Giới thiệu dự án

Nhu cầu sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm thay thế hoặc hỗ trợ giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc tân dược đang trở thành xu hướng chủ đạo trong ngành công nghiệp dược phẩm toàn cầu. Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số tại các quốc gia đang phát triển vẫn dựa vào y học cổ truyền và thảo dược tự nhiên trong công tác chăm sóc sức khỏe ban đầu. Việt Nam, với đặc trưng khí hậu nhiệt đới gió mùa, sở hữu thảm thực vật đa dạng với hàng nghìn loài thảo mộc có giá trị trị liệu cao nhưng chưa được khảo sát thấu đáo.

Trong số đó, Trai hoa trần (tên khoa học: Murdannia nudiflora (L.) Brenan, thuộc họ Thài lài - Commelinaceae) là cây thuốc dân gian thường được dùng để chữa ho ra máu, viêm họng, nhọt độc, rắn cắn và giảm đau. Mặc dù các nghiên cứu quốc tế sơ bộ đã ghi nhận chiết xuất từ loài này có khả năng kháng khuẩn, ức chế men gan $ALT/AST$, dọn gốc tự do $DPPH$ ($IC_{50} = 1.51 \times 10^{-10}\ \mu\text{g/mL}$) và độc tính chọn lọc trên dòng tế bào ung thư ruột kết $HCT-116$, tại Việt Nam nguồn dược liệu này hầu như chỉ mọc hoang dã, chưa có tài liệu định danh hình thái vi học chuẩn xác và chưa có công trình phân lập hợp chất tinh khiết nào được công bố.

                    +------------------------------------------------------+
                    |             Murdannia nudiflora (L.) Brenan          |
                    |         (Thu hái tại Thanh Sơn, Phú Thọ - 2.3 kg)    |
                    +------------------------------------------------------+
                                               |
                                               v
                    +------------------------------------------------------+
                    |         Chiết siêu âm (UAE) EtOH 80% (3 x 10L, 40°C) |
                    |              => Cao tổng Ethanol: 190.0 g            |
                    +------------------------------------------------------+
                                               |
                        +----------------------+-----------------------+
                        | Phân bố lỏng - lỏng                          |
                        v                                              v
         +-----------------------------+               +-------------------------------+
         | Phân đoạn n-Hexan (35.1 g)  |               | Phân đoạn Ethyl Acetate (46.2g)|
         +-----------------------------+               +-------------------------------+
                                                                       |
                                                                       v
                                                       +-------------------------------+
                                                       | Sắc ký cột Silica gel         |
                                                       | Gradient n-Hexan:EtOAc /      |
                                                       | CHCl3:MeOH                    |
                                                       +-------------------------------+
                                                                       |
                                               +-----------------------+-----------------------+
                                               |                                               |
                                               v                                               v
                                +-----------------------------+                 +-----------------------------+
                                |  Hợp chất M1 (Axit béo)     |                 |  Hợp chất M2 (Dẫn xuất      |
                                |  Axit tricosanoic           |                 |  Indole-3-carboxylat)       |
                                |  (C23H46O2, Rf = 0.36)      |                 |  (C11H11NO3, Rf = 0.42)     |
                                +-----------------------------+                 +-----------------------------+

Mục tiêu dự án

  1. Khảo sát toàn diện đặc điểm thực vật học: Mô tả chi tiết hình thái cơ quan sinh dưỡng, cơ quan sinh sản và thiết lập bộ tiêu bản giải phẫu vi phẫu thân, vi phẫu lá và đặc điểm bột dược liệu của loài Murdannia nudiflora.
  2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phân đoạn: Xây dựng quy trình chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm (UAE) và phân tách làm giàu hoạt chất bằng chiết phân bố lỏng - lỏng.
  3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học: Ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột pha thuận/pha đảo kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, $\text{DEPT}$, $\text{HSQC}$, $\text{HMBC}$, $\text{NOESY}$) để phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc các đơn chất sạch từ phân đoạn Ethyl Acetate.

