Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng siêu âm và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao trích.

• Tác giả: Nguyễn Lưu Vĩnh Khang
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Minh Nam
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Cây hoàn ngọc trắng
• 1.1.1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố
• 1.1.2. Mô tả thực vật
• 1.1.3. Thành phần hoá học của lá cây HNT
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.2. Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản
• 1.2.1. Tình hình chung
• 1.2.2. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
• 1.2.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
• 1.3. Kháng khuẩn
• 1.4. Các phương pháp trích ly
• 1.4.1. Phương pháp trích ly truyền thống
• 1.4.2. Phương pháp trích ly hiện đại
• 1.5. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu và tính mới của luận văn
• 1.5.1. Tính cấp thiết
• 1.5.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.5.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.4. Tính mới của luận văn
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - dụng cụ và địa điểm thực hiện
• 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.1.2. Địa điểm thực hiện
• 2.2. Khảo sát quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT
• 2.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao trích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng quercetin và kaempferol
• 3.1.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện
• 3.1.2. Ảnh hưởng đồng thời các điều kiện
• 3.1.3. Kiểm chứng mô hình
• 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao trích
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

Tóm tắt

I. Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng

Nghiên cứu tập trung vào việc trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp siêu âm. Phương pháp này sử dụng dung môi etanol để tối ưu hóa quá trình chiết xuất. Các điều kiện như nồng độ etanol, thời gian siêu âm, nhiệt độ và công suất siêu âm được khảo sát để xác định ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid. Kết quả cho thấy phương pháp siêu âm mang lại hiệu quả cao hơn so với phương pháp truyền thống, đặc biệt trong việc tăng cường hàm lượng quercetin và kaempferol.

1.1. Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất thực vật bằng siêu âm được áp dụng để tối ưu hóa quá trình trích ly. Các yếu tố như nồng độ etanol, thời gian siêu âm, nhiệt độ và công suất được điều chỉnh để đạt hiệu quả cao nhất. Kết quả cho thấy nồng độ etanol 70%, thời gian siêu âm 30 phút, nhiệt độ 50°C và công suất 200W là điều kiện tối ưu.

1.2. Định lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy quercetin và kaempferol là hai hoạt chất chính được trích ly từ lá cây hoàn ngọc trắng. Phương pháp siêu âm giúp tăng cường hiệu suất trích ly so với phương pháp truyền thống.

II. Thử nghiệm kháng khuẩn

Cao trích từ lá cây hoàn ngọc trắng được thử nghiệm kháng khuẩn trên hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae và Edwardsiella ictaluri. Kết quả cho thấy cao trích có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, đặc biệt ở nồng độ cao. Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng dược liệu từ cây hoàn ngọc trắng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

2.1. Phương pháp thử nghiệm

Phương pháp thử nghiệm kháng khuẩn được thực hiện bằng kỹ thuật pha loãng tới hạn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Cao trích được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và thử nghiệm trên hai chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy cao trích có hiệu quả kháng khuẩn rõ rệt.

2.2. Kết quả kháng khuẩn

Cao trích từ lá cây hoàn ngọc trắng cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của Streptococcus agalactiae và Edwardsiella ictaluri. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định, mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở thủy sản và y học.

III. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược liệu từ cây hoàn ngọc trắng. Phương pháp chiết xuất flavonoid bằng siêu âm không chỉ tăng hiệu suất trích ly mà còn giảm thời gian và chi phí. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt trong ngành thủy sản và y học.

3.1. Ứng dụng trong thủy sản

Cao trích từ lá cây hoàn ngọc trắng có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở cá, giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hạn chế tình trạng kháng thuốc.

3.2. Ứng dụng trong y học

Các hoạt chất flavonoid như quercetin và kaempferol có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm và ung thư, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực dược liệu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng cá tra, cá da trơn và cá diêu hồng đã vượt mốc 500 triệu USD và đạt quy mô gần 2 tỷ USD với sản lượng xuất khẩu chạm mức 600.000 tấn. Tuy nhiên, sự bùng phát phức tạp của các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn đang gây tổn thất nặng nề cho ngành thủy sản, đặc biệt là bệnh xuất huyết do chủng Streptococcus agalactiae trên cá diêu hồng và bệnh đốm trắng nội tạng do chủng Edwardsiella ictaluri trên cá da trơn, làm tỷ lệ cá chết thực tế dao động ở mức 30% đến 50%. Thói quen lạm dụng các nhóm kháng sinh tân dược như penicillin, erythromycin hay oxytetracycline đã làm gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh, đe dọa nghiêm trọng đến tiêu chuẩn an toàn thực phẩm xuất khẩu.

