Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Dành dành láng (Gardenia philastrei), Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis) và Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides) tại Việt Nam" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Khắc Hưng, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Vũ Đình Hoàng và PGS. Nguyễn Hữu Tùng. Luận án thuộc chuyên ngành Hóa học (mã số: 9440112), được hoàn thành năm 2024 tại Trường Hóa và Khoa học Sự sống – Đại học Bách Khoa Hà Nội, có sự phối hợp nghiên cứu với Khoa Dược – Đại học Phenikaa và Trung tâm Phát triển Công nghệ cao thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhận tài trợ kinh phí từ Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) theo đề tài mã số 104.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Chi Dành dành (Gardenia), thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), là một chi thực vật lớn với khoảng 140–200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Đại Dương. Tại Việt Nam, các tài liệu thực vật học đã ghi nhận sự hiện diện của 13 loài thuộc chi này. Các công trình khoa học quốc tế trước đây đã chứng minh nhiều loài trong chi Gardenia chứa các nhóm hoạt chất có giá trị sinh học cao thuộc lớp terpene (monoterpene, iridoid, triterpene, diterpene carotenoid) và phenolic (flavonoid, phenolic acid, lignan), mang lại các tác dụng dược lý như gây độc tế bào ung thư, chống viêm, hạ đường huyết, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh.

Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về chi Gardenia vẫn còn hạn chế. Đối với loài Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides), các công bố trong nước chủ yếu tập trung vào quả, trong khi bộ phận cành và lá chưa được khảo sát đầy đủ. Đặc biệt, hai loài Dành dành láng (Gardenia philastrei) và Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis) hoàn toàn chưa từng có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học được công bố tại Việt Nam cũng như trên thế giới. Xuất phát từ thực tiễn đó, việc thực hiện luận án nhằm cung cấp dữ liệu khoa học toàn diện về thành phần hóa học và tiềm năng hoạt tính sinh học của ba loài thực vật này.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

  1. Nghiên cứu thành phần hóa học của một số mẫu Dành dành láng (Gardenia philastrei), Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis) và Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides) thu hái tại Việt Nam.
  2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các chất phân lập được nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm năng ứng dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư, tiểu đường và các bệnh lý viêm ở người.

Nội dung nghiên cứu

Luận án triển khai ba nội dung cụ thể:

  1. Phân lập các hợp chất từ lá loài G. philastrei và loài G. angkorensis, từ cành và lá loài G. jasminoides bằng các phương pháp sắc ký.
  2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư, hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO), hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của một số hợp chất phân lập được, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sàng lọc dược chất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Mẫu lá cây Dành dành láng (Gardenia philastrei Pierre ex Pit., 1923).
    • Mẫu lá cây Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis Pit., 1923).
    • Mẫu cành và lá cây Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides Ellis, 1761).
  • Phạm vi không gian: Mẫu lá của G. philastrei và G. angkorensis được thu hái tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu (giám định bởi ThS. Lê Văn Sơn). Mẫu cành và lá của G. jasminoides được thu hái tại tỉnh Ninh Bình (giám định bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng, Trường Đại học Dược Hà Nội). Mẫu tiêu bản đều được lưu giữ tại Trung tâm Phát triển Công nghệ Hóa học Nông nghiệp thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu được thu thập vào tháng 8/2019 (G. jasminoides) và tháng 5/2020 (G. philastrei, G. angkorensis). Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm được tổng hợp và hoàn thành trong giai đoạn 2020–2024.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến phân loại thực vật, thành phần hóa học và dược lý của chi Gardenia:

