ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thị trường thủy sản hiện nay sản phẩm cá diêu hồng và da trơn xuất khẩu của Việt Nam đã được xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, các sản phẩm cá xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần như toàn bộ thị phần thế giới, kim ngạch xuất khẩu cá đạt hơn 500 triệu đô la và dự kiến trong 2018 sẽ có 600 ngàn tấn cá xuất khẩu, thu về gần 2 tỷ đô la Mỹ. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam còn đưa ra dự kiến trong vòng 10 năm tới diện tích nuôi cá sẽ tăng gấp đôi so với hiện nay, đẩy mạnh đầu tư hai khu vực sông Tiền và sông Hậu. Tuy nhiên, bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển phức tạp, ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt cá và người nuôi cá.
Phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng thuốc kháng sinh, song có thể dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Với thực trạng đó, ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật, nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh ở thủy sản. Các loại hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đang nhận được nhiều sự quan tâm như carotenoid, flavonoid, alkaloid, terpenoid, trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn cao và được tìm thấy nhiều trong các bộ phận của cây hoàn ngọc trắng, đặc biệt chứa nhiều trong lá cây. Dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp ngâm trích truyền thống dễ thực hiện, đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid thấp, các phương pháp trích ly hiện đại như sử dụng hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất siêu tới hạn và hỗ trợ siêu âm có ưu điểm thời gian trích ly nhanh, hàm lượng flavonoid cao nhưng thiết bị lại đắt tiền.
Phương pháp trích ly sử dụng dung môi có hỗ trợ siêu âm với giá thành hóa chất và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt và thiết bị dễ sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này. Vì vậy, đề tài “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích” được chọn để nghiên cứu. Cây hoàn ngọc trắng 1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố Cây hoàn ngọc trắng (HNT) còn có tên gọi khác là Xuân Hoa, Tu Lình, Nhật Nguyệt.
Cây được tìm thấy lần đầu tiên ở Miền Bắc Việt Nam, thường mọc hoang ở các vùng núi Cao Lạng và hiện nay được trồng với quy mô lớn tại Tây Ninh [1, 2]. Hoàn ngọc trắng có phân loại khoa học như sau: Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk. Ngành: thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp: hai lá mầm (Eudicots) Bộ: Hoa Môi (Lamiales) Họ: Ô Rô (Acanthaceae) Chi: Xuân hoa (Pseuderanthemum) Loài: Pseuderanthemum palatiferum 1. Mô tả thực vật Cây mọc thành bụi, cao 0,6-1,5 m, là cây lâu năm.
Khi cây còn non, thân trơn nhẵn, các đốt có màu hơi vàng, lá mọc đối xứng và có cuống dài, có hình mũi giác; khi già chuyển thành màu nâu, phân ra thành nhiều nhánh. Lá mọc đối, phiến lá bầu dục dài; mép lá nguyên hoặc lượn sóng, có khía; cuống lá dài 1,5-2,5 cm. Mặt trên hầu như nhẵn với rất ít lông che chở đa bào ngắn hoặc lông tiết có chân đơn bào, dọc gân chính nhiều lông; mặt dưới nhẵn; gân phụ 5-6 cặp như được thể hiện ở hình 1. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, cụm hoa dài 10-16 cm.
Hoa lưỡng tính, không đều, màu trắng. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch [1].1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng Các bộ phận của HNT đều được dân gian sử dụng để chữa bệnh. Đặc biệt là lá vì trong đó có chứa nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học [3]. Thành phần hoá học của lá cây HNT Bằng các phương pháp phân lập, định danh và định lượng bởi các thiết bị hiện đại như sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography – HPLC), sắc kí khí (Gas Chromatography – GC), phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier Transform InfraRed – FT-IR), khối phổ (Mass Spectrometry – MS), quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy – NMR) cho thấy lá HNT chứa nhiều hoạt chất như flavonoid, apigenin, triterpenoids, saponin, -sitosterol, stigmasterol, axit salicylic, phenolic và axit ascobic [4, 5].
Flavonoid Flavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên, là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy nhiên, một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu [6]. Theo danh pháp IUPAC, nhóm flavonoid có thể được chia thành: flavone (2-phenylchromen-4-one), isoflavonoid (3-phenylchromen-4-one (3-phenyl- 1,4benzopyrone)) và neoflavonoid (4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone)). Các công thức hóa học được thể hiện ở hình 1.2: Công thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid Flavonoid phổ biến ở nhiều loài thực vật và có nhiều chức năng.
Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Trong thực vật bậc cao, flavonoid tham gia vào lọc tia cực tím, cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa. Flavonoid có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều chỉnh sinh lý, có thể hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào [8]. Trong flavonoid, nổi bật có hai hoạt chất có hoạt tính sinh học là quercetin và kaempferol.