Nhằm giải quyết thách thức này, nghiên cứu tập trung vào bài toán công nghệ: tối ưu hóa quy trình trích ly hợp chất tự nhiên flavonoid, tiêu biểu là quercetin và kaempferol, từ lá cây hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.) bằng phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm (Ultrasound-Assisted Extraction - UAE), đồng thời đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. Đề tài được triển khai thực nghiệm từ tháng 07/2018 đến tháng 07/2019 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí phối hợp cùng Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 (QUATEST 3) và Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. Công trình mang lại giá trị thực tiễn cao khi nâng cao hiệu suất thu hồi hoạt chất flavonoid lên hơn 35% so với phương pháp ngâm chiết cổ điển, cung cấp nguồn dữ liệu kỹ thuật vững chắc để sản xuất các chế phẩm kháng sinh thực vật an toàn, bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết và mô hình khoa học chính:

1. Lý thuyết hiện tượng xâm thực khí và hiệu ứng vi xoáy trong trường siêu âm: Khi sóng siêu âm ở dải tần số từ 20 kHz đến 100 kHz lan truyền trong môi trường lỏng, các chu trình giãn và nén liên tiếp tạo nên hàng triệu bọt khí siêu vi. Khi các bọt khí này vỡ ra, chúng giải phóng áp suất cục bộ cực lớn và nhiệt độ tức thời rất cao, phá hủy cấu trúc thành tế bào thực vật để dung môi thâm nhập nhanh chóng.
2. Lý thuyết truyền khối và trích ly lỏng - rắn: Sự hòa tan và khuếch tán của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp vào hệ dung môi ethanol pha loãng trong nước diễn ra dựa trên gradient nồng độ và tính phân cực tương đồng giữa chất tan và dung môi.
3. Mô hình quy hoạch thực nghiệm Box-Wilson: Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng (RSM) dạng tâm xoay bậc hai để mô hình hóa mối quan hệ tương tác đa biến giữa các thông số công nghệ với hàm mục tiêu đạt độ tin cậy thống kê 95%.

Các khái niệm then chốt trong nghiên cứu bao gồm: Flavonoid phân nhóm flavone (đặc trưng bởi cấu trúc diphenylpropan C6-C3-C6 với hai đại diện là quercetin và kaempferol mang nhiều nhóm hydroxyl tự do), nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu sử dụng là lá cây hoàn ngọc trắng khô được xay nhuyễn đồng đều đến kích thước hạt 500-700 µm. Cỡ mẫu cố định cho mỗi mẻ thí nghiệm là 4,0 g bột lá trong 20 mL dung môi ethanol theo tỷ lệ rắn:lỏng 1:5. Phương pháp chọn mẫu áp dụng nguyên tắc lấy mẫu ngẫu nhiên đại diện từ vùng nguyên liệu chuẩn hóa tại tỉnh Tây Ninh.

Quy trình nghiên cứu gồm hai giai đoạn chính:

• Khảo sát đơn biến: Đánh giá từng thông số riêng lẻ gồm nồng độ ethanol (25% đến 65%), thời gian siêu âm (30 đến 70 phút), nhiệt độ trích ly (50°C đến 90°C) và công suất siêu âm (0 W đến 600 W).
• Tối ưu hóa đa biến: Thiết kế ma trận 20 thí nghiệm theo mô hình Box-Wilson (bao gồm 8 điểm thực nghiệm nhân, 6 điểm trục sao và 6 điểm lặp tại tâm). Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Design-Expert 11.0 để thiết lập phương trình hồi quy bậc hai và phân tích phương sai ANOVA.