Phạm vi và giới hạn

  • Mẫu nghiên cứu: Toàn cây Trai hoa trần tươi thu hái tại thị trấn Thanh Sơn, huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ (tháng 12/2021), được giám định chính danh tại Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN (Mã tiêu bản: UMP-212021).
  • Giới hạn kỹ thuật: Tập trung phân tích chuyên sâu phân đoạn Ethyl Acetate; các phân đoạn $n$-hexan và dịch nước còn lại được bảo lưu cho các định hướng thử nghiệm tiếp theo.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trước nghiên cứu này, các công bố quốc tế về Murdannia nudiflora đa phần dừng lại ở mức khảo sát hỗn hợp dịch chiết thô qua phân tích sắc ký khí ghép khối phổ ($\text{GC-MS}$) mà chưa tiến hành quy trình phân lập đơn chất tinh khiết có kèm định danh quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D hoàn chỉnh.

Tiêu chí phân tích Phương pháp ngâm chiết cổ điển Phương pháp GC-MS thô (Quốc tế) Giải pháp đề tài áp dụng
Kỹ thuật chiết Ngâm lạnh / Hồi lưu nhiệt độ cao Ngâm chiết dung môi hữu cơ Chiết hỗ trợ siêu âm ($\text{UAE}$, 40°C, 30 min)
Mức độ bảo toàn hoạt chất Dễ phân hủy nhiệt hoạt chất nhạy cảm Trung bình Tối đa, hạn chế suy thoái nhiệt
Độ phân giải cấu trúc Không phân lập được chất sạch Chỉ phát hiện các hợp chất dễ bay hơi Phân lập chất sạch + 1D/2D-NMR đa chiều
Tiêu chuẩn kiểm nghiệm Thiếu dữ liệu vi học chi tiết Không xây dựng dữ liệu thực vật học Chuẩn hóa giải phẫu vi phẫu và bột dược liệu

Ma trận yêu cầu nghiên cứu (MoSCoW)

  • Must have: Định danh hình thái thực vật chuẩn xác; thiết lập bản đồ vi phẫu nhuộm kép thân - lá; chiết xuất thu hồi cao phân đoạn Ethyl Acetate; phân lập thành công tối thiểu 02 hợp chất sạch và giải mã cấu trúc bằng NMR.
  • Should have: Tối ưu hóa dung môi chiết xuất thân thiện ($\text{EtOH 80%}$); đo đạc các hằng số ghép spin-spin ($J$) và tương tác không gian $\text{NOESY}$.
  • Could have: Đánh giá sàng lọc sơ bộ hàm lượng vết của các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp qua thuốc thử đặc hiệu.
  • Won't have (trong giai đoạn này): Thử nghiệm hoạt tính sinh học in vivo trên mô hình động vật đối với từng đơn chất sau phân lập.

Thiết kế hệ thống phân tích và trang thiết bị

                                [Mẫu dược liệu khô: 2.3 kg]
                                             |
                                             v
                           +-----------------------------------+
                           |  Chiết siêu âm EtOH 80% (30 min)  |
                           |  Thiết bị: Bể rửa siêu âm gia nhiệt|
                           +-----------------------------------+
                                             |
                                             v
                           +-----------------------------------+
                           | Cô quay chân không (Áp suất giảm) |
                           | => Thu 190 g Cao cồn toàn phần    |
                           +-----------------------------------+
                                             |
                 +---------------------------+---------------------------+
                 |                                                       |
                 v                                                       v
   [Kiểm tra định tính & Vi phẫu]                          [Phân lập sắc ký cột]
   - Nhuộm kép: Xanh methylen / Đỏ carmin                  - Pha tĩnh: Silica gel 60 (Merck)
   - Kính hiển vi quang học gắn camera kỹ thuật số        - Cỡ hạt: 0.040 - 0.063 mm & 0.063 - 0.200 mm
   - Đo kích thước vi phẫu & tinh thể canxi oxalat         - Sắc ký lớp mỏng: TLC Kieselgel 60 F254
                                                                         |
                                                                         v
                                                           [Phân tích phổ cấu trúc]
                                                           - Máy quang phổ Bruker AVANCE AV 500
                                                           - 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz)
                                                           - Phổ tương tác DEPT, HSQC, HMBC, NOESY

