Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chi Wedelia thuộc họ Cúc (Asteraceae) bao gồm khoảng 104 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và nhiệt đới ẩm. Tại Việt Nam, loài Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.) từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền như một loại kháng sinh thực vật tự nhiên để thanh nhiệt, giải độc, điều trị các bệnh lý ngoài da như mụn nhọt, lở loét, rôm sảy, chốc đầu, viêm khớp và viêm nhiễm. Tuy nhiên, nguồn dược liệu Wedelia chinensis tự nhiên ngày càng khan hiếm do áp lực đô thị hóa và sự thay đổi trong phương thức sử dụng thuốc.

Trong giai đoạn gần đây, loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc., đồng danh Sphagneticola trilobata (L.) Pruski) có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ và Trung Mỹ được du nhập vào Việt Nam. Do đặc tính sinh trưởng thích nghi mạnh mẽ, phát triển nhanh thành thảm phủ đất, loài này được trồng phổ biến tại các công viên, bồn hoa, dải phân cách và mọc hoang ở nhiều khu vực. Do có đặc điểm hình thái thân, hoa màu vàng khá tương đồng với Sài đất truyền thống, Sài đất ba thùy thường xuyên bị người dân thu hái và sử dụng nhầm lẫn, trong khi các công trình khoa học khảo sát toàn diện về tiêu chuẩn vi học, thành phần hóa thực vật cũng như hoạt tính kháng khuẩn của loài di thực này tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học với tên: "Khảo sát và so sánh đặc điểm vi học, sơ bộ hóa thành phần hóa học, hoạt tính kháng khuẩn - kháng nấm giữa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.)) và Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.))" do sinh viên Hồng Gia Ân thực hiện tại Trường Đại học Nguyễn Tất Thành nhằm giải quyết các nhiệm vụ khoa học sau:

  1. Khảo sát đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm giải phẫu vi phẫu và bột dược liệu từ lá và thân của Sài đất ba thùy (W. trilobata), đồng thời lập bảng so sánh đối chiếu với Sài đất (W. chinensis).
  2. Chiết xuất và sơ bộ xác định các nhóm hợp chất hóa thực vật có trong phân đoạn lá của Sài đất ba thùy thông qua các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
  3. Thử nghiệm và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các phân đoạn cao chiết lá Sài đất ba thùy trên các chủng vi sinh vật kiểm nghiệm chuẩn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng thực vật: Mẫu Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata) thu hái trên đường Nguyễn Hữu Thọ, Quận 7, TP. Hồ Chí Minh; Mẫu Sài đất (Wedelia chinensis) thu hái tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
  • Đối tượng vi sinh vật: Các chủng chuẩn gồm Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300, Klebsiella pneumoniae NBRC 14940 và vi nấm Candida tropicalis PK12C do Bộ môn Vi sinh – Ký sinh trùng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
  • Thời gian và không gian: Khóa luận hoàn thành năm 2018 tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TP. Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở phân loại thực vật học của bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae), chi Wedelia, cùng các tài liệu tổng quan quốc tế và trong nước về cấu trúc hóa học của các diterpenoid (acid kaurenoic), sesquiterpen lacton (wedelolid A, wedelolid B, eudesmanolid), dẫn xuất acid caffeic, flavonoid và coumarin (wedelolactone).

Nghiên cứu sử dụng phối hợp ba nhóm phương pháp thực nghiệm dược học:

Phương pháp nghiên cứu thực vật và giải phẫu vi học

  • Thu hái và xử lý mẫu: Sử dụng lá và thân tươi không quá già hoặc non để quan sát hình thái; sấy khô ở nhiệt độ 60°C rồi nghiền mịn qua rây tiêu chuẩn (rây số 32) để làm bột dược liệu.
  • Kỹ thuật cắt và nhuộm vi phẫu: Cắt vi phẫu ngang ở vị trí 1/3 gân giữa lá và thân tươi bằng lưỡi dao lam. Tẩy trắng bằng dung dịch Javel (15–30 phút), rửa sạch bằng nước cất, trung hòa bằng acid acetic 1%–3% (2 phút), sau đó nhuộm kép bằng dung dịch phẩm nhuộm chuyên dụng (15 phút) trước khi lên tiêu bản soi kính hiển vi quang học OPTIKA.
  • Kỹ thuật tách biểu bì: Tách lớp biểu bì trên và biểu bì dưới từ lá tươi để quan sát hình dạng tế bào biểu bì, lỗ khí và lông che chở.