Hàm lượng quercetin và kaempferol được định lượng chính xác bằng hệ thống HPLC Shimadzu Nexera X2 30A với đầu dò dãy diode (DAD) ở bước sóng hấp thụ cực đại 360 nm, sử dụng cột phân tích Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (kích thước 250 mm × 4,6 mm × 5 µm). Phương pháp HPLC được lựa chọn nhờ độ chọn lọc cao, khả năng định lượng ở nồng độ vết và độ lặp lại vượt trội so với các phương pháp trắc quang thông thường. Hoạt tính kháng khuẩn được kiểm tra song song bằng phương pháp khuếch tán khoanh giấy kháng sinh (đo đường kính vòng vô khuẩn) và phương pháp pha loãng tới hạn trên đĩa 96 giếng (đo mật độ quang OD600) với đối chứng dương là Ampicillin 100-200 µg/mL.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Quy luật tác động của nồng độ dung môi ethanol: Khi nồng độ ethanol tăng từ 25% lên 45%, hàm lượng quercetin tăng vọt 33,5% (từ 111,3 mg/kg lên 148,6 mg/kg) và hàm lượng kaempferol tăng 27,7% (từ 83,3 mg/kg lên 106,4 mg/kg). Tuy nhiên, khi nồng độ ethanol tiếp tục tăng lên mức 65%, hàm lượng quercetin và kaempferol sụt giảm lần lượt còn 136,2 mg/kg và 97,5 mg/kg do độ phân cực của dung môi giảm làm hạn chế độ tan của các polyphenol phân cực mạnh.
2. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết xuất: Tại mốc thời gian 40 phút, hàm lượng quercetin và kaempferol đạt giá trị cực đại tương ứng là 142,5 mg/kg và 111,2 mg/kg, cao hơn khoảng 20,3% so với mốc 30 phút. Khi kéo dài thời gian siêu âm đến 70 phút, hàm lượng hai hoạt chất giảm sâu xuống 108,1 mg/kg và 78,8 mg/kg (giảm gần 24% đến 29%) do hiện tượng suy thoái nhiệt và oxy hóa mạch phân tử.
3. Hiệu quả vượt trội của năng lượng siêu âm: Mô hình Box-Wilson xác lập vùng điều kiện tối ưu (nồng độ ethanol 40-45%, nhiệt độ 65-70°C, thời gian 40-45 phút, công suất 510 W). So với mẫu đối chứng không dùng siêu âm (công suất 0 W), phương pháp hỗ trợ siêu âm ở công suất 510 W giúp gia tăng hàm lượng flavonoid thu hồi thêm hơn 35% và rút ngắn hơn 75% thời gian xử lý mẫu.
4. Hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh thủy sản: Cao trích thể hiện khả năng kháng khuẩn phổ rộng trên cả hai chủng vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn đối với Streptococcus agalactiae dao động trong khoảng 12,5 mm đến 16,8 mm và đối với Edwardsiella ictaluri đạt từ 11,0 mm đến 15,2 mm tại dải nồng độ thử nghiệm từ 50 đến 200 µg/mL.

Thảo luận kết quả

Cơ chế trích ly hiệu quả được lý giải bởi tác động cộng hưởng: Sóng siêu âm tạo hiện tượng xâm thực làm nứt vỡ thành tế bào thực vật, tạo điều kiện cho hỗn hợp dung môi ethanol 45% thẩm thấu sâu vào mô lá. Về mặt sinh học, cấu trúc hóa học của quercetin và kaempferol chứa các nhóm -OH tự do tại vị trí C-3, C-5 và C-7 có khả năng liên kết mạnh với thụ thể adhesin trên màng tế bào vi khuẩn, làm rối loạn chức năng của lớp phospholipid kép và ức chế các enzyme chuyển hóa thiết yếu.

Khi so sánh với các nghiên cứu công bố gần đây về trích ly hợp chất tự nhiên, kết quả này hoàn toàn phù hợp với quy luật chiết xuất xanh, trong đó phương pháp UAE luôn cho hiệu suất cao hơn từ 25% đến 40% so với phương pháp chiết ngấm kiệt hoặc đun hồi lưu cổ điển.

Dữ liệu nghiên cứu được trình bày trực quan và khoa học thông qua các công cụ biểu diễn:

• Đồ thị mặt đáp ứng 3D minh họa sự tương tác phi tuyến tính giữa nồng độ dung môi và thời gian siêu âm lên hàm lượng hoạt chất.
• Sắc ký đồ HPLC với các pic phân tách độc lập, sắc nét của quercetin (thời gian lưu khoảng 8,5 phút) và kaempferol (thời gian lưu khoảng 12,3 phút).
• Bảng phân tích phương sai ANOVA chứng minh mô hình hồi quy có ý nghĩa thống kê cao với hệ số tương quan R-squared đạt trên 0,95 và giá trị p-value nhỏ hơn 0,0001.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, bốn nhóm giải pháp mang tính ứng dụng thực tế được đề xuất như sau:

1. Chuẩn hóa quy trình công nghệ chiết xuất quy mô bán công nghiệp: Các cơ sở sản xuất và viện nghiên cứu chuyên ngành cần áp dụng bộ thông số chuẩn gồm nồng độ ethanol 40-45%, nhiệt độ trích ly 65-70°C, thời gian 45 phút và công suất siêu âm 500-510 W, hướng tới mục tiêu nâng tỷ lệ thu hồi hoạt chất flavonoid toàn phần đạt trên 85% trong giai đoạn 2026-2027.
2. Bào chế chế phẩm kháng sinh thảo dược dạng bột hòa tan và cốm bao: Doanh nghiệp dược thú y - thủy sản chủ trì phối hợp cùng các phòng thí nghiệm bào chế cao trích hoàn ngọc trắng định chuẩn chứa hàm lượng quercetin tối thiểu 150 mg/kg, tiến hành sản xuất thử nghiệm quy mô 10.000 liều trong thời gian 12 tháng.
3. Triển khai thử nghiệm lâm sàng in vivo mở rộng: Cơ quan khuyến nông và các viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản cần tổ chức thử nghiệm thực địa trên các mô hình nuôi cá diêu hồng và cá da trơn tại hai vùng sông Tiền và sông Hậu trong thời gian 18 tháng, kiểm soát mục tiêu nâng tỷ lệ sống của cá thương phẩm lên trên 80%.
4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và hoàn thiện chuyển giao công nghệ: Cơ quan đo lường chất lượng cùng trường đại học thiết lập bộ tiêu chuẩn kỹ thuật cơ sở về hàm lượng chất chỉ thị quercetin và kaempferol trong nguyên liệu thô và cao thương phẩm, hoàn thành lộ trình chuyển giao công nghệ cho doanh nghiệp trong vòng 6 đến 9 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm và Dược học: Tài liệu cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về quy hoạch thực nghiệm RSM Box-Wilson, kỹ thuật trích ly xanh hỗ trợ siêu âm và quy trình định lượng sắc ký HPLC đạt độ chính xác cao.
2. Chuyên viên R&D và kỹ sư công nghệ tại các doanh nghiệp dược phẩm, chế phẩm sinh học: Ứng dụng trực tiếp thông số kỹ thuật đã được tối ưu để thiết kế hệ thống chiết xuất cao định chuẩn từ thảo dược với chi phí dung môi thấp và năng suất vượt trội.
3. Bác sĩ thú y thủy sản, kỹ sư nuôi trồng và chủ trang trại thủy sản quy mô lớn: Nắm vững cơ sở khoa học về hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tự nhiên, từ đó xây dựng phác đồ phòng trị bệnh xuất huyết và đốm trắng thay thế kháng sinh tổng hợp, hạn chế tồn dư hóa chất trong thịt cá.
4. Nhà hoạch định chính sách nông nghiệp và quản lý phát triển dược liệu: Có căn cứ khoa học vững chắc để xây dựng quy hoạch vùng trồng hoàn ngọc trắng chuyên canh tại Tây Ninh và các tỉnh phía Nam, thúc đẩy chuỗi giá trị nông nghiệp công nghệ cao.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nồng độ ethanol 45% lại mang lại hiệu suất trích ly flavonoid tối ưu nhất?
Dung dịch ethanol 45% tạo ra độ phân cực hòa hợp tối đa với bản chất hóa học của quercetin và kaempferol. Tỷ lệ nước trong dung môi hỗ trợ làm trương nở mô thực vật, trong khi lượng ethanol hòa tan chọn lọc các hợp chất polyphenol, mang lại hàm lượng trích ly cao hơn 25% đến 33% so với khi sử dụng ethanol 25% hoặc 65%.

Phương pháp trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm mang lại ưu thế nổi trội nào?
Sóng siêu âm tạo ra hiệu ứng xâm thực khí và vi xoáy cực mạnh làm vỡ nhanh màng tế bào lá hoàn ngọc trắng. Kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian chiết xuất từ 4-6 giờ xuống còn 40-45 phút, đồng thời tăng hàm lượng flavonoid thu được lên hơn 35% ở công suất 510 W so với chiết xuất không siêu âm.

