 đến tháng 8/2017. Nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có độc lực cao, ổn định kháng nguyên để chế tạo vaccine, thử nghiệm hiệu lực và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên đàn lợn thực địa. Việc phát triển vaccine đa giá nhũ dầu có ý nghĩa khoa học trong việc tạo ra sản phẩm phòng bệnh hiệu quả, kéo dài thời gian miễn dịch, đồng thời góp phần giảm thiệt hại kinh tế, nâng cao thu nhập cho người chăn nuôi tại địa phương.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh bệnh học của ba loại vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn:

• Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae: Là vi khuẩn Gram âm, có nhiều serotype khác nhau dựa trên cấu trúc polysaccharide vỏ và lipopolysaccharide. Độc lực chủ yếu do các ngoại độc tố ApxI, ApxII, ApxIII và ApxIV, cùng với các protein màng ngoài và yếu tố thu nhận sắt. Các độc tố này quyết định mức độ gây bệnh và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch.

• Vi khuẩn Pasteurella multocida: Vi khuẩn Gram âm, có nhiều serotype dựa trên kháng nguyên vỏ (K) và thân (O). Độc lực liên quan đến độc tố dermanecrotic toxin (DNT) và các plasmid kháng thuốc. Kháng nguyên vỏ giúp vi khuẩn chống lại thực bào và tạo miễn dịch đặc hiệu.

• Vi khuẩn Streptococcus suis: Vi khuẩn Gram dương, có nhiều serotype, trong đó serotype 2 phổ biến và gây bệnh nghiêm trọng nhất. Các yếu tố độc lực gồm suilysin, protein giải phóng muramidase (MRP) và yếu tố ngoại bào (EF). Kháng nguyên giáp mô giúp vi khuẩn tránh bị thực bào.

Ba loại vi khuẩn này đều có khả năng gây viêm phổi với các thể bệnh cấp tính, mãn tính và có tỷ lệ tử vong cao. Vaccine đa giá nhũ dầu được thiết kế để kết hợp các kháng nguyên đặc hiệu nhằm kích thích đáp ứng miễn dịch toàn diện và kéo dài.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn phân lập từ 285 mẫu bệnh phẩm lợn mắc viêm phổi tại tỉnh Bắc Giang trong các năm 2014-2016. Các chủng được lưu giữ tại Viện Thú y Quốc gia và Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet.

• Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn các chủng vi khuẩn có độc lực cao, ổn định kháng nguyên thuộc các serotype tiêu biểu: A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D; S. suis serotype 2.

• Phương pháp phân tích: Xác định độc lực bằng tiêm truyền chuột thí nghiệm, đánh giá hiệu lực vaccine qua thử nghiệm an toàn, vô trùng và hiệu lực trên chuột và lợn. Đánh giá đáp ứng miễn dịch bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và ELISA. Phân tích số liệu sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16 và Excel, áp dụng các công thức tính hiệu lực tiêm phòng, χ2 và nguy cơ tương đối (RR).

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 8/2017, bao gồm tuyển chọn chủng, chế tạo vaccine, thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và thực địa tại ba huyện Hiệp Hòa, Việt Yên, Lạng Giang của tỉnh Bắc Giang.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Độc lực các chủng vi khuẩn phân lập:

   • Trong 6 chủng A. pleuropneumoniae kiểm tra, 4 chủng có độc lực mạnh giết chết 100% chuột thí nghiệm trong 12-30 giờ, 2 chủng còn lại giết chết 50% chuột trong 36-48 giờ. Liều LD50 của serotype 2 và 5 lần lượt là 4,3 x 10^7 CFU và 4,8 x 10^7 CFU.
   • 6 chủng P. multocida đều giết chết 100% chuột thí nghiệm trong 12-36 giờ, trong đó 2 chủng có độc lực mạnh nhất giết chết chuột trong 12-24 giờ. Liều LD50 của serotype A và D lần lượt là 4 x 10^7 CFU và 4,2 x 10^7 CFU.
   • 6 chủng S. suis serotype 2 và 9 gây chết 100% chuột trong 12-24 giờ, serotype 7 gây chết 50% chuột trong 36-48 giờ. Liều LD50 của serotype 2 là 4,4 x 10^7 CFU, serotype 7 và 9 là 4,9 x 10^7 CFU.

2. Chọn giống vi khuẩn chế tạo vaccine:
   Bộ giống gồm 5 chủng đại diện cho các serotype có độc lực cao và ổn định kháng nguyên: A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a; P. multocida serotype A, D; S. suis serotype 2.