Phương pháp sơ bộ hóa thực vật (Phân tích hóa thực vật)

Dược liệu bột lá khô (10–25 g) được chiết xuất phân đoạn tuần tự theo nguyên tắc tăng dần độ phân cực của dung môi:

  • Phân đoạn 1 (Dung môi kém phân cực - Diethyl ether): Lắc chiết bột lá với diethyl ether trong bình nón, thu dịch chiết cô cách thủy còn 50 ml. Tiến hành các phản ứng định tính: bốc hơi cắn thử mùi tinh dầu, thử vết mỡ trên giấy lọc (chất béo), phản ứng Carr-Price và phản ứng với $H_2SO_4$ đặc (carotenoid), phản ứng Liebermann-Burchard (triterpenoid tự do), phản ứng tăng huỳnh quang dưới tia UV 365 nm trong môi trường kiềm (coumarin), phản ứng Borntrager (anthraquinon) và thử với thuốc thử chung alkaloid.
  • Phân đoạn 2 (Dung môi phân cực trung bình - Ethanol 96°): Bã dược liệu sau khi chiết ether được đun hồi lưu cách thủy 2–3 lần với ethanol 96° (20–30 phút/lần). Dịch chiết cồn được cô còn 50 ml để làm các phản ứng định tính: phản ứng Cyanidin với bột Mg và HCl đặc (flavonoid), phản ứng với thuốc thử Fehling (hợp chất đường khử), phản ứng tạo bọt bền trên 15 phút (saponin), phản ứng tủa và đổi màu với dung dịch $FeCl_3$ 10% cùng dung dịch gelatin muối (tanin), phản ứng sủi bọt với tinh thể $Na_2CO_3$ (acid hữu cơ), thuốc thử kiềm soi UV 365 nm (coumarin).
  • Phân đoạn 3 (Dung môi phân cực mạnh - Nước cất): Bã dược liệu tiếp tục được chiết nóng cách thủy với nước trong 10 phút (2–3 lần). Dịch chiết nước được khảo sát các nhóm chất: hợp chất polyuronid (phản ứng tủa với cồn 95% hoặc aceton), saponin, tanin, hợp chất khử và acid hữu cơ.
Bột lá Sài đất ba thùy (10–25 g)

Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật

  • Điều chế cao chiết: Lá Sài đất ba thùy khô được chia làm 2 phần, chiết hồi lưu riêng biệt với methanol ($60–70^\circ\text{C}$) và chloroform ($37–40^\circ\text{C}$), sau đó cô quay chân không để thu cao toàn phần.
  • Phương pháp thử nghiệm: Sử dụng kỹ thuật khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar method) trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) đối với vi khuẩn và Sabouraud Dextrose Agar (SDA) đối với vi nấm.
  • Chuẩn bị dịch vi sinh vật: Tạo huyền dịch vi khuẩn điều chỉnh độ đục OD ở bước sóng 600 nm về khoảng 0,08–0,12 (tương đương chuẩn 0,5 McFarland), huyền dịch nấm men đo ở bước sóng 530 nm.
  • Bố trí giếng thử: Đục giếng thạch đường kính 6 mm. Nồng độ cao thử nghiệm: 50 mg/ml pha trong DMSO 10%, nạp 50 µl vào giếng (tương ứng 2500 µg/giếng). Đối chứng dương: Ciprofloxacin (10 µg/giếng) cho vi khuẩn, Fluconazole (10 µg/giếng) cho vi nấm. Đối chứng âm: DMSO 10% và dung môi tinh khiết.
  • Đánh giá mức độ kháng: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn (zone of inhibition):
    • $\ge 15\text{ mm}$: Kháng mạnh
    • $10 - 14\text{ mm}$: Kháng vừa
    • $< 9\text{ mm}$: Kháng yếu
    • $0\text{ mm}$: Không kháng

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các nghiên cứu đã công bố về phân loại học thực vật, thành phần hóa thực vật và tác dụng dược lý của hai loài thuộc chi Wedelia:

  • Đặc điểm phân loại học: Trình bày vị trí phân loại của bộ Asterales, họ Asteraceae, chi Wedelia và hệ thống đồng danh khoa học của Wedelia trilobata (Sphagneticola trilobata, Wedelia carnosa, Wedelia paludosa) và Wedelia chinensis (Solidago chinensis, Verbesina calendulacea).
  • Thành phần hóa học của W. trilobata: Dẫn chứng các nghiên cứu quốc tế về 6 dẫn xuất eudesmanolid và acid ent-kaurenic (Bohlman và cs., 1981); thành phần tinh dầu hoa chứa 48 cấu tử với $\beta$-phellandren (25,65%), limonen (8,93%), $\gamma$-terpinen (5,90%) (2004); 6 sesquiterpen dạng prostatolid (Zhang Yuhu, 2004); tinh dầu lá chứa $\alpha$-pinen, germacren D và d-limonen chiếm 85,52% (Nirmal và cs., 2005); các hợp chất diterpen và triterpen friedelan-3$\beta$-ol, $\beta$-amyrin acetat (Nguyễn Thanh Hoàng và cs., 2006); wedelolid A và wedelolid B (Phan Toan Duc và cs., 2007).
  • Thành phần hóa học của W. chinensis: Dẫn chứng công trình cô lập acid kaur-16-en-19-oic, stigmasterol glucosid (Yang Ling Ling, 1986); acid 3,5-dicaffeoylquinic và 3-O-$\beta$-glucopyranosylkaempferol (astragalin) (Apers Sandra và cs., 2002).
  • Tổng quan dược lý: Tóm lược hoạt tính chống oxy hóa, hạ đường huyết qua ức chế $\alpha$-glucosidase, ức chế thần kinh trung ương, kháng Leishmania, làm lành vết thương (tăng sinh nguyên bào sợi L929 trên 85-90%) và kháng viêm của W. trilobata. Đồng thời phân tích tác dụng bảo vệ tế bào gan chống độc tính $CCl_4$, chống ung thư biểu mô EAC, ức chế androgen và an thần của W. chinensis.
  • Tổng quan vi sinh: Mô tả hình thái, đặc tính sinh học và bệnh học của 5 chủng vi sinh vật thử nghiệm (S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, C. tropicalis).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc mẫu dược liệu, danh mục trang thiết bị (máy cô quay IKA RV10, kính hiển vi OPTIKA, máy đo quang Gene Quant 1300, tủ ấm Memmert, máy lắc IKA KS 4000i), dung môi hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích. Mô tả toàn bộ quy trình chuẩn bị mẫu vi phẫu, quy trình phân tích sơ bộ 3 phân đoạn hóa học (dịch chiết ether, dịch chiết cồn, dịch chiết nước) bằng các phản ứng ống nghiệm đặc trưng và quy trình thử nghiệm vi sinh vật qua đĩa thạch.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Trình bày chi tiết các phát hiện thực nghiệm về mặt hình thái học, đặc điểm giải phẫu vi thể, kết quả định tính các nhóm hoạt chất và đường kính vòng vô khuẩn trong thử nghiệm kháng vi sinh vật. Tác giả tiến hành so sánh đối chiếu trực tiếp giữa hai loài W. trilobata và W. chinensis nhằm rút ra các tiêu chí phân biệt rõ ràng.

Kết quả và đóng góp

1. Đặc điểm hình thái học và giải phẫu vi học

Nghiên cứu đã xác lập các tiêu chí phân biệt hình thái và vi phẫu giữa Sài đất ba thùy và Sài đất:

Bộ phận khảo sát Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata) Sài đất (Wedelia chinensis)
Hình thái lá tươi Phiến xẻ 3 thùy chân vịt sâu 1/2 phiến lá; kích thước 5–9 cm x 2–5 cm; mép có răng cưa đều; từ gốc cuống lá tỏa ra 3 gân chính rõ rệt. Phiến hình mác rộng/thon dài, không cuống; kích thước 1,5–5 cm x 0,8–2 cm; mép chỉ có 1–3 răng to nông; gân chính nổi rõ ở mặt dưới.
Bột lá Mịn, màu xanh xám, mùi thơm nhẹ, vị đắng nhẹ. Màu lục xám, vị hơi mặn, hơi đắng.
Hình thái thân cây Thân bò tròn, dài 10–30 cm (có thể lan 1,8 m), màu xanh hoặc hơi đỏ. Thân non giòn, nhiều lông mịn; thân già dai, ít lông. Thân bò màu xanh, mang lông trắng cứng nhỏ, mọc rễ tại các đốt tiếp xúc đất.
Bột thân Màu vàng nhạt, thô ráp, không có vị đặc biệt. Màu xanh lục, vị hơi mặn, có mùi thơm dễ chịu.