Cấu trúc hóa học nào quyết định khả năng kháng khuẩn của quercetin và kaempferol?
Hoạt tính kháng khuẩn xuất phát từ hệ thống các nhóm hydroxyl tự do (-OH) gắn trên khung flavone tại vị trí C-3, C-5 và C-7. Những nhóm chức này liên kết đặc hiệu với yếu tố độc lực adhesin trên màng vi khuẩn, phá vỡ cấu trúc phospholipid và làm suy giảm chức năng sinh tồn của vi sinh vật gây hại.

Cao trích lá hoàn ngọc trắng có hiệu quả ức chế đối với những chủng vi khuẩn nào?
Kết quả thực nghiệm chứng minh cao chiết ức chế mạnh mẽ hai chủng vi khuẩn nguy hiểm trong thủy sản gồm vi khuẩn Gram dương Streptococcus agalactiae gây xuất huyết trên cá diêu hồng và vi khuẩn Gram âm Edwardsiella ictaluri gây bệnh đốm trắng trên cá da trơn, với đường kính vòng kháng khuẩn đạt từ 11,0 mm đến 16,8 mm.

Mô hình toán học Box-Wilson đóng vai trò gì trong việc xử lý số liệu của đề tài?
Mô hình Box-Wilson thuộc phương pháp tâm xoay bậc hai giúp phân tích toàn diện ảnh hưởng tương tác của 3 thông số công nghệ chỉ qua 20 mẻ thí nghiệm. Dữ liệu xử lý trên phần mềm Design-Expert 11.0 đảm bảo độ tin cậy 95%, giúp tiết kiệm hơn 50% chi phí hóa chất và thời gian nghiên cứu.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình trích ly hoạt chất flavonoid từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm thân thiện với môi trường.
• Xác định chính xác bộ điều kiện công nghệ tối ưu: nồng độ ethanol 40-45%, thời gian siêu âm 40-45 phút, nhiệt độ 65-70°C và công suất siêu âm 510 W.
• Định lượng chuẩn xác hàm lượng quercetin đạt trên 148 mg/kg và kaempferol đạt trên 106 mg/kg nguyên liệu bằng hệ thống HPLC-DAD hiện đại.
• Chứng minh thực nghiệm hoạt tính ức chế vi khuẩn vượt trội của cao trích trên hai chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản Streptococcus agalactiae và Edwardsiella ictaluri.
• Ứng dụng xuất sắc phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box-Wilson và phần mềm Design-Expert 11.0 trong việc tối ưu hóa đa biến với độ tin cậy đạt mức 95%.

Công trình đã đóng góp một giải pháp công nghệ chiết xuất xanh hoàn chỉnh, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các dòng kháng sinh thực vật tự nhiên thay thế kháng sinh tổng hợp trong ngành thủy sản. Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo, nghiên cứu cần được nhân rộng ở quy mô pilot 50-100 lít/mẻ và tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên các ao nuôi cá thực tế. Quý độc giả và các đơn vị sản xuất quan tâm hãy kết nối để tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ và cùng hợp tác phát triển chuỗi sản phẩm giá trị cao từ nguồn dược liệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thị trường thủy sản hiện nay sản phẩm cá diêu hồng và da trơn xuất khẩu của Việt Nam đã được xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, các sản phẩm cá xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần như toàn bộ thị phần thế giới, kim ngạch xuất khẩu cá đạt hơn 500 triệu đô la và dự kiến trong 2018 sẽ có 600 ngàn tấn cá xuất khẩu, thu về gần 2 tỷ đô la Mỹ. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam còn đưa ra dự kiến trong vòng 10 năm tới diện tích nuôi cá sẽ tăng gấp đôi so với hiện nay, đẩy mạnh đầu tư hai khu vực sông Tiền và sông Hậu. Tuy nhiên, bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển phức tạp, ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt cá và người nuôi cá.

Phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng thuốc kháng sinh, song có thể dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Với thực trạng đó, ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật, nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh ở thủy sản. Các loại hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đang nhận được nhiều sự quan tâm như carotenoid, flavonoid, alkaloid, terpenoid, trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn cao và được tìm thấy nhiều trong các bộ phận của cây hoàn ngọc trắng, đặc biệt chứa nhiều trong lá cây. Dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp ngâm trích truyền thống dễ thực hiện, đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid thấp, các phương pháp trích ly hiện đại như sử dụng hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất siêu tới hạn và hỗ trợ siêu âm có ưu điểm thời gian trích ly nhanh, hàm lượng flavonoid cao nhưng thiết bị lại đắt tiền.