3. Hiệu lực vaccine thử nghiệm:
   Vaccine đa giá nhũ dầu đạt tiêu chuẩn vô trùng, an toàn trên chuột và lợn. Sau tiêm 2 mũi, hiệu giá kháng thể trong máu lợn đạt ≥ 1/16 sau 3 tháng, duy trì miễn dịch kéo dài đến 5 tháng. Tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở vùng tiêm vaccine giảm đáng kể so với vùng không tiêm, nguy cơ mắc bệnh giảm hơn 70%.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập tại Bắc Giang có độc lực cao, phù hợp để sử dụng làm giống chế tạo vaccine. Vaccine đa giá nhũ dầu đã kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài, nhờ vào việc sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu giúp giải phóng kháng nguyên chậm và ổn định. So với các nghiên cứu trước đây về vaccine đơn giá hoặc không có nhũ dầu, vaccine đa giá này có ưu điểm vượt trội về hiệu lực và thời gian bảo hộ. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hiệu giá kháng thể theo thời gian và bảng tỷ lệ mắc bệnh giữa nhóm tiêm và không tiêm, minh họa rõ ràng hiệu quả phòng bệnh. Việc áp dụng vaccine đa giá nhũ dầu góp phần giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, hạn chế kháng thuốc và nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai tiêm phòng vaccine đa giá nhũ dầu rộng rãi tại các trang trại và hộ chăn nuôi lợn ở Bắc Giang, với mục tiêu đạt tỷ lệ tiêm phòng trên 90% đàn lợn trong vòng 12 tháng tới, do Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh chủ trì.

2. Tăng cường giám sát dịch tễ và đánh giá hiệu quả vaccine định kỳ 6 tháng/lần, sử dụng các phương pháp huyết thanh học để theo dõi đáp ứng miễn dịch và phát hiện sớm ổ dịch, do Viện Thú y Quốc gia phối hợp với các phòng thí nghiệm địa phương thực hiện.

3. Đào tạo kỹ thuật viên và người chăn nuôi về quy trình tiêm phòng và quản lý đàn lợn nhằm nâng cao nhận thức và kỹ năng phòng bệnh, dự kiến hoàn thành trong 6 tháng, do các trường đại học nông lâm và cơ quan thú y địa phương tổ chức.

4. Khuyến khích nghiên cứu tiếp tục cải tiến vaccine đa giá mở rộng phòng bệnh cho các tác nhân khác gây viêm phổi ở lợn, đồng thời nghiên cứu các phương pháp bổ trợ nâng cao miễn dịch, với kế hoạch nghiên cứu trong 2 năm tiếp theo, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược thú y phối hợp thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Người chăn nuôi lợn: Nắm bắt kiến thức về bệnh viêm phổi và phương pháp phòng bệnh hiệu quả, áp dụng vaccine đa giá nhũ dầu để giảm thiệt hại kinh tế và nâng cao năng suất.

2. Chuyên gia thú y và cán bộ quản lý thú y: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chương trình tiêm phòng, giám sát dịch bệnh và tư vấn kỹ thuật cho người chăn nuôi.

3. Nhà sản xuất và phân phối vaccine thú y: Tham khảo quy trình chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu, đánh giá hiệu lực và an toàn để phát triển sản phẩm phù hợp với thị trường Việt Nam.

4. Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực vi sinh vật và miễn dịch học thú y: Khai thác dữ liệu về độc lực vi khuẩn, cấu trúc kháng nguyên và đáp ứng miễn dịch để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về vaccine và phương pháp điều trị.

Câu hỏi thường gặp

1. Vaccine đa giá nhũ dầu là gì và có ưu điểm gì?
   Vaccine đa giá nhũ dầu là vaccine vô hoạt kết hợp nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh, sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu giúp giải phóng kháng nguyên chậm, tăng hiệu lực và kéo dài thời gian miễn dịch. Ví dụ, vaccine này duy trì hiệu giá kháng thể trên 5 tháng sau tiêm.

2. Tại sao cần chọn các chủng vi khuẩn có độc lực cao để chế tạo vaccine?
   Chủng vi khuẩn có độc lực cao thường có kháng nguyên ổn định, kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn, giúp vaccine bảo vệ hiệu quả hơn. Nghiên cứu đã xác định các chủng có LD50 khoảng 4-5 x 10^7 CFU phù hợp.

3. Phương pháp đánh giá hiệu lực vaccine như thế nào?
   Hiệu lực được đánh giá qua thử nghiệm an toàn, vô trùng trên chuột và lợn, đo hiệu giá kháng thể bằng IHA hoặc ELISA, và theo dõi tỷ lệ mắc bệnh thực tế trên đàn lợn tiêm vaccine so với không tiêm.

4. Vaccine có thể phòng được bao lâu?
   Theo kết quả nghiên cứu, vaccine đa giá nhũ dầu duy trì hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ ≥ 1/16 trong ít nhất 5 tháng, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh viêm phổi đáng kể.

5. Có cần kết hợp vaccine với các biện pháp phòng bệnh khác không?
   Có, vaccine cần được kết hợp với quản lý chuồng trại, vệ sinh, cách ly lợn mới và sử dụng kháng sinh hợp lý để đạt hiệu quả phòng bệnh tối ưu và hạn chế kháng thuốc.