Thông số thiết bị và hóa chất chuẩn

  • Thiết bị quang phổ NMR: Hệ thống Bruker AVANCE AV 500 (Bruker, CHLB Đức) hoạt động ở tần số $500\ \text{MHz}$ cho proton ($^1\text{H}$) và $125\ \text{MHz}$ cho carbon ($^{13}\text{C}$), chuẩn nội Tetramethylsilane ($\text{TMS}$).
  • Chất hấp phụ sắc ký: Silica gel pha thường cỡ hạt $0.063 - 0.200\ \text{mm}$ ($70 - 230\ \text{mesh}$) và $0.040 - 0.063\ \text{mm}$ ($230 - 400\ \text{mesh}$) từ hãng Merck; Bản mỏng nhôm tráng sẵn Kieselgel $60\ \text{F}{254}$ và pha đảo $\text{RP-18}\ \text{F}{254}$ (độ dày $0.20 - 0.25\ \text{mm}$).
  • Hóa chất giải phẫu: Cloramin $15%$, Cloral hydrat, Axit axetic $1%$, Xanh methylen, Đỏ carmin.

Implementation và kết quả

Quy trình chiết xuất và phân tách sắc ký

+------------------------------------------------------------------------------------+
| 2.3 kg bột dược liệu khô                                                           |
| ---> Chiết EtOH 80% (3 lần x 10 L, chiết siêu âm 40°C, 30 phút/lần)                |
| ---> Gộp dịch chiết, cô quay áp suất giảm ---> Thu được 190.0 g Cao tổng           |
+------------------------------------------------------------------------------------+
       |
       |--> Lấy 120.0 g Cao tổng hòa trong 800 mL H2O cất
       |--> Chiết phân bố lỏng - lỏng với n-Hexan (3 lần x 800 mL) ---> Cao n-Hexan: 35.1 g
       |--> Chiết phân bố tiếp với Ethyl Acetate (3 lần x 800 mL) ---> Cao EtOAc: 46.2 g
              |
              +--> Lấy 40.0 g phân đoạn EtOAc đưa lên Cột Silica gel (Φ85 x 90 mm)
                   | Hệ dung môi: n-Hexan : EtOAc (5:1 -> 1:1) rồi CHCl3 : MeOH (10:1 -> 1:1)
                   | Thu được 4 phân đoạn chính: B1, B2 (10.2 g), B3, B4
                          |
                          +--> Phân đoạn B2 (10.2 g) chạy cột Silica gel (Φ45 x 350 mm)
                               | Pha động: CHCl3 : MeOH (8:1 -> 5:1 -> 3:1, v/v)
                               +---> Phân lập Hợp chất M1 (Axit tricosanoic)
                               +---> Phân lập Hợp chất M2 (6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat)