Các hướng nghiên cứu trước đây

  • Về phân loại và thực vật học: Phạm Hoàng Hộ (1993–2003), Nguyễn Tiến Bân (2005) và Võ Văn Chi (2004, 2012) đã ghi nhận và mô tả 13 loài Dành dành tại Việt Nam, trong đó có 4 loài thường dùng trong y học cổ truyền. Martins và Nunez (2015) phân tích tổng quan họ Cà phê và khẳng định hai nhóm chất chính trong chi Gardenia là terpene và phenolic.
  • Về thành phần hóa học:
    • Iridoid và monoterpene: Các công trình quốc tế đã phân lập khoảng 65 iridoid từ chi Gardenia, điển hình như genipin, geniposide, geniposidic acid, scandoside methyl ester, shanzhiside, gardenoside. Cao và cộng sự (2021) phân lập 6-nicotinoyloxy geniposide và các bis-iridoid như disperoside A và B từ quả G. jasminoides. Li và cộng sự (2013) phân lập jasmigeniposide B. Yu và cộng sự (2010) phân lập các monoterpene mạch thẳng jasminoside N, O, P.
    • Triterpene: Wang và cộng sự (2012) phân lập 10 triterpene saponin thuộc khung oleanane từ G. jasminoides (gardeniside A–C, chikusetsusaponin IVa). Nuanyai và cộng sự (2009, 2010, 2011) công bố các hợp chất cycloartane và 3,4-seco-cycloartane từ G. sootepensis (sootepin A–L, coronalolide), G. tubifera (gardenoin A–D) và G. obtusifolia (gardenoin E–H, dikamakiartane A, C, D). Mai và cộng sự (2016) khảo sát triterpene dammarane và cycloartane từ dịch mủ G. urvillei. Kaennakam và cộng sự (2018) phân lập 10 saponin oleanane và ursane (erythrosaponin A–J) từ G. erythroclada.
    • Diterpene và sesquiterpene: Nhóm diapocarotenoid (crocetin) và các dẫn xuất glycoside tan trong nước (crocin I–IV, neocrocin A–J) được phân lập từ quả G. jasminoides. Một số sesquiterpene khung guaiene và thành phần tinh dầu hoa (linalool chiếm 34,7%, geraniol, farnesene) cũng đã được xác định.
    • Flavonoid, phenolic acid và lignan: Các polymethoxyflavone giàu nhóm oxy được tìm thấy ở G. lucida, G. fosbergii, G. cramerii. Chen và cộng sự (2021) phân lập dẫn xuất quinic acid từ quả G. jasminoides. Cao và cộng sự (2021) tách chiết 7 hợp chất lignan từ quả G. jasminoides; Tshitenge và cộng sự (2017) ghi nhận 8 neolignan (gardenifolin A–H) từ G. ternifolia.
  • Về hoạt tính sinh học:
    • Kháng viêm: Koo và cộng sự (2006) chứng minh cao chiết G. jasminoides, genipin và geniposide ức chế phản ứng phù chân và giảm NO trong mô hình viêm túi khí carrageenan ở chuột. Cao và cộng sự chứng minh crocusatin C và O bảo vệ tế bào thận NRK-52e khỏi tác nhân gây viêm LPS.
    • Hỗ trợ điều trị tiểu đường: Chen và cộng sự (2006) ghi nhận cao chiết nước G. jasminoides (200 mg/kg) hạ glucose huyết và tăng PPAR$\gamma$ trên chuột kháng insulin. Geniposide làm giảm dung nạp glucose bất thường và giảm tổn thương mạch máu do đường huyết cao.
    • Gây độc tế bào ung thư: Nuanyai và cộng sự (2009) chỉ ra các triterpene 3,4-seco-cycloartane chứa vòng $\gamma$-lactone từ G. sootepensis gây độc trên các dòng tế bào ung thư BT474, CHAGO, HepG2, KATO-3, SW-620 với giá trị $\text{IC}_{50}$ từ 1,1 đến 8,9 $\mu\text{M}$. Phromnoi và cộng sự (2010) báo cáo hợp chất 5,3'-dihydroxy-3,6,7,8,4'-pentamethoxyflavone từ G. obtusifolia ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua con đường AKT-GSK3$\beta$.
    • Nghiên cứu tại Việt Nam: Đỗ Huy Bích và cộng sự (2006) mô tả thành phần sơ bộ của quả, lá và hoa G. jasminoides. Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự (2022) phân lập geniposide, genipin-1-O-$\beta$-D-gentiobioside từ quả và thử nghiệm ức chế NO trên tế bào RAW264.7.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình trước đây tập trung phần lớn vào quả của loài G. jasminoides, chưa nghiên cứu cặn kẽ phần cành lá. Riêng hai loài G. philastrei và G. angkorensis tại Việt Nam hoàn toàn chưa có công bố nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách tiến hành phân lập, xác định cấu trúc chi tiết và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro có định hướng đối với cả ba loài trên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa phương pháp hóa học các hợp chất thiên nhiên thực nghiệm (chiết xuất, sắc ký phân lập, phổ nghiệm cấu trúc) và các mô hình thử nghiệm sinh học in vitro.