2. Thành phần hóa thực vật sơ bộ lá Sài đất ba thùy

Kết quả sàng lọc hóa thực vật trên lá Wedelia trilobata và đối chiếu với dữ liệu loài Wedelia chinensis:

Nhóm hợp chất Phân đoạn dịch chiết phát hiện (W. trilobata) Hiện diện ở W. trilobata Hiện diện ở W. chinensis (Tham khảo)
Flavonoid Dịch chiết cồn (Phản ứng Cyanidin dương tính) Có Có
Tanin Dịch chiết cồn, dịch chiết nước ($FeCl_3$, gelatin muối) Có Có
Carotenoid Dịch chiết ether (Phản ứng Carr-Price, $H_2SO_4$ đặc) Có Có
Chất béo Dịch chiết ether (Vết mờ trên giấy lọc) Có Có
Tinh dầu Dịch chiết ether (Mùi thơm đặc trưng) Có Có
Hợp chất khử (Đường) Dịch chiết cồn, dịch chiết nước (Thuốc thử Fehling) Có Có
Triterpenoid tự do Dịch chiết ether (Liebermann-Burchard) Có Có
Acid hữu cơ Dịch chiết cồn, dịch chiết nước (Sủi bọt với $Na_2CO_3$) Có Có
Hợp chất Polyuronid Dịch chiết nước (Tủa với cồn 95%/aceton) Có Có
Coumarin Dịch chiết ether, dịch chiết cồn (Huỳnh quang UV) Không Có
Saponin Dịch chiết cồn, dịch chiết nước (Thử nghiệm tạo bọt) Không Có
Anthraquinon Dịch chiết ether (Phản ứng Borntrager) Không Không
Alkaloid Dịch chiết ether, cồn, nước (Thuốc thử chung) Không Không

Ghi chú: Điểm khác biệt quan trọng nhất về mặt hóa thực vật sơ bộ giữa hai loài là lá Sài đất ba thùy không cho phản ứng dương tính với coumarin và saponin, trong khi Sài đất truyền thống có chứa hai nhóm chất này.

3. Hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm

  • Thử nghiệm trên 5 chủng vi sinh vật chuẩn ở nồng độ cao 2500 µg/giếng:
    • Cả cao methanol và cao chloroform từ lá Sài đất ba thùy đều thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc đối với chủng Tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus - MRSA ATCC 43300) với đường kính vòng vô khuẩn ghi nhận là 8 mm (thuộc mức độ kháng yếu).
    • Không ghi nhận hoạt tính ức chế rõ rệt đối với các chủng trực khuẩn Gram âm (E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae) và nấm men Candida tropicalis ở nồng độ khảo sát.

4. Đóng góp khoa học của đề tài

  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm có hệ thống về hình thái giải phẫu, vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột của loài Wedelia trilobata di thực tại Việt Nam.
  • Xác định sự khác biệt hóa học đặc trưng giữa W. trilobata và W. chinensis, giúp phân biệt hai loài và hỗ trợ bổ sung tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu nhằm phục vụ định hướng tiêu chuẩn hóa vào Dược điển Việt Nam V.
  • Chứng minh dịch chiết lá Sài đất ba thùy có hoạt tính ức chế đối với chủng vi khuẩn đề kháng thuốc nguy hiểm MRSA.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

  • Đề tài mới dừng lại ở bước định tính sơ bộ các nhóm hoạt chất trong lá bằng phản ứng ống nghiệm, chưa tiến hành phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc cụ thể của từng hoạt chất đơn lẻ.
  • Thử nghiệm kháng vi sinh vật mới thực hiện bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên cao toàn phần, chưa xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC).
  • Chưa tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học trên các bộ phận khác như thân, hoa hoặc rễ của cây.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Triển khai phân lập định hướng hoạt tính sinh học để tách chiết các hoạt chất tinh khiết có tác dụng kháng MRSA từ phân đoạn cao chiết lá.
  • Mở rộng thử nghiệm hoạt tính kháng sinh trên dải chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng thuốc rộng hơn và xác định chính xác giá trị MIC, MBC.
  • Xây dựng quy trình định lượng hoạt chất chính bằng phương pháp HPLC nhằm hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn chất lượng kiểm nghiệm dược liệu.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