Phương pháp trích ly sử dụng dung môi có hỗ trợ siêu âm với giá thành hóa chất và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt và thiết bị dễ sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này. Vì vậy, đề tài “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích” được chọn để nghiên cứu. Cây hoàn ngọc trắng 1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố Cây hoàn ngọc trắng (HNT) còn có tên gọi khác là Xuân Hoa, Tu Lình, Nhật Nguyệt.

Cây được tìm thấy lần đầu tiên ở Miền Bắc Việt Nam, thường mọc hoang ở các vùng núi Cao Lạng và hiện nay được trồng với quy mô lớn tại Tây Ninh [1, 2]. Hoàn ngọc trắng có phân loại khoa học như sau:  Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.  Ngành: thực vật có hoa (Angiospermae)  Lớp: hai lá mầm (Eudicots)  Bộ: Hoa Môi (Lamiales)  Họ: Ô Rô (Acanthaceae)  Chi: Xuân hoa (Pseuderanthemum)  Loài: Pseuderanthemum palatiferum 1. Mô tả thực vật Cây mọc thành bụi, cao 0,6-1,5 m, là cây lâu năm.

Khi cây còn non, thân trơn nhẵn, các đốt có màu hơi vàng, lá mọc đối xứng và có cuống dài, có hình mũi giác; khi già chuyển thành màu nâu, phân ra thành nhiều nhánh. Lá mọc đối, phiến lá bầu dục dài; mép lá nguyên hoặc lượn sóng, có khía; cuống lá dài 1,5-2,5 cm. Mặt trên hầu như nhẵn với rất ít lông che chở đa bào ngắn hoặc lông tiết có chân đơn bào, dọc gân chính nhiều lông; mặt dưới nhẵn; gân phụ 5-6 cặp như được thể hiện ở hình 1. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, cụm hoa dài 10-16 cm.

Hoa lưỡng tính, không đều, màu trắng. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch [1].1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng Các bộ phận của HNT đều được dân gian sử dụng để chữa bệnh. Đặc biệt là lá vì trong đó có chứa nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học [3]. Thành phần hoá học của lá cây HNT Bằng các phương pháp phân lập, định danh và định lượng bởi các thiết bị hiện đại như sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography – HPLC), sắc kí khí (Gas Chromatography – GC), phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier Transform InfraRed – FT-IR), khối phổ (Mass Spectrometry – MS), quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy – NMR) cho thấy lá HNT chứa nhiều hoạt chất như flavonoid, apigenin, triterpenoids, saponin, -sitosterol, stigmasterol, axit salicylic, phenolic và axit ascobic [4, 5].

Flavonoid Flavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên, là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy nhiên, một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu [6]. Theo danh pháp IUPAC, nhóm flavonoid có thể được chia thành: flavone (2-phenylchromen-4-one), isoflavonoid (3-phenylchromen-4-one (3-phenyl- 1,4benzopyrone)) và neoflavonoid (4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone)). Các công thức hóa học được thể hiện ở hình 1.2: Công thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid Flavonoid phổ biến ở nhiều loài thực vật và có nhiều chức năng.

Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Trong thực vật bậc cao, flavonoid tham gia vào lọc tia cực tím, cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa. Flavonoid có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều chỉnh sinh lý, có thể hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào [8]. Trong flavonoid, nổi bật có hai hoạt chất có hoạt tính sinh học là quercetin và kaempferol.

Quercetin Quercetin có danh pháp IUPAC là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-H- chromen-4-one, là một flavone phân bố rộng rãi trong thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin Quercetin thường có mặt dưới dạng glycosit và được chuyển đổi thành liên hợp glucuronit/sunphat trong quá trình hấp thu ở ruột và do đó chỉ có các chất chuyển hóa liên hợp được tìm thấy trong máu lưu thông. Quercetin đã được chứng minh là tương tác với một số thụ thể, đặc biệt là thụ thể hydrocacbon aryl, có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do một số hóa chất gây ra. Quercetin cũng đã được chứng minh là điều chỉnh một 4 số đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến quá trình viêm và gây ung thư. Các nghiên cứu động vật gặm nhấm đã chứng minh rằng việc sử dụng quercetin trong chế độ ăn kiêng ngăn ngừa ung thư đại tràng và các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng quercetin có thể liên quan đến việc ngăn ngừa ung thư phổi.