Đặc điểm thực vật học và tiêu bản giải phẫu

  1. Hình thái cơ quan sinh dưỡng: Thân thảo mọc bò lan tỏa, mọng nước, nhẵn bóng. Lá đơn mọc so le, phiến lá hình mác hoặc elip thuôn ($1.2 - 2.0\ \text{cm} \times 4.0 - 10.0\ \text{cm}$), gân lá song song, bẹ lá dài $0.6 - 1.2\ \text{cm}$ phủ lông dày ráp ở mép ngoài.
  2. Hình thái cơ quan sinh sản: Cụm hoa mọc nách lá, cuống dài $5 - 8\ \text{cm}$. Hoa lưỡng tính mang 3 cánh màu tím nhạt ($5 - 7\ \text{mm} \times 4 - 5\ \text{mm}$), 3 lá đài hình thuyền. Bộ nhị gồm 6 nhị: 3 nhị hữu thụ có chỉ nhị mang chùm lông tím dài và 3 nhị thoái hóa bất thụ có bao phấn 3 thùy. Quả nang 3 ô ($2.0 \times 3.5\ \text{mm}$).
  3. Vi phẫu thân: Tiết diện tròn, phần vỏ chiếm $1/6$ diện tích. Biểu bì có tầng cutin dày mang lông che chở đa bào ngắn. Nội bì có vách dày hình chữ U bắt màu xanh đậm. Trụ bì gồm $1 - 2$ lớp tế bào hóa mô cứng. Bó libe-gỗ xếp theo hình chữ V phân bố rải rác trong mô mềm ruột.
  4. Vi phẫu lá: Cấu tạo đối xứng hai bên, gân giữa lõm ở mặt trên. Mô nâng đỡ gồm 1 lớp tế bào sát biểu bì. Bó libe-gỗ nằm chính giữa. Mô mềm chứa nhiều tinh thể canxi oxalat hình que và mảnh mạch xoắn.
  5. Bột dược liệu: Bột màu xanh nhạt, đặc trưng bởi lông che chở đa bào sợi ($120 - 200\ \mu\text{m}$), hạt tinh bột đơn/kép có rốn hình chữ Y ($3 - 6\ \mu\text{m}$), tinh thể canxi oxalat hình que dạng bó ($80 - 120\ \mu\text{m}$) và mảnh mạch xoắn đường kính $\approx 40\ \mu\text{m}$.
      +-----------------------------------------------------------------+
      |                 BẢN ĐỒ VI PHẪU THÂN VÀ LÁ                       |
      |                                                                 |
      |   [Lớp Biểu bì ngoài + Lông che chở đa bào (120-200 µm)]        |
      |   [Mô dày / Mô nâng đỡ (1-2 lớp tế bào vách dày)]               |
      |   [Nội bì đai Caspary / Vách chữ U bắt màu xanh]                |
      |   [Hệ thống bó dẫn Libe - Gỗ hình chữ V phân tán]               |
      |   [Mô mềm chứa Tinh thể Canxi Oxalat + Mảnh mạch xoắn (40 µm)]  |
      +-----------------------------------------------------------------+

Kết quả nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học

Hợp chất M1: Axit tricosanoic

  • Tính chất cảm quan: Bột vô định hình màu trắng, giá trị sắc ký lớp mỏng $R_f = 0.36$ (hệ dung môi $n\text{-hexan} : \text{EtOAc} = 4:1\ \text{v/v}$), hiện màu tím khi phun thuốc thử Vanilin/$\text{H}_2\text{SO}_4\ 1%$.
  • Phân tích phổ NMR:
    • $^1\text{H-NMR}\ (500\ \text{MHz}, \text{CDCl}_3)$: Tín hiệu proton methyl cuối mạch tại $\delta_H\ 0.88\ (3\text{H}, t, J = 7.0\ \text{Hz}, \text{H-23})$; cụm proton methylen chuỗi dài tại $\delta_H\ 1.26\ (38\text{H}, \text{br s}, \text{H-4}\rightarrow\text{H-22})$; proton $\beta$-methylen tại $\delta_H\ 1.63\ (2\text{H}, \text{quintet}, J = 7.5\ \text{Hz}, \text{H-3})$; proton $\alpha$-methylen kề nhóm carboxyl tại $\delta_H\ 2.34\ (2\text{H}, t, J = 7.5\ \text{Hz}, \text{H-2})$.
    • $^{13}\text{C-NMR}\ (125\ \text{MHz}, \text{CDCl}_3)$: Tín hiệu cacbon carbonyl nhóm carboxyl tại $\delta_C\ 178.4\ (\text{C-1})$; nhóm $-\text{CH}_2-$ tại $\delta_C\ 33.9\ (\text{C-2})$, $\delta_C\ 31.9\ (\text{C-3})$, $\delta_C\ 22.8 - 30.9\ (\text{C-4}\rightarrow\text{C-22})$; cacbon nhóm $-\text{CH}_3$ tại $\delta_C\ 14.1\ (\text{C-23})$.
    • Công thức phân tử: $\text{C}{23}\text{H}{46}\text{O}_2$ ($M = 354.61\ \text{g/mol}$).
Vị trí Carbon $\delta_C$ (M1, ppm) $\delta_H$ (M1, ppm, $J$ tính bằng Hz) $\delta_C$ (Tham khảo [34]) $\delta_H$ (Tham khảo [34])
C-1 178.4 - 180.17 -
C-2 33.9 2.34 ($2\text{H}, t, J = 7.5\ \text{Hz}$) 34.14 2.34 ($2\text{H}, J = 6.0\ \text{Hz}$)
C-3 31.9 1.63 ($2\text{H}, \text{quintet}, J = 7.5\ \text{Hz}$) 31.98 1.61 ($2\text{H}, J = 6.0\ \text{Hz}$)
C-4 $\rightarrow$ C-22 22.8 – 30.9 1.26 ($38\text{H}, \text{br s}$) 22.73 – 29.74 1.25 ($38\text{H}, s$)
C-23 14.1 0.88 ($3\text{H}, t, J = 7.0\ \text{Hz}$) 14.30 0.88 ($3\text{H}, J = 6.0\ \text{Hz}$)
                       O
                      //
    CH3-(CH2)20-CH2-C
                     \
                      OH
        [Cấu trúc Hóa học Hợp chất M1: Axit tricosanoic]