  • Sinh viên và học viên ngành Dược (chuyên ngành Dược học, Dược liệu, Sản xuất và phát triển thuốc, Kiểm nghiệm thuốc): Tham khảo quy trình phân tích vi phẫu thực vật, kỹ thuật chiết phân đoạn hóa thực vật và quy trình thử nghiệm vi sinh chuẩn hóa.
  • Kiểm nghiệm viên và cán bộ nghiên cứu dược liệu: Sử dụng các số liệu mô tả hình thái phiến lá 3 thùy, đặc điểm bột và sự vắng mặt của coumarin/saponin để phân biệt, kiểm tra tạp nhiễm hoặc nhầm lẫn giữa Wedelia trilobata và Wedelia chinensis trên thị trường dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Điểm khác biệt hình thái rõ nét nhất giữa lá Sài đất ba thùy và lá Sài đất là gì?

Lá Sài đất ba thùy (W. trilobata) có phiến lá xẻ 3 thùy dạng chân vịt sâu khoảng 1/2 phiến lá, kích thước 5–9 cm x 2–5 cm và từ cuống tỏa ra 3 gân chính rõ rệt. Trong khi đó, lá Sài đất (W. chinensis) là lá đơn nguyên hình mác rộng hoặc bầu dục thon dài, kích thước nhỏ hơn (1,5–5 cm x 0,8–2 cm), mép chỉ có 1–3 đôi răng cưa nông và chỉ có 1 gân chính nổi rõ.

2. Về thành phần hóa học, lá Sài đất ba thùy khác với Sài đất truyền thống ở những nhóm chất nào?

Theo kết quả sơ bộ hóa thực vật, lá Sài đất ba thùy có chứa flavonoid, tanin, carotenoid, chất béo, tinh dầu, hợp chất khử, triterpenoid tự do, acid hữu cơ và polyuronid; nhưng không có coumarin và saponin – hai nhóm chất vốn có mặt trong cây Sài đất (W. chinensis). Cả hai loài đều không chứa anthraquinon và alkaloid trong các phép thử thực nghiệm.

3. Dịch chiết lá Sài đất ba thùy thể hiện hoạt tính kháng chủng vi sinh vật nào trong nghiên cứu?

Cả dịch chiết methanol và chloroform từ lá Sài đất ba thùy đều cho kết quả kháng vi khuẩn tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus - MRSA ATCC 43300) ở nồng độ thử nghiệm 2500 µg/giếng, với đường kính vòng vô khuẩn đạt 8 mm.

4. Quy trình sơ bộ hóa thành phần hóa học được thực hiện qua các phân đoạn dung môi nào?

Quy trình chiết xuất sử dụng 3 hệ dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực:

  1. Diethyl ether (chiết phân đoạn kém phân cực để tìm tinh dầu, chất béo, carotenoid, triterpenoid, coumarin, alkaloid).
  2. Ethanol 96° (đun hồi lưu bã chiết để định tính flavonoid, tanin, saponin, hợp chất khử, acid hữu cơ).
  3. Nước cất nóng (chiết bã cồn để xác định hợp chất polyuronid, tanin, saponin, đường khử).

5. Dung môi nào được dùng để hòa tan cao chiết khi thử nghiệm kháng vi sinh vật bằng phương pháp giếng thạch?

Cao chiết methanol và chloroform được hòa tan trong dung môi Dimethyl sulfoxide (DMSO) nồng độ 10% để tạo nồng độ mẫu thử 50 mg/ml (50 µl dung dịch nạp vào giếng tương đương 2500 µg hoạt chất).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hồng Gia Ân đã thực hiện thành công việc khảo sát toàn diện đặc điểm hình thái, giải phẫu vi thể thân, lá và bột của loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata), đồng thời chỉ ra các tiêu chuẩn then chốt để phân biệt với loài Sài đất (Wedelia chinensis). Nghiên cứu xác định lá Sài đất ba thùy chứa 9 nhóm hợp chất hóa thực vật chính nhưng không có coumarin và saponin. Kết quả thử nghiệm vi sinh ghi nhận cao chiết methanol và chloroform từ lá Sài đất ba thùy có hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn đề kháng MRSA với đường kính vòng kháng khuẩn 8 mm, tạo cơ sở khoa học cho công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu và định hướng nghiên cứu phát triển các chế phẩm kháng khuẩn mới từ nguồn thực vật này.