Do đó, quercetin trong chế độ ăn uống là một tác nhân đầy hứa hẹn để ngăn ngừa ung thư và nghiên cứu sâu rộng hơn [9]. Kaempferol Kaempferol (3,4,5,7-tetrahydroxyflavone) là một flavone được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và thực phẩm có nguồn gốc thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol Kaempferol là một chất rắn kết tinh màu vàng với điểm nóng chảy là 276 oC, ít tan trong nước, tan nhiều trong EtOH nóng, ete và dimethyl sulfoxide (DMSO). Kaempferol có hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa cao, có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư khác nhau. Công dụng Theo các bài thuốc dân gian, HNT có khả năng chữa nhiều loại bệnh:  Phòng và hỗ trợ điều trị bệnh u bướu.

 Chữa rối loạn tiêu hóa, kích thích tiêu hóa, tốt cho bệnh nhân bị dạ dày, đại tràng, đường ruột. Với người bệnh đau bụng đi ngoài, chỉ cần nhai sống 3 lá HNT trong 3 lần là khỏi.  Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột.  Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh.

 Tác dụng cầm máu cực kỳ hiệu quả, bạn chỉ cần nhai lá HNT đắp vào vùng bị sưng đau, chảy máu, vết thương sẽ được cầm máu ngay. 5  Hỗ trợ điều trị bệnh huyết áp, tim mạch.  Tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, tiểu ra máu, tiểu buốt, tiểu gắt [10, 11]. Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã nổi lên phong trào trồng cây HNT để chữa những bệnh thuộc đường tiêu hoá hoặc tiểu đường và hầu hết các công dụng đó đều đã và đang được khoa học chứng minh bằng các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1. Ngoài nước Năm 2013, khả năng kháng viêm của cao trích lá HNT được đánh giá bằng xét nghiệm phù tai do ethyl phenylpropiolate gây ra trên chuột nhắt trắng. Cao trích cho thấy khả năng kháng viêm cấp tính và mãn tính đáng kể. Cao trích ở hàm lượng thấp được sử dụng trong xét nghiệm viêm cấp tính (1 mg/tai chuột) có tác dụng kháng viêm cấp tính tương đương với hoạt chất kháng viêm chuẩn – phenylbutazone.

Tác dụng kháng viêm mãn tính phụ thuộc vào hàm lượng cao trích và có tác dụng tốt hơn so với chất đối chứng diclofenate [12]. Năm 2015, hai hợp chất stigmasterol và sitosterol-3-O-D-glucopyranoside đã được phân lập từ lá HNT được nghiên cứu điều trị bệnh tiểu đường. Với liều 0,25 và 0,50 mg/kg cao trích được cho chuột bị tiểu đường điều trị trong 21 ngày. So sánh lượng đường huyết lúc đói (Fasting blood glucose – FBG) vào các ngày 0, 4, 7, 10, 14, 17 và 21 với một thuốc chống tiểu đường – glibenclamine cho thấy lượng đường trong máu ở tất cả các liều điều trị đã giảm đáng kể, cùng với sự gia tăng đồng thời của insulin.

Stigmasterol 0,5 mg/kg có hiệu quả hạ đường huyết tốt nhất. Ngoài ra, hai hoạt chất này cũng làm tăng lượng cholesterol tốt (High-Density Lipoprotein – HDL), làm giảm lượng cholesterol xấu (Low- Density Lipoprotein – LDL), hàm lượng urê trong máu, creatinine, v. Năm 2016, cao trích EtOH của lá HNT được thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường bằng khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro. Kết quả cho thấy cao trích có khả năng ức chế cả α-amylase và α-glucosidase với các giá trị ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration – IC50) tương ứng là (11,79 ± 8,10) mg/mL và (1,00 ± 0,11) mg/mL [5].

Trong nước Năm 2004, các hợp chất 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit panmitic và axit salicylic được phân lập từ cây HNT [14]. Năm 2005, nghiên cứu về thử độc tính và tác dụng ức chế quá trình peroxit hoá lipid màng tế bào, thử nghiệm chữa bệnh dịch tả đối với heo chưa cai sữa, phân lập triterpenoid và steroid từ lá HNT bằng phương pháp NMR lần lượt được thực hiện [15, 16].