Quercetin Quercetin có danh pháp IUPAC là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-H- chromen-4-one, là một flavone phân bố rộng rãi trong thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin Quercetin thường có mặt dưới dạng glycosit và được chuyển đổi thành liên hợp glucuronit/sunphat trong quá trình hấp thu ở ruột và do đó chỉ có các chất chuyển hóa liên hợp được tìm thấy trong máu lưu thông. Quercetin đã được chứng minh là tương tác với một số thụ thể, đặc biệt là thụ thể hydrocacbon aryl, có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do một số hóa chất gây ra. Quercetin cũng đã được chứng minh là điều chỉnh một 4 số đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến quá trình viêm và gây ung thư. Các nghiên cứu động vật gặm nhấm đã chứng minh rằng việc sử dụng quercetin trong chế độ ăn kiêng ngăn ngừa ung thư đại tràng và các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng quercetin có thể liên quan đến việc ngăn ngừa ung thư phổi.
Do đó, quercetin trong chế độ ăn uống là một tác nhân đầy hứa hẹn để ngăn ngừa ung thư và nghiên cứu sâu rộng hơn [9]. Kaempferol Kaempferol (3,4,5,7-tetrahydroxyflavone) là một flavone được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và thực phẩm có nguồn gốc thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol Kaempferol là một chất rắn kết tinh màu vàng với điểm nóng chảy là 276 oC, ít tan trong nước, tan nhiều trong EtOH nóng, ete và dimethyl sulfoxide (DMSO). Kaempferol có hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa cao, có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư khác nhau. Công dụng Theo các bài thuốc dân gian, HNT có khả năng chữa nhiều loại bệnh: Phòng và hỗ trợ điều trị bệnh u bướu.
Chữa rối loạn tiêu hóa, kích thích tiêu hóa, tốt cho bệnh nhân bị dạ dày, đại tràng, đường ruột. Với người bệnh đau bụng đi ngoài, chỉ cần nhai sống 3 lá HNT trong 3 lần là khỏi. Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột. Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh.
Tác dụng cầm máu cực kỳ hiệu quả, bạn chỉ cần nhai lá HNT đắp vào vùng bị sưng đau, chảy máu, vết thương sẽ được cầm máu ngay. 5 Hỗ trợ điều trị bệnh huyết áp, tim mạch. Tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, tiểu ra máu, tiểu buốt, tiểu gắt [10, 11]. Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã nổi lên phong trào trồng cây HNT để chữa những bệnh thuộc đường tiêu hoá hoặc tiểu đường và hầu hết các công dụng đó đều đã và đang được khoa học chứng minh bằng các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1. Ngoài nước Năm 2013, khả năng kháng viêm của cao trích lá HNT được đánh giá bằng xét nghiệm phù tai do ethyl phenylpropiolate gây ra trên chuột nhắt trắng. Cao trích cho thấy khả năng kháng viêm cấp tính và mãn tính đáng kể. Cao trích ở hàm lượng thấp được sử dụng trong xét nghiệm viêm cấp tính (1 mg/tai chuột) có tác dụng kháng viêm cấp tính tương đương với hoạt chất kháng viêm chuẩn – phenylbutazone.
Tác dụng kháng viêm mãn tính phụ thuộc vào hàm lượng cao trích và có tác dụng tốt hơn so với chất đối chứng diclofenate [12]. Năm 2015, hai hợp chất stigmasterol và sitosterol-3-O-D-glucopyranoside đã được phân lập từ lá HNT được nghiên cứu điều trị bệnh tiểu đường. Với liều 0,25 và 0,50 mg/kg cao trích được cho chuột bị tiểu đường điều trị trong 21 ngày. So sánh lượng đường huyết lúc đói (Fasting blood glucose – FBG) vào các ngày 0, 4, 7, 10, 14, 17 và 21 với một thuốc chống tiểu đường – glibenclamine cho thấy lượng đường trong máu ở tất cả các liều điều trị đã giảm đáng kể, cùng với sự gia tăng đồng thời của insulin.
Stigmasterol 0,5 mg/kg có hiệu quả hạ đường huyết tốt nhất. Ngoài ra, hai hoạt chất này cũng làm tăng lượng cholesterol tốt (High-Density Lipoprotein – HDL), làm giảm lượng cholesterol xấu (Low- Density Lipoprotein – LDL), hàm lượng urê trong máu, creatinine, v. Năm 2016, cao trích EtOH của lá HNT được thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường bằng khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro. Kết quả cho thấy cao trích có khả năng ức chế cả α-amylase và α-glucosidase với các giá trị ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration – IC50) tương ứng là (11,79 ± 8,10) mg/mL và (1,00 ± 0,11) mg/mL [5].
Trong nước Năm 2004, các hợp chất 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit panmitic và axit salicylic được phân lập từ cây HNT [14]. Năm 2005, nghiên cứu về thử độc tính và tác dụng ức chế quá trình peroxit hoá lipid màng tế bào, thử nghiệm chữa bệnh dịch tả đối với heo chưa cai sữa, phân lập triterpenoid và steroid từ lá HNT bằng phương pháp NMR lần lượt được thực hiện [15, 16].