Hợp chất M2: 6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat

  • Tính chất cảm quan: Bột vô định hình màu trắng, phản ứng dương tính với thuốc thử nhận biết khung indole.
  • Phân tích phổ NMR & Phổ tương tác dị hạt nhân 2D:
    • $^1\text{H-NMR}\ (500\ \text{MHz}, \text{CDCl}_3)$: Tín hiệu proton liên kết dị vòng indole tại $\delta_H\ 7.78\ (1\text{H}, d, J = 2.5\ \text{Hz}, \text{H-2})$; nhóm $-\text{NH}-$ cộng hưởng tại $\delta_H\ 8.73\ (1\text{H}, \text{br s})$; proton thơm $\text{H-4}$ tại $\delta_H\ 8.04\ (1\text{H}, d, J = 8.5\ \text{Hz})$; proton $\text{H-5}$ tại $\delta_H\ 6.92\ (1\text{H}, dd, J = 2.5, 8.5\ \text{Hz})$; proton $\text{H-7}$ tại $\delta_H\ 6.85\ (1\text{H}, d, J = 2.5\ \text{Hz})$; proton nhóm $6-\text{OCH}_3$ tại $\delta_H\ 3.82\ (3\text{H}, s)$; proton nhóm ester $-\text{COOCH}_3$ tại $\delta_H\ 3.91\ (3\text{H}, s)$.
    • Xác nhận cấu hình qua phổ NOESY: Tương tác chéo rõ nét giữa $\text{H-2}$ ($\delta_H\ 7.78$) với $-\text{NH}-$ ($\delta_H\ 8.73$); $-\text{NH}-$ với $\text{H-7}$ ($\delta_H\ 6.85$); $\text{H-7}$ với nhóm thế $6-\text{OCH}_3$ ($\delta_H\ 3.82$); $6-\text{OCH}_3$ với $\text{H-5}$ ($\delta_H\ 6.92$); và tương tác ortho giữa $\text{H-5}$ với $\text{H-4}$ ($J = 8.5\ \text{Hz}$).
    • Tương tác HMBC: Proton $\text{H-2}$ và proton ester methyl ($\delta_H\ 3.91$) cùng cho tương tác dị hạt nhân tầm xa với cacbon carbonyl ester tại $\delta_C\ 165.5\ (\text{C-1})$, xác thực nhóm thế ester gắn tại vị trí $\text{C-3}$.
    • Công thức phân tử: $\text{C}{11}\text{H}{11}\text{NO}_3$ ($M = 205.21\ \text{g/mol}$).
Vị trí Carbon $\delta_C$ (M2, ppm) $\delta_H$ (M2, ppm, $J$ tính bằng Hz) $\delta_C$ (Tham khảo [49]) $\delta_H$ (Tham khảo [49])
C-1 165.5 - 165.7 -
C-2 131.0 7.78 ($1\text{H}, d, J = 2.5\ \text{Hz}$) 130.6 7.79 ($1\text{H}, d, J = 3.0\ \text{Hz}$)
C-3 108.5 - 108.7 -
C-4 121.9 8.04 ($1\text{H}, d, J = 8.5\ \text{Hz}$) 122.2 8.02 ($1\text{H}, d, J = 8.4\ \text{Hz}$)
C-5 111.4 6.92 ($1\text{H}, dd, J = 2.5, 8.5\ \text{Hz}$) 111.4 6.93 ($1\text{H}, dd, J = 2.4, 8.4\ \text{Hz}$)
C-6 156.8 - 157.0 -
C-7 95.2 6.85 ($1\text{H}, d, J = 2.5\ \text{Hz}$) 95.1 6.84 ($1\text{H}, d, J = 2.4\ \text{Hz}$)
C-8 137.4 - 137.2 -
C-9 120.3 - 120.4 -
6-OCH$_3$ 55.6 3.82 ($3\text{H}, s$) 55.6 3.84 ($3\text{H}, s$)
-COOCH$_3$ 50.9 3.91 ($3\text{H}, s$) 50.9 3.90 ($3\text{H}, s$)
                     H3C-O-C=O
                           |
                        //--- C
                       /     ||
             H3C-O -- C      CH
                     ||      |
                     HC     / \
                       \   /   NH
                         C
        [Cấu trúc Hóa học Hợp chất M2: 6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat]

Đổi mới và đóng góp

  1. Lần đầu tiên phân lập đơn chất sạch từ loài Trai hoa trần tại Việt Nam: Nghiên cứu là công trình tiên phong tại Việt Nam chiết xuất, tinh sạch và định danh hoàn chỉnh bằng phổ 1D/2D-NMR 2 hợp chất tinh khiết: Axit tricosanoic ($\text{C}{23}\text{H}{46}\text{O}2$) và 6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat ($\text{C}{11}\text{H}_{11}\text{NO}_3$) từ lá và toàn cây Murdannia nudiflora.
  2. Đóng góp dữ liệu tiêu chuẩn hóa cho Dược điển: Bộ ảnh giải phẫu vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột dược liệu với kích thước chi tiết (lông che chở $120 - 200\ \mu\text{m}$, bó canxi oxalat $80 - 120\ \mu\text{m}$, hạt tinh bột $3 - 6\ \mu\text{m}$) cung cấp cơ sở khoa học trực tiếp phục vụ xây dựng chuyên luận kiểm nghiệm dược liệu Murdannia nudiflora cho Dược điển Việt Nam.
  3. Mở rộng hiểu biết về phân bố hóa thực vật: Hợp chất M2 (dẫn xuất khung Indole thế) trước đây chỉ được biết đến qua con đường tổng hợp hóa học hoặc tìm thấy trong chi Artemisia (loài Thanh cao Bắc Bộ). Việc phát hiện M2 trong họ Commelinaceae là bằng chứng hóa phân loại (chemotaxonomy) quan trọng.
Chỉ số khoa học Nghiên cứu Kuppusamy (2015) [31] Nghiên cứu Muhammad (2018) [45] Kết quả Khóa luận (2022)
Phương pháp chính Phân tích GC-MS dịch thô Phân tích GC-MS các phân đoạn Sắc ký cột + 1D/2D-NMR đa chiều
Phân lập chất sạch Không thực hiện Không thực hiện Thành công phân lập M1 và M2
Độ tinh khiết phân tích Hỗn hợp vết Hỗn hợp vết Đơn chất tinh khiết phân tích
Dữ liệu chuẩn hóa vi phẫu Không có Không có Đầy đủ vi phẫu thân, lá, bột

Ứng dụng thực tế và triển khai

+--------------------------------------------------------------------------+
|                 LỘ TRÌNH ỨNG DỤNG VÀ THƯƠNG MẠI HÓA                      |
+--------------------------------------------------------------------------+
  |
  +---> Giai đoạn 1 (0 - 6 tháng): 
  |     Thiết lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở và hồ sơ chuyên luận Dược điển
  |
  +---> Giai đoạn 2 (6 - 18 tháng): 
  |     Chiết xuất Pilot quy mô 50 - 100 kg; sản xuất Cao định chuẩn M1 & M2
  |
  +---> Giai đoạn 3 (18 - 36 tháng): 
        Phát triển chế phẩm Thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ hạ men gan & kháng viêm
  • Phát triển cao dược liệu định chuẩn: Dẫn xuất Axit tricosanoic và Indole-3-carboxylat có thể dùng làm chất đánh dấu hóa học (chemical markers) để chuẩn hóa hàm lượng trong quy trình sản xuất cao thuốc điều trị viêm loét, hạ men gan và chống oxy hóa.
  • Nguyên liệu đối chiếu phân tích: Axit tricosanoic phân lập đạt độ tinh khiết cao có khả năng ứng dụng làm chất chuẩn nội/chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm định lượng các axit béo chưa bão hòa quan trọng như $EPA$ và $DHA$ trên hệ thống sắc ký khí $\text{GC-FID/MS}$.
  • Tiềm năng phát triển thuốc chống khối u: Khung 6-methoxy-indole là cấu trúc tiềm năng trong hóa dược để bán tổng hợp các phân tử ức chế kinase đích định hướng ngăn chặn sự nhân lên của tế bào ung thư đại trực tràng ($HCT-116$).

Hạn chế và hướng phát triển

  • Hạn chế tồn tại:
    • Nguồn mẫu nghiên cứu mới được thu thập tại một địa điểm duy nhất (Thanh Sơn, Phú Thọ) vào một thời điểm trong năm (tháng 12), chưa đánh giá được biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ sinh trưởng và thổ nhưỡng.
    • Chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp in vitro trên 2 chất tinh khiết M1 và M2 sau phân lập do giới hạn khối lượng mẫu.
  • Hướng phát triển đề xuất:
    • Mở rộng khảo sát sàng lọc thành phần hóa học trên các phân đoạn còn lại ($n$-hexan và pha nước dư) nhằm tìm kiếm các dẫn xuất Flavonoid và Saponin đặc trưng.
    • Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm (ức chế $TNF-\alpha$, $IL-6$) và hoạt tính kháng khuẩn ($MIC$) của dẫn xuất 6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat trên các chủng vi khuẩn kháng thuốc như Staphylococcus aureusPseudomonas aeruginosa.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên & Học viên chuyên ngành Dược/Hóa học sinh tự nhiên: Tiếp cận phương pháp luận mẫu mực về kết hợp nghiên cứu hình thái vi học dược liệu với quy trình chiết tách sắc ký cột và kỹ thuật giải phổ NMR hiện đại.
  • Nhà nghiên cứu Dược liệu học & Hóa thực vật: Nhận được bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chính xác của các hợp chất trong chi Murdannia phục vụ tra cứu phân loại và đối chiếu hóa thực vật.
  • Doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm & Thực phẩm chức năng: Sở hữu quy trình chiết xuất giàu hoạt chất bằng cồn thực phẩm ($\text{EtOH 80%}$) an toàn, dễ mở rộng quy mô pilot và có căn cứ khoa học để định danh nguồn dược liệu thu mua.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật chiết siêu âm (UAE) mang lại ưu thế gì so với ngâm chiết nhiệt cổ điển?

Kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm sử dụng hiệu ứng tạo hốc (cavitation effect) làm vỡ nhanh vách tế bào thực vật, giúp dung môi $\text{EtOH 80%}$ xâm nhập sâu vào mô dược liệu chỉ trong $30\ \text{phút}$ ở nhiệt độ thấp ($40^\circ\text{C}$), từ đó bảo toàn tối đa các hợp chất kém bền nhiệt, rút ngắn $80%$ thời gian chiết và tiết kiệm dung môi hữu cơ.

2. Làm thế nào để phân biệt chính xác cây Trai hoa trần với các loài khác trong chi Murdannia?

Murdannia nudiflora được phân biệt dựa trên tổ hợp các đặc điểm hình thái giải phẫu: tràng hoa rời màu tím nhạt, 3 nhị hữu thụ mang chùm lông màu tím ở gốc chỉ nhị kết hợp 3 nhị bất thụ ba thùy; vi phẫu thân có bó libe-gỗ hình chữ V phân tán và bột dược liệu chứa các bó tinh thể canxi oxalat hình que ($80 - 120\ \mu\text{m}$) cùng lông che chở đa bào sợi ($120 - 200\ \mu\text{m}$).

3. Ý nghĩa của phổ tương tác NOESY trong việc xác định cấu trúc hợp chất M2?

Phổ $\text{NOESY}$ ghi nhận các tương tác không gian qua khoảng cách ($< 5\text{ \AA}$). Tín hiệu chéo giữa proton $-\text{NH}-$ ($\delta_H\ 8.73$) với $\text{H-7}$ ($\delta_H\ 6.85$), giữa $\text{H-7}$ với proton nhóm methoxy $6-\text{OCH}_3$ ($\delta_H\ 3.82$) và giữa $6-\text{OCH}_3$ với $\text{H-5}$ ($\delta_H\ 6.92$) là bằng chứng cấu trúc quyết định khẳng định nhóm metoxy định vị chính xác tại carbon số 6 của vòng thơm indole.

4. Axit tricosanoic có giá trị ứng dụng thực tiễn như thế nào trong y dược?

Axit tricosanoic ($\text{C}{23}\text{H}{46}\text{O}_2$) là một axit béo mạch rất dài ($23\text{C}$) có hoạt tính ức chế sự ly giải hồng cầu do độc tố $\delta$-toxin của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus gây ra theo cơ chế phụ thuộc liều lượng, đồng thời được ứng dụng làm chất chuẩn đối chiếu tinh khiết để định lượng các axit béo thiết yếu trong dược phẩm.

5. Dự án đã xử lý khó khăn gì khi phân lập các hợp chất có độ phân cực gần nhau trong phân đoạn EtOAc?

Nhóm nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột silica gel đa bước với hệ dung môi gradient phân cực tăng dần kết hợp giữa $n\text{-hexan} : \text{EtOAc}$ ($5:1 \rightarrow 1:1$) và $\text{CHCl}3 : \text{MeOH}$ ($8:1 \rightarrow 3:1$), liên tục kiểm soát độ tinh khiết phân đoạn bằng bản mỏng pha thường $\text{F}{254}$ và pha đảo $\text{RP-18}$ dưới đèn tử ngoại ($254/365\ \text{nm}$) và thuốc thử đặc hiệu trước khi kết tinh phân lập chất sạch.


Kết luận

Đề tài khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và chiết xuất phân lập một số hợp chất từ cây Trai hoa trần [Murdannia nudiflora (L.) Brenan]" đã hoàn thành xuất sắc toàn bộ các mục tiêu khoa học đề ra. Công trình không chỉ cung cấp bản mô tả hình thái và tiêu bản giải phẫu vi học hoàn chỉnh phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu trong nước, mà còn đóng góp dữ liệu hóa học quan trọng khi lần đầu tiên phân lập và chứng minh cấu trúc thành công 02 hợp chất sạch: Axit tricosanoic6-Metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat. Kết quả này đặt nền móng vững chắc cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo về bào chế cao định chuẩn và thử nghiệm hoạt tính dược lý phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.