Khung lý thuyết và quy trình phân lập

  • Chiết xuất: Bột nguyên liệu thực vật khô được chiết hồi lưu hoặc ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp (ethanol, methanol), sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cao tổng và phân đoạn dung môi (n-hexane, dichloromethane/chloroform, ethyl acetate, nước).
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\text{ F}_{254}$ (Merck), quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng $\lambda = 254\text{ nm}$ và phun dung dịch hiện màu vanillin – sulfuric acid, gia nhiệt ở 100–110°C trong 1–2 phút.
  • Sắc ký lớp mỏng điều chế (PLC): Sử dụng bản mỏng kích thước $20 \times 20\text{ cm}$, triển khai với các hệ dung môi như DCM/MeOH (90:10), DCM/MeOH/acetic acid (98:2:0,2). Vết chất được cạo tách và rửa giải bằng dung môi phù hợp.
  • Sắc ký cột (CC): Sử dụng cột thủy tinh với pha tĩnh silica gel thường (Kieselgel 60, kích thước hạt 70–230 mesh và 230–400 mesh, Merck) và silica gel pha đảo (YMC RP-18, hạt $50\ \mu\text{m}$).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa trên sự kết hợp của các phương pháp phổ nghiệm hiện đại:

  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Xác định khối lượng phân tử chính xác, pic ion giả phân tử $[\text{M}+\text{H}]^+$, $[\text{M}+\text{Na}]^+$ hoặc $[\text{M}-\text{H}]^-$ và công thức phân tử.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1D-NMR): Ghi phổ $^{1}\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz}$), DEPT90 và DEPT135 nhằm xác định độ chuyển dịch hóa học $\delta$ (ppm), hằng số tương tác $J$ (Hz), số lượng và trạng thái lai hóa của các nguyên tử carbon ($\text{CH}_3, \text{CH}_2, \text{CH}, \text{C}$ bậc 4). Dung môi đo phổ gồm $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{CDCl}_3$, $\text{DMSO-}d_6$; chất chuẩn nội là tetramethylsilane (TMS).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR): Bao gồm phổ COSY ($^{1}\text{H}-^{1}\text{H}$ tương tác đồng hạt nhân), HSQC ($^{1}\text{H}-^{13}\text{C}$ tương tác trực tiếp qua một liên kết) và HMBC ($^{1}\text{H}-^{13}\text{C}$ tương tác xa qua 2–3 liên kết), giúp liên kết các mảnh cấu trúc và xác định vị trí nhóm thế.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  1. Hoạt tính ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO): Đánh giá trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 được kích thích phản ứng viêm bằng lipopolysaccharide (LPS). Nồng độ NO trong môi trường nuôi cấy được định lượng gián tiếp qua nồng độ ion nitrite ($\text{NO}2^-$) bằng phản ứng Griess; độ hấp thụ quang được đo tại bước sóng $540\text{ nm}$ để xác định giá trị $\text{IC}{50}$.
  2. Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Phản ứng in vitro giữa enzyme $\alpha$-glucosidase (từ nấm men) và cơ chất $p$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG). Mức độ giải phóng $p$-nitrophenol được đo quang phổ ở bước sóng $405\text{ nm}$, tính toán phần trăm ức chế và giá trị $\text{IC}_{50}$.
  3. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH: Đánh giá khả năng khử gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) của các hợp chất phenolic tại bước sóng $517\text{ nm}$, xác định nồng độ quét 50% gốc tự do ($\text{SC}_{50}$).
  4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư (MTT assay): Thử nghiệm trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú). Khả năng sống sót của tế bào được định lượng thông qua sự khử muối MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) thành tinh thể formazan màu tím bởi enzyme dehydrogenase trong ty thể, đo quang ở bước sóng $540\text{ nm}$, tính toán giá trị $\text{IC}_{50}$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố của 3 loài Gardenia philastrei, Gardenia angkorensis và Gardenia jasminoides. Đồng thời, chương 1 phân loại và thống kê chi tiết các nhóm hợp chất hóa học đã từng được phân lập từ chi Gardenia trên thế giới (gồm 65 iridoid, 44 monoterpene, hơn 95 triterpene, 17 diterpene carotenoid, 4 sesquiterpene, 41 flavonoid, 12 acid hữu cơ/phenolic và 15 hợp chất lignan) cùng các nghiên cứu dược lý tương ứng (kháng viêm, hạ đường huyết, gây độc tế bào ung thư, bảo vệ thần kinh, điều hòa lipid máu). Qua đó, chương chỉ rõ sự thiếu hụt nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Dành dành láng và Dành dành Angkor.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết:

  • Thông tin mẫu vật: Địa điểm, thời gian thu hái và người giám định khoa học của 3 loài thực vật.
  • Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập các phân đoạn cặn chiết của lá G. philastrei, lá G. angkorensis và cành lá G. jasminoides.
  • Phương pháp luận và thiết bị đo phổ (HR-ESI-MS, NMR 1D/2D) phục vụ giải đoán cấu trúc phân tử.
  • Các quy trình thực nghiệm chi tiết cho 4 thử nghiệm sinh học in vitro (ức chế NO, ức chế $\alpha$-glucosidase, quét gốc tự do DPPH, độc tế bào MTT trên 4 dòng ung thư).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày việc phân lập, giải đoán cấu trúc của 31 hợp chất tinh khiết và kết quả đánh giá hoạt tính sinh học:

1. Các hợp chất phân lập từ Dành dành láng (Gardenia philastrei)

Từ mẫu lá của G. philastrei, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất (ký hiệu GP1 đến GP9), bao gồm 8 triterpene khung cycloartane/seco-cycloartane và 1 flavonoid:

  • GP1: Coronalyl acetate — Hợp chất mới.
  • GP2: Coronalolic acid.
  • GP3: Sootepin D.
  • GP4: Sootepin G.
  • GP5: Coronalolide methyl ester.
  • GP6: Coronalolide.
  • GP7: 23-deoxojessic acid.
  • GP8: Quadrangularic acid E.
  • GP9: 5,7,3'-trihydroxy-6,4',5'-trimethoxyflavone.

2. Các hợp chất phân lập từ Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis)

Từ mẫu lá của G. angkorensis, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 18 hợp chất (ký hiệu GA1 đến GA18), thuộc các nhóm neolignan glycoside, phenolic glycoside, flavonoid, proanthocyanidin, triterpene và monoterpene glycoside:

  • GA1: Hedyotol C 7''-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
  • GA2: Angkorenside A — Hợp chất mới.
  • GA3: Angkorenside B — Hợp chất mới.
  • GA4: Lyoniresinol 3a-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
  • GA5: Cuneataside E.
  • GA6: 4-hydroxyacetophenone-4-O-$\beta$-D-apiofuranosyl-(1$\rightarrow$6)-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
  • GA7: Epicatechin.
  • GA8: Quercetin-3-O-$\beta$-D-galactopyranoside.
  • GA9: Quercetin-3-O-$\beta$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside (Rutin).
  • GA10: Proanthocyanidin A1.
  • GA11: Proanthocyanidin A2.
  • GA12: Cinnamtannin B1.
  • GA13: Aesculitannin B.
  • GA14: 19-hydroxyoleanolic acid 3-O-$\beta$-D-glucuronopyranoside.
  • GA15: Chikusetsusaponin IVa.
  • GA16: 3,16,21,23,24-pentahydroxy-urs-12,18,20-trien-28-oic acid $\gamma$-lactone.
  • GA17: Linalool glucoside.
  • GA18: Linalyl 6-O-$\alpha$-L-arabinopyranosyl-$\beta$-D-glucopyranoside.

3. Các hợp chất phân lập từ Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides)

Từ mẫu cành và lá của G. jasminoides, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất (ký hiệu GJ1 đến GJ4):

  • GJ1: Betulinic acid (triterpene khung lupane).
  • GJ2: 6-hydroxygeniposide (iridoid glycoside).
  • GJ3: 6-hydroxygeniposide (đồng phân/dẫn xuất iridoid glycoside).
  • GJ4: Geniposide (iridoid glycoside).

Bảng tổng hợp danh mục 31 hợp chất phân lập được từ 3 loài Dành dành trong luận án:

Loài thực vật Ký hiệu Tên hợp chất Phân loại hóa học Ghi chú
G. philastrei GP1 Coronalyl acetate Cycloartane triterpene Hợp chất mới
G. philastrei GP2 Coronalolic acid Cycloartane triterpene
G. philastrei GP3 Sootepin D Seco-cycloartane triterpene
G. philastrei GP4 Sootepin G Seco-cycloartane triterpene
G. philastrei GP5 Coronalolide methyl ester Seco-cycloartane triterpene
G. philastrei GP6 Coronalolide Seco-cycloartane triterpene
G. philastrei GP7 23-deoxojessic acid Cycloartane triterpene
G. philastrei GP8 Quadrangularic acid E Cycloartane triterpene
G. philastrei GP9 5,7,3'-trihydroxy-6,4',5'-trimethoxyflavone Flavonoid
G. angkorensis GA1 Hedyotol C 7''-O-$\beta$-D-glucopyranoside Neolignan glycoside
G. angkorensis GA2 Angkorenside A Phenolic/Lignan glycoside Hợp chất mới
G. angkorensis GA3 Angkorenside B Phenolic/Lignan glycoside Hợp chất mới
G. angkorensis GA4 Lyoniresinol 3a-O-$\beta$-D-glucopyranoside Lignan glycoside
G. angkorensis GA5 Cuneataside E Phenolic glycoside
G. angkorensis GA6 4-hydroxyacetophenone-4-O-$\beta$-D-apiofuranosyl-(1$\rightarrow$6)-O-$\beta$-D-glucopyranoside Acetophenone glycoside
G. angkorensis GA7 Epicatechin Flavan-3-ol
G. angkorensis GA8 Quercetin-3-O-$\beta$-D-galactopyranoside Flavonol glycoside
G. angkorensis GA9 Quercetin-3-O-$\beta$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside Flavonol glycoside
G. angkorensis GA10 Proanthocyanidin A1 Proanthocyanidin dimer
G. angkorensis GA11 Proanthocyanidin A2 Proanthocyanidin dimer
G. angkorensis GA12 Cinnamtannin B1 Proanthocyanidin trimer
G. angkorensis GA13 Aesculitannin B Proanthocyanidin trimer
G. angkorensis GA14 19-hydroxyoleanolic acid 3-O-$\beta$-D-glucuronopyranoside Oleanane saponin
G. angkorensis GA15 Chikusetsusaponin IVa Oleanane saponin
G. angkorensis GA16 3,16,21,23,24-pentahydroxy-urs-12,18,20-trien-28-oic acid $\gamma$-lactone Ursane triterpene lactone
G. angkorensis GA17 Linalool glucoside Monoterpene glycoside
G. angkorensis GA18 Linalyl 6-O-$\alpha$-L-arabinopyranosyl-$\beta$-D-glucopyranoside Monoterpene glycoside
G. jasminoides GJ1 Betulinic acid Lupane triterpene
G. jasminoides GJ2 6-hydroxygeniposide Iridoid glycoside
G. jasminoides GJ3 6-hydroxygeniposide Iridoid glycoside
G. jasminoides GJ4 Geniposide Iridoid glycoside

4. Đánh giá hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO): Thử nghiệm trên các hợp chất cycloartane triterpene từ G. philastrei và các hợp chất phenolic từ G. angkorensis trên tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS. Một số dẫn xuất cycloartane và proanthocyanidin thể hiện khả năng ức chế giải phóng NO phụ thuộc vào nồng độ mà không gây độc tế bào ở nồng độ thử nghiệm.
  • Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Thử nghiệm trên các iridoid từ G. jasminoides và các terpene từ G. angkorensis, xác định khả năng kìm hãm hoạt tính xúc tác thủy phân của enzyme.
  • Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH: Thử nghiệm trên các hợp chất phenolic, flavonoid và proanthocyanidin oligomer từ G. angkorensis, xác định giá trị $\text{SC}_{50}$. Các hợp chất nhóm polyphenol và proanthocyanidin thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do DPPH rõ rệt.
  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đánh giá trên 4 dòng tế bào ung thư KB, HepG2, A549 và MCF-7 đối với các hợp chất terpene từ G. angkorensis và G. philastrei. Kết quả xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ cho thấy các hợp chất triterpene có cấu trúc chứa vòng lactone thể hiện mức độ ức chế sinh trưởng tế bào ung thư đáng kể.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  1. Khám phá hóa thực vật lần đầu tiên: Luận án là công trình đầu tiên trên thế giới nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Dành dành láng (Gardenia philastrei) và Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis).
  2. Phát hiện các cấu trúc mới: Luận án đã xác định được cấu trúc của 3 hợp chất tự nhiên mới chưa từng được công bố trong các cơ sở dữ liệu hóa học:
    • Coronalyl acetate (GP1): Triterpene khung cycloartane phân lập từ lá Gardenia philastrei.
    • Angkorenside A (GA2): Hợp chất glycoside phân lập từ lá Gardenia angkorensis.
    • Angkorenside B (GA3): Hợp chất glycoside phân lập từ lá Gardenia angkorensis.
  3. Làm giàu cơ sở dữ liệu phổ học: Cung cấp bộ dữ liệu phổ đầy đủ (HR-ESI-MS, $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) của 31 hợp chất phân lập từ 3 loài Dành dành, góp phần làm sáng tỏ đặc điểm hóa phân loại (chemotaxonomy) của chi Gardenia tại khu vực Đông Dương.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Cung cấp dữ liệu hoạt tính sinh học: Bổ sung các dẫn liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng viêm (ức chế NO), ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase, chống oxy hóa (DPPH) và gây độc tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào người (KB, HepG2, A549, MCF-7) của các chất sạch.
  2. Cơ sở định hướng ứng dụng: Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề khoa học cho việc định hướng sàng lọc các hoạt chất tiềm năng trong phát triển dược phẩm và các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe từ nguồn thảo dược Việt Nam.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

  • Tiếp tục nghiên cứu mở rộng sang các bộ phận khác (thân, vỏ rễ, hoa, quả) của loài G. philastrei và G. angkorensis.
  • Thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ phân tử và thử nghiệm dược lý in vivo trên động vật đối với các hợp chất có hoạt tính cao (đặc biệt là các cycloartane triterpene và dẫn xuất phenolic mới).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Giới hạn bộ phận nghiên cứu: Luận án mới chỉ tập trung khảo sát thành phần hóa học trên bộ phận lá của G. philastrei và G. angkorensis, cùng bộ phận cành lá của G. jasminoides, chưa tiến hành phân tích đồng thời tất cả các bộ phận khác của cây.
  • Giới hạn quy mô thử nghiệm sinh học: Các đánh giá hoạt tính sinh học mới dừng lại ở các phép thử in vitro trên mô hình enzyme và dòng tế bào nuôi cấy, chưa mở rộng đánh giá in vivo trên động vật thực nghiệm.
  • Số lượng chất thử nghiệm: Do hàm lượng phân lập của một số hợp chất tinh khiết còn hạn chế, các thử nghiệm sinh học chỉ được tiến hành trên một số nhóm chất đại diện có lượng mẫu đủ đáp ứng yêu cầu thử nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn cặn chiết còn lại và từ các bộ phận khác của 3 loài cây.
  • Triển khai các nghiên cứu bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa cấu trúc từ các khung triterpene cycloartane và iridoid thu nhận được.
  • Đánh giá độc tính bán trường diễn và thử nghiệm tác dụng dược lý trên các mô hình bệnh học in vivo đối với các hợp chất tiềm năng.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên ngành Hóa học, Hóa thực vật và Dược học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên bằng các hệ sắc ký hiện đại (silica gel, pha đảo RP-18, PLC điều chế) và phương pháp luận giải đoán phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho các khung cấu trúc phức tạp (cycloartane, seco-cycloartane triterpene, proanthocyanidin oligomer, iridoid và neolignan glycoside).
  • Các nhà khoa học trong lĩnh vực sàng lọc thuốc từ thiên nhiên: Luận án cung cấp các quy trình chuẩn đánh giá hoạt tính in vitro (ức chế NO trên RAW264.7, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase, dập tắt gốc tự do DPPH, gây độc tế bào MTT) cùng các số liệu hoạt tính cụ thể của 31 hợp chất tự nhiên.
  • Cơ quan quản lý và bảo tồn tài nguyên sinh vật: Cung cấp thông tin khoa học về giá trị hóa học và sinh học của các loài thực vật bản địa tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu, hỗ trợ công tác bảo tồn nguồn gen và định hướng khai thác bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã nghiên cứu những loài thực vật nào, thu hái ở đâu và do ai giám định?

Luận án nghiên cứu 3 loài thực vật thuộc chi Gardenia:

  • Lá Dành dành láng (Gardenia philastrei Pierre ex Pit., 1923): Thu hái tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu vào tháng 5/2020, giám định bởi ThS. Lê Văn Sơn.
  • Lá Dành dành Angkor (Gardenia angkorensis Pit., 1923): Thu hái tại Khu Bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu vào tháng 5/2020, giám định bởi ThS. Lê Văn Sơn.
  • Cành và lá Dành dành chi tử (Gardenia jasminoides Ellis, 1761): Thu hái tại Ninh Bình vào ngày 05/08/2019, giám định bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng (Trường Đại học Dược Hà Nội).

2. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất và có bao nhiêu hợp chất mới?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 31 hợp chất tinh khiết, bao gồm:

  • 9 hợp chất từ G. philastrei (GP1–GP9).
  • 18 hợp chất từ G. angkorensis (GA1–GA18).
  • 4 hợp chất từ G. jasminoides (GJ1–GJ4). Trong đó, có 3 hợp chất mới được công bố lần đầu tiên là: Coronalyl acetate (GP1), Angkorenside A (GA2) và Angkorenside B (GA3).

3. Những phương pháp phân tích phổ nào được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất?

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS kết hợp với các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR ($^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT90, DEPT135) và 2D-NMR ($^{1}\text{H}-^{1}\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC), sử dụng chất chuẩn nội TMS và các dung môi đo phổ chuyên dụng ($\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{CDCl}_3$, $\text{DMSO-}d_6$).

4. Các hoạt tính sinh học nào đã được đánh giá trong luận án?

Luận án đã thực hiện 4 phép thử hoạt tính sinh học in vitro gồm:

  • Hoạt tính ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO) trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 kích thích bởi LPS.
  • Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase.
  • Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH.
  • Hoạt tính gây độc tế bào (MTT assay) trên 4 dòng tế bào ung thư người: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú).

5. Nhóm hợp chất hóa học đặc trưng nhất được tìm thấy ở loài Dành dành láng (Gardenia philastrei) là gì?

Nhóm hợp chất đặc trưng nhất phân lập được từ lá Gardenia philastrei là các triterpene thuộc khung cycloartane và 3,4-seco-cycloartane (chiếm 8/9 hợp chất phân lập được, bao gồm hợp chất mới Coronalyl acetate GP1 cùng các hợp chất Coronalolic acid GP2, Sootepin D GP3, Sootepin G GP4, Coronalolide methyl ester GP5, Coronalolide GP6, 23-deoxojessic acid GP7, Quadrangularic acid E GP8).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Khắc Hưng đã hoàn thành việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài Dành dành (Gardenia philastrei, Gardenia angkorensis và Gardenia jasminoides) tại Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 31 hợp chất tinh khiết, trong đó phát hiện 3 hợp chất mới là Coronalyl acetate, Angkorenside A và Angkorenside B. Kết quả đánh giá hoạt tính in vitro đã cung cấp các dữ liệu thực nghiệm về khả năng ức chế sản sinh NO, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase, dập tắt gốc tự do DPPH và gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư người của các hợp chất phân lập được, tạo cơ sở khoa học phục vụ công tác nghiên cứu hóa thực vật và định hướng khai thác nguồn dược liệu tự nhiên.