Kết luận

• Đã tuyển chọn thành công các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis có độc lực cao, ổn định kháng nguyên để chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu.
• Vaccine thử nghiệm đạt tiêu chuẩn vô trùng, an toàn và có hiệu lực bảo hộ cao trên chuột và lợn thí nghiệm.
• Đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm vaccine duy trì hiệu giá kháng thể bảo hộ trong ít nhất 5 tháng.
• Ứng dụng vaccine đa giá nhũ dầu giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh viêm phổi, nâng cao hiệu quả chăn nuôi và giảm thiệt hại kinh tế tại Bắc Giang.
• Đề xuất triển khai tiêm phòng rộng rãi, giám sát định kỳ và nghiên cứu tiếp tục để mở rộng phạm vi phòng bệnh.

Khuyến khích các cơ quan thú y và người chăn nuôi áp dụng vaccine đa giá nhũ dầu trong chương trình phòng bệnh, đồng thời hỗ trợ đào tạo và giám sát hiệu quả tiêm phòng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi lợn 1. Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 1. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn.

pleuropneumoniae là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô, tuy nhiên một số chủng không có giáp mô cũng đã được quan sát thấy. Dưới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5-2 x 60-450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A.

pleuropneumoniae, còn loại không có vỏ thì ít tìm thấy hơn. pleuropneumoniae là một loại vi khuẩn khó phân lập trên các môi trường thông thường và thường phụ thuộc vào yếu tố V. Do vậy, khi nuôi cấy A. pleuropneumoniae cần các môi trường giàu dinh dưỡng.

Trên môi trường thạch máu vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch máu thông thường mà chỉ có thể mọc trên thạch máu đã được bổ sung NAD hoặc có cấy kèm vi khuẩn Sta. Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc mọc xung quanh đường cấy Sta. aureus với kích thước 0,5-1 mm và hình thành một vùng dung huyết β. Vùng dung huyết này thường được quan sát rõ hơn trên môi trường thạch có bổ sung 5-7 % máu cừu.

Ngoài ra, vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn gây một vùng dung huyết tăng cường trong vùng dung huyết bán phần, xung quanh đường cấy Sta. aureus có độc tố dung huyết β gọi là hiện tượng CAMP (Kilian, 1976) [50]. Hiện tượng CAMP này liên quan tới sự có mặt của 3 loại độc tố của A.

pleuropneumoniae bao gồm ApxI, ApxII và ApxIII. Trên môi trường TSA: Trong thành phần của môi trường này được bổ sung Yearst Extract (YE) và huyết thanh ngựa. Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dưới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh. Trên môi trường thạch chocolate: Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám.

pleuropneumoniae thuộc biotype 1 n 4 có thể phân biệt được với H. parasuis bởi khả năng gây dung huyết trên thạch máu khi có Sta. aureus cấy kèm (Kilian, 1976) [50]. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A.

pleuropneumoniae lên men đường glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Dương tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.G; âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey (Trịnh Quang Hiệp và cs, 2004 [6]; Cù Hữu Phú và cs, 2005 [11]; Đặng Xuân Bình và cs, 2007 [2]; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010 [5]).Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ lâu đã được nhiều nghiên cứu xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn và được chia thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Biotype 1 cần có NAD, còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD.

Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào. Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1997) [60].

Blackall và cs (2002) [22] đã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype 1 ở 9 chủng vi khuẩn phân lập được tại Australia. Các yếu tố độc lực Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn được quyết định bởi các ngoại độc tố mà chúng sản sinh ra (Devenish và cs, 1990 [28]; Frey và Bosse, 1993 [36]). Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng đóng vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A.

Hiểu biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực của vi n 5 khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng như chế tạo vaccine phòng bệnh. - Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn (Devenish và cs, 1990 [28]. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố.

Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX-toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993) [36]; Cho và Chae, 2001 [25]). Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. + ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988) [34]. Trước đây ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990) [35].

Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1994 [49]; Rayamajhi và cs, 2005 [65]). Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A.

pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3. + ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhưng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lượng phân tử 120 kDa. Trước kia ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Rycroft và cs, 1991a [68]; Macdonald và Rycroft, 1992 [54]; Jansen và cs, 1993 [47]). ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác.

ApxIII giống 50% với ApxI và HlyI của vi khuẩn E. Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI (Chang và cs, 1993) [24]. Protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A. + ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A.

pleuropneumoniae đã được phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA. Gen ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều đó chứng tỏ nó có tính chất n 6 đặc trưng cho loài. Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh hiện chưa được nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A.

Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx như serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey và Nicolet, 1990 [35]; Frey và cs, 1993 [36], 1994 [37]).

Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ mạnh đến yếu. Sự thay đổi này tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố (Frey và Nicolet, 1990) [35].

pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. Đồng thời tác giả đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 để không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vaccine cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên.

Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. Thành phần heptose và glucose trong LPS của A. pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác như E. Jensen và Bertram (1986) [46] đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A.

pleuropneumoniae có độc lực cao thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5. LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ sau khi A. pleuropneumoniae xâm nhiễm. - Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS): Vi khuẩn A.

pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và được cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các n 7 cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997) [70]. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy.

Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 - 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác nhau. Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác nhau về độc lực